专利名称：一种抗肿瘤dna疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体涉及一种医ffl配制品，特别是用于基因治疗的医用配制品。
背景技术：
恶性肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的疾病，据不完全统计，我国每年死于肿瘤的患者约130 万人，全世界每年约700力—人被肿瘤夺去了生命。手术、放疗、化疗仅能治愈45。/。左右的肿瘤，55%的肿 瘤病人冈晚期或高度恶性而无法治愈。肿瘤的预防和治疗已成为全球的医药工作者的重要使命，各国都投 入了大量的人力和物力。
肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗的一种重要手段，已成为抗肿瘤研究的热点之一。肿瘤疫苗是通过接种引起 细胞免疫和体液免疫反应，激发人体自身的天然抗肿瘤反应，达到防治肿瘤的目的。
目前，研究较多的肿瘤疫苗冇全细胞疫苗、核酸疫苗、抗原疫苗和以树突状细胞为基础的疫苗等，其 中核酸疫苗(亦称为DNA疫苗成基闪疫苗)是近IO年发展起来的一种新荆疫苗。DNA疫苗通常是单质 粒DNA表达载体，载体中一般含有0的基M的编码序列、真核启动子、聚腺苷酸化序列、抗生素抗性基 因和复制起止点。真核启动子和聚腺苷酸化序列是目的抗原在哺乳动物细胞中表达所需的，抗生素抗性基 因和复制起.l卜.点能使载体在细菌中复制；当在肌肉或皮下接种裸DNA质粒后，宿主细胞摄取DNA，产生 抗原以诱导免疫应答，诱导抗原特异性CD4+辅助性T细胞、CD8+CTL和抗体的产生。在肿瘤的免疫治 疗中，DNA疫苗具有以下优点(j)任何肿瘤相关抗原都很容易处理成质粒DNA的形式进行免疫治疗； (2)与全长蛋白或重组病毒相比，DNA容易大量生产；(3)质粒DNA的接种不会引起非相关蛋白的表 达，能反复接种；(4)与病毒载体相比，到目前为止DNA疫苗在临床试验中表现出良好的安全性；(5) 靶向未突变的肿瘤相关分化抗原的DNA疫苗能用于较大范围的病人；(6) DNA疫苗的CPG基序可以激 活天然免疫系统来控制肿瘤细胞的生长。以往研究的DNA疫苗所含的目的基因大多为单独抗原的编码序 列，所引起的特异性免疫应答-一般只对有该抗原表位的肿瘤细胞有效，但是肿瘤抗原和肿瘤细胞呈多态性 及个体特异性，査明每一个患者的抗原表位是不可能的，即使使用明确的一种或几种肿瘤抗原以及肿瘤相 关抗原免疫治疗肿瘤，也不可能杀伤肿瘤组织内所有肿瘤细胞。
S杀基因是来自某些病毒或细菌的基冈，可编码特定的酶，正常哺乳动物细胞缺乏这种基因，如果将 其导入靶细胞中，可使无毒性的前体药物转化为细胞毒性代谢产物千扰DNA合成，从而导致靶细胞:死亡。 不少研究表明，只要少量的Q杀基闪转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定比例混合后共同培养，不仅转 染的癌细胞被杀死，—者相互接触后相邻的未转染的癌细胞也大量死亡，即"旁观者效应"。将自杀基因 引入肿瘤疫苗的报道较少，Ren等以复制缺陷腺病毒携带人热休克蛋白70基因和自杀基因HSV-tk共表达 质粒制成肿瘤疫苗，该疫苗中所含的人热休克蛋白70基因和fl杀基因HSV-tk共表込质粒，实验证明该疫
3苗对鼠肿瘤产生了明显的抑制作用(Wenhong Ren， Randy Strube， Xiaoqing Zhang, etal.Potent Tumor-Specific Immunity Induced by an In vivo Heat Shock Protein-Suicide Gene—Based Tumor Vaccine[J〗CANCER RESEARCH, 2004 ,(15)64,:6645~6651)，但是该疫苗存在以下两个缺点(l)采用病毒为载体，在机体内 复制率虽高，但靶向性不高，且难以清除，安全隐患较大；(2)质粒中采用的人热休克蛋白70基因，对 于应用到人体抗肿瘤时免疫源性较弱，易产生免疫耐受。
发明内容
本发明要解决的技术问题是DNA疫苗免疫原性不强及对肿瘤靶向性不强。 本发明解决上述技术问题的技术方案是
一种抗肿瘤DNA疫苗，该疫苗由人体益生的兼性厌氧细瞎、人体益生的厌氧细菌、减毒的兼性厌氧 细菌或减毒的专性需氧菌携带pCMV-mt Hsp70-1RES-自杀基因构成；所述的pCMV-mt Hsp70-IRES-自杀基 因是以pCMV质粒为表达载体，以结核杆菌热休克蛋白70 (英文名称的缩写为mtHsp70)基因和自杀基 H为抗原基因构成的重组质粒，其中所述的结核杆菌热休克蛋白70基因和自杀基因分别位于pCMV质粒 中的内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site, IRES)的上游和下游。图1为本发明pCMV-mt Hsp70-HIES- 0杀基闪的结构简图。
本发明所述的人体益生的兼性厌氧细菌是乳酸杆菌，人体益生的厌氧细菌是双歧杆菌属的各种细菌， 所述的兼性厌氧细菌是沙门氏菌，所述的专性需氧齒是结核分支杆菌属的各种细菌。
本发明所述C]杀基因是单纯疱疹病毒I型胸苷激,(HSV-tk)基冈，还可以用胞嘧啶脱氨酶基闪(CD) 基因等Q杀基因代替，同样也可以达到本发明的效果。
本发明所述疫坦的制备方法由以下步骤组成
(1) 从含有结核杆菌热休克蛋白70的质粒成DNA中通过PCR扩增出结核杆菌热休克蛋白70基H的 cDNA;从含有自杀基闪的质粒或DNA中通过PCR扩增出自杀基因的cDNA;
(2) 先用自杀基因的cDNA置换pCMV-ires-EGFP质粒(可从市场上购买获得，如BD公司)中位于 内部核糖体进入位点下游的EGFP基因，得到pCMV-ires-自杀基闳，然后mtHsp70cDNA连接到pCMV-ires-白杀基因中的内部核糖体进入位点上游，得到pCMV-mt Hsp7(MRES-fl杀基因；
(3) 通过电穿孔方法将所得pCMV-mtHsp70-lRES-tl杀基因转化到人体益生的兼性厌氧细菌、人体 益生的厌氧细菌、减毐的兼性厌氧细菌或减毒的专性需氧菌中，即得本发明疫苗。
本发明所述DNA疫苗用于治疗实体瘤，可通过局部注射给药。在注射本发明疫苗后，通过细菌侵袭 肿瘤细胞并在肿瘤细胞内同时同水平且独立地表达mtHsp70和0杀基因；给予自杀基因的前体药物后，前 体药物启动自杀基H对肿瘤细胞的杀伤作用及旁观者杀瘤作用，杀死肿瘤细胞;死亡的肿瘤细胞与mtHsp70 形成mtHsp70肽复合物，该复合物带有全肿瘤细胞抗原的指纹，引起免疫杀瘤效应。本发明疫苗的优点体 现在以下两个方面(1)本发明所选的mtH邻70为异种Hsp70，其免疫源性显著高于人自身的Hsp70，能极大地提高整 个DNA疫苗的免疫原性，引起强烈的细胞免疫和体液免疫反应，解决了目前存在的因DNA疫苗免疫原性 不强形成的免疫耐受的问题。有研究表明在结核杆菌的Hsp70中发现大量的B细胞和T细胞表位，学者们 认为其原闲是在人出生后机体就对肠道和皮肤正常菌群的Hsp产生了记忆性免疫反应，这种Hsp特异性的 免疫记忆形成了第'道针对微生物入侵的免疫屏障，也是结核杆菌的Hsp70能产生强烈免疫反应的重要原 因之一 (Gaston JS ，Heat shock protein as potential targets in the therapy of inflammatory arthritis[J]， Biotherapy， 1998,10(3): 197-203 )。
(2)本发明选择能在肿瘤细胞中繁殖且具有侵袭性的细菌作为进攻肿瘤细胞的载体，使得本发明DNA 疫苗与裸DNA疫苗相比具有更强的靶向性，与以病毒为载体的DNA疫苗相比具有更高的安全性。例如， 减毒沙门氏菌对肿瘤细胞具有佼袭性，在肿瘤细胞内有限复制且对实体瘤具有高度的耙向性(Cunningham C， Nemunaitis J, A phase I trial of genetically modified salmoneulla typhimurium expressing cytosine deaminase (TAPET-CD ,VNP20029) administered by intratumoral injection in combination with 5-fluorocytosine for patients with advanced or metastatic cancer[J], Hum Gene Ther 2001,12(12):1594-1596).并可作为真核表达载体传递基闪，使其内的抗原基闪在肿瘤细胞中 表达。
为了更好地理解本发明，卜面将通过效果实验和实施例进一步阐述本发明疫苗。 一、体外实验 〔一)实验材料
pCMV-lRES-EGFP:购t] BD公司。 pCMV-mt Hsp"70-IRES-tk:按实施例1方法制备。
pCMV-mtHsp70-IRES-EGFP:将mtHsp70插入到pCMV-IRES-EGFP中的IRES上游即可。 pCMV-汰-IRES-EGFP:将HSV- tk插入到pCMV-IRES-EGFP中的IRES上游即可。 本发明疫苗按实施例1方法制备。
各对照组疫苗分别将pCMV-mtHsp70-lRES-EGFP、 pCMV- tk -IRES-EGFP和pCMV-IRES-EGFP通 过电穿孔方法转化到减毒沙l' J氏齒中，获得mtHsp70对照疫苗、HSV- tk对照疫苗和空载体对照菌。 肿瘤细胞B16细胞
HSV-TK前体药物更昔洛韦(GCV，罗氏)。 (二)实验方法
1 、本发明pCMV-mt Hsp70-IRES-tk在B16细胞中的表达情况及其对B16细胞的杀伤效果 将pCMV-mt Hsp70-IRES-tk经LIPOFECTAMINE2000脂质体处理后转染到B16细胞中，通过westblot 检测蛋白质的表达情况；将转染后的细胞分为4组，分别同时加入浓度为0、 10、 30和50的GCV处理，
572小时后，通过MTT法检测并计算各组细胞的存活率。pCMV-mtHsp70-lRES-EGFP、pCMV- tk -IRES-EGFP 和pCMV-IRES-EGFP均同上实验。
2、本发明疫苗对B16细胞的靶向性
将B16细胞丁-96孔板内培养至对数生长期，分别按1 : 50 (疫苗细胞)加入本发明疫苗或对照组 疫苗，于24小时、36小时和72小时荧光显微镜下观察各组报告基闪EGFP的表达，并观察细胞的生存状 态及电镜观察重组菌对B16的侵袭力。 (二)实验结果
1 、本发明pCMV-mt Hsp70-IRES-tk在B16细胞中的表达情况如图2和图3所示， pCMV-mtHsp70-IRES-TK和pCMV-mtHsp70-lRES-EGFP在B16细胞中均能表达mtHsp70， pCMV-mtHsp70-IRES-TK和pCMV-TK-lRES-EGFP在B16细胞中均能表达HSV-tk。
本发明pCMV-mt Hsp70-lRES-tk对B16细胞的抑制作用如图4所示，pCMV-mt Hsp70-IRES-tk对B16 细胞的抑制率随前体药物GCV的浓度提高而提高，当GCV浓度为50ug/ml时对B16细胞的杀伤效应近 50%，表明该质粒具备杀死肿瘤细胞的功能。
2、感染B16细胞后24小时可观察到对照组报告基闪EGFP的表达，B16细胞变圆，36小时明显增 大，72小时肿瘤细胞均死亡，电镜下可观察到多个重组菌佼入B16胞浆内，可见本发明疫苗对B16细胞 有很好的靶向性。
二、动物实验局部注射本发明沙门氏菌DNA疫苗对小鼠原发B16瘤的抑制作W (— )实验动物和材料
1、 实验动物选用5-6同龄BALB/C小鼠60只，体重20g土2g。
2、 实验材料.-
本发明疫苗和各对照疫苗均按实验一中的实验材料的方法制备。 (二)实验方法
以1 X 106个B16细胞于BALB/C小鼠右背皮下注射建立荷B16动物模型，以游标卡尺测量肿瘤大小， 每周次，计算肿瘤体积按文献公式VHi^^宽"0.52，当肿瘤体积达到40~50mm3,所有荷瘤鼠随机分为5 组，每组8只，分组和给药情况如下
实验组瘤内注射本发明疫苗(简记为HT组)；
对照组1:瘤内注射转入了 pCMV-mtHsp70-lRES-EGFP质粒的减毒沙门氏菌SL7207 (简记为H组)； 对照组2:瘤内注射转入了 pCMV-TK-lRES-EGFP质粒的减毒沙门氏菌SL7207 (简记为T组)； 对照组3:瘤内注射转入了 pIRES-EGFP质粒的减毒沙门氏菌SL7207 (简记为Sa组)； 对照组4:瘤内注射PBS (简记为PBS组)。
实验组和对照组1-3的给药剂量为1X101QCFU/I00ul，对照组4予以相同体积的PBS，连续二天给予，1次/天，给重组鹵48小时后予以GCV50mg/kg溶于0.5mlPBS腹腔注射2次/天，连续5天，给完GCV 后次日各组处死2只荷瘤鼠，取瘤标本做病理分析及电镜观察；游标卡尺每三天测量各组肿瘤直径1次。 治疗结束后两周，各组处死动物，按以下公式计算抑瘤率相对PBS治疗组抑瘤率- (PBS组治疗后平均 体积-实验组治疗后平均体积)/PBS组治疗后平均体积。 (三)实验结果
表
組别治疗前平均体积治疗后平均体积抑瘤率(%)
HT45. 12. 698. 95
H43. 8137. 144. 42
'T44. 7149. 339. 48
Sa45. 7151.838. 47
PBS44. 9246. 70
结果显示瘤内注射本发明疫苗后(HT组)肿瘤体积显著缩小，相对PBS组抑瘤率为98.95%。其抑 瘤率显著高于其他实验组。同时，H、 T和Sa组均有一定的抑瘤效果，说明细菌对肿瘤有抑制作用。病理 分析可见本发明疫苗注射的肿瘤周围有人量的淋巴细胞募集，表明该疫苗对肿瘤fl备较强的免疫杀伤作 用；治疗后组织电镜观察可见肿瘤细胞内有大量的细菌侵入，表明该疫苗对肿瘤具有耙向性。
图1是pCMV-mtHsp70-lRES-G杀基闪的结构简图。
图2是本发明pCMV-mt Hsp70-IRES-tk在B6细胞中的表达mt Hsp70的蛋5质印迹图；其中， A是本发明pCMV-mt Hsp70-IRES-tk和各对照组质粒的mt Hsp70的westblot结果，B是各组B6细胞 中p-Actin的westblot结果；
1是pCMV-mtHsp70-IRES-TK质粒转染至B16中Westembolt结果，2是未转染质粒的B16细胞的 Westernbolt结果，3是pCMV-IRES-EGFP质粒转染至B16中Westernbolt结果，4是未转染质粒的B16细 胞的Westernbolt结果，5是pCMV-mtHsp70-IRES-EGFP质粒转染至B16中Westernbolt结果，6是未转染 质粒的B16细胞的Westernbolt结果，7是pCMV-TK-IRES-EGFP质粒转染至B16中Westernbolt结果，8 是未转染质粒的B16细胞的Westernbolt结果。
图3是本发明pCMV-mt Hsp70-lRES-tk在B6细胞中的表达HSV- tk的检测结果图；其中， A是本发明pCMV-mt Hsp7(MRES-tk和各对照組质粒的HSV- tk的westblot结果，B是各组B6细胞中 P-Actin的westblot结果；
1是pCMV-mtHsp70-IRES-TK质粒转染至B16中Westernbolt结果，2是未转染质粒的B16细胞的 Westernbolt结果，3是pCMV-IRES-EGFP质粒转染至B16中Westernbolt结果，4是未转染质粒的B16细 胞的Westernbolt结果，5是pCMV-mtHsp70-IRES-EGFP质粒转染至B16中Westernbolt结果，6是未转染 质粒的B6细胞的Westernbolt结果，7是pCMV-TK-IRES-EGFP质粒转染至B6中Westernbolt结果，8
7是未转染质粒的B16细胞的Westernbolt结果。
图4是本发明pCMV-mt Hsp70-IRES-tk在不同GCV浓度下对B16细胞的抑制作用曲线图，其中，
表示pCMV-mt Hsp70-IRES-tk， 表示pCMV-IRES-EGFP, ^*~表示pCMV- mt Hsp70-IRES-EGFP，
表示pCMV- tk -IRES-EGFP， ^""表示PBS对照。
图5是HSV-tk基因的PCR产物的电泳图，其中M为分子量标准物，1为HSV-tk的PCR产物。 图6是mtHsp70的PCR产物的电泳图，其中M为分子量标准物，1为mfflsp70的PCR产物。 图7是pCMV-mt Hsp70-lRES-tk的酶切鉴定结果，其中M为分子量标准物，2是Notl,切结果，3
是EcoR I和Xho I双酶切结果。 -图8是pCMV-mt Hsp70-IRES-tk的结构示意图。
具体实施方式
例1
1 、 mt Hsp70和HSV- tk基因的获得 (1)设计引物
根据HSV-TK (genbankNO. J02224.)和结核杆菌Hsp 70基因(genbank NO. BX842573)mRNA序列， 应用引物设计软件DNA club分别设计扩增HSV-TK和mtHsp 70基因全长cDNA的特异引物，各引物序列 如下
HSV-TK引物
Forward : 5，-iGCGGCCGC| GCGCCTTGTAGA AGCGCG TA-3'(SEQNO. 1)
Reverse : 5'-lGCGGCCGC^CTTCCGGTA丁TGTCTCCTTCC-3'(SEQ NO. 2)
上游引物和卜游引物均引入限制性内切酶Not I位点(加框部分序列)； Hsp 70引物
Forward: 5 '-|CTCGAG|CGCCTACATGGCTCGTGC-3' (SEQ NO, 3)
R Reverse :5 '-|GAATTC|TTCACTTCGCCTCCCGG-3' (SEQ NO. 4) 上游和下游引物分别引入限制性内切酶Xho I和EcoR I位点(加框部分序列)； 将上述设计的引物序列提交给大连宝生物工程有限公司，委托进行引物寡核苷酸链OPC级合成。
(2) PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增mt Hsp70和HSV- tk基因的cDNA片段 用步骤(1)所得的HSV-TK引物扩增pcDNA3-TK质粒得到HSV- tk基肉的cDNA片段，用步骤(1)
所得的mt Hsp70引物扩增mthsp70质粒DNA得到mt Hsp70基因的cDNA全长，上述PCR反应的反应体
系和反应条件如下所示
①反应体系5 X buffer ,
2. 5mM d證Mix 化l
5uM primer (sense十antisense ) 3^1
质粒DNA (10ng/nl) 2[il
HS DNA Polymerase (2.5u/ n 1) 0.5^1
細20 30.5nl
总体积 .50^1 ②反应条件
先在94'C下变性3min，再在以F条件下循环反应32个循环98。C下变性30s, 68'C卜退火2rain;最 后72'C延伸10min， 8'C保存。
PCR结束后，产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外投射仪观察结果，如图5和图6所示，pMD18T-tk 的PCR产物大小为1192bp， pMD 18 T-mtHsp70的PCR产物大小为1898bp。 ffl QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit将PCR产物电泳后切胶冋收，得到mt Hsp70和HSV- tk基因的cDNA片段，其序列分别为 SEQNO. 5和SEQ NO. 6。
(3)将mt Hsp70和HSV- tk基因的cDNA片段与T载体连接
①胶回收所得mt Hsp70和HSV- tk基因按下列体系和条件进行PCR产物3'加A尾反应。
A.反应体系
lOXA-tailing buffer 5nl
2. 5mM d證Mixture 化l
A-tailing Enzyme 0. 5pl
平末端PCR product (42ng/u 1) 25^il
dd腦 15.5[il
总体积 50pl
B.反应条件先72。C下反应20min,然后冰上放置2 min。
②将加A尾后的mt Hsp70禾l1 HSV- tk基因分别与pMD 18-T Vector连接，方法如下取50ng/Vl的pMD 18-T Vector lnl、 A-tailing PCR product (mt Hsp70或HSV-tk基因)叫和Solution I5pl混匀置16。C水浴 过夜，得pMD 18 T-mtHsp70和pMD 18 T-tk。
(4)将pMD 18 T-mtHsp70和pMD8 T-tk分别转化到大肠杆菌TGI中。
①TG1感受态细胞制备从Agar平板上挑选单个TGl菌落，接种于2ml LB培养基中，37'C,220 rpm，摇菌过夜；次日取lml菌液接种到含有100ml LB培养基的500ml三角烧瓶中继续振摇培养， 相同条件下继续培养3小时，取出冰浴15min，无菌条件下将菌液分装到灭菌处理的预冷50ml离心
9管中，4'C， 4，500rpm，离心10min收集细胞，弃掉LB培养基，加0. 1M用冰预冷的Cacl2 lml重悬 细胞，然后置冰浴30min, 4'C， 4， 500rpm离心lOmin重新收集细胞，弃上清，再加0. 1M用冰预冷的 Cacl2 4ml重悬细胞。4'C保存过夜，加入适量甘油(15%)后分装，-7CTC保存备用。
② 转化从-70'C冰箱内取出制备好的TG1感受态细菌，在无菌条件下，取lOOu 1加入预冷的2ml EP 管中，再加入8 u lpMD 18 T-mtHsp70或pMD 18 T-tk，轻轻混合后置冰上30分钟.然后42。C水浴90秒， 迅速放置冰上2分钟，加lml无任何抗生素的LB培养基，37°C，220 rpm摇菌60分钟，离心弃除大部分 上清，剩下300ul菌液铺T琼脂平板上，37。C培养过夜。
③ 用PCR方法挑选阳性克隆接种单菌落转化子到1 ml LB培养基中，37'C下220 rpm摇菌过夜， 取100u l菌液煮沸IO分钟，10，000rpra，离心10分钟，取上清3tU,用步骤1设计的扩增HSV-tk 和mtHsp 70基因cDNA全长的特异引物进行PCR鉴定，反应体系和条件如下
PCK反应体系(TaKaRa Taq' PCRKit):
10x'PCR Buffer
25mM MgCl22|il
dNTPMix(各2.5mM)4^1
5uM primer( sense +antisense)2nl
TaKaRa Taq (5,)0.25nl
菌液上清6pl
dd腦23.75n]
总体积50|al。
反应条件先94'C下变性5min，再在以下条件下反应31个循环:94。C变性30s， 53'C退30s， 72°C延伸2min;最后72。C10min; 8'C保存。
结果转化大肠杆菌TG1后在Amp抗性平板上生长出约200个阳性菌落，每组随机挑选8个克隆接 种到含500 u 1LB的2mlEP管中摇菌，ffl HSV-TK和结核杆菌Hsp 70基闪的特异引物进行菌落PCR， 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳结果显示HSV-TK连接产物转化的大肠杆菌8个菌落中有6个扩增出特定大小的PCR产物， 证实为含有tk重组质粒的阳性菌落，而8个hsp菌落中亦有6个获得长度为1898bp的片断，确定为含有 阳性hsp70重组质粒。
阳性克隆的序列测定
选定通过PCR鉴定确定含有重组基因片断的阳性克隆，送检6个阳性pMD18T-tk阳性克隆和pMD 18 T-mtHsp70阳性克隆的菌液各100li 1给大连宝生物:]:程有限公司，应用pMD 18-T载体的通用引物M13-47 和RV-M进行上游和下游序列测定。
M13-47:CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
10RV-M: GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
测序结果'3基ra序列进行同源比较，各有2个重组质粒的序列与HSV-tk基冈序列和mtHsp70基因序 列100%同源，而且引入的酶切位点序列也完全正确。各选其一用于pCMV-mtHsp70-IRES-tk的制备。
2、 pCMV-mt Hsp70-IRES-汰的构建
(〗)用限制性内切酶Not I消化质粒pCMV-ires-EGFP和pMD 18 T-tk,分别回收载体片断和HSV-tk 基因片断(U92bp),载体片断与冋收的HSV-tk基肉片断在T4DNA连接酶的作用下进行连接反应。连接产 物转化大肠杆菌后铺kana抗性平板，挑选阳性克隆摇菌后少量提取质粒Notl酶切证实pCMV-IRES-TK构建 成功。
(2)用EcoR I和Xho 1双酶切pCMV -ires-tk质粒和pMD 18 T-mtHsp70,问收载体和1898bp的mtHsp70 的片断进行连接反应。连接产物转化火肠杆菌后铺k肌a抗性平板，取阳性克隆摇菌后少量提取质粒,分别 用Not I单酶切及EcoR I和Xho I双酶切进行酶切鉴定，酶切产物屯泳见特异酶切图谱(图7 ),确定 为重组质粒pCMV-mtHsp70 -IRES-tk,其质粒图谱如图8所示。
3、 本发明DNA疫苗的制备
1)实验材料10%甘油，超纯水，GYT(冰预冷)(10%甘油，0.125% yeast extract, 0.25% tryptone)， LB， SOB琼脂平板(含20mMMgSO4以及相应抗生素)，SOC(0.5% yeast extract, 2.0% tryptone， 10mM NaCl' 2.5mMKCl， 10mMMgCl， 20 mM glucose),减毒沙门氏菌SL7207。
2)步骤
(1) 挑取SL7207齒单克隆，至50mlLB， 37°C, 227rpm振荡培养过夜
(2) 将菌液转移至250 ml LB的2 L锥形瓶中，继续振荡培养，每隔20min测一次0D值，直到OD值 接近0. 4。
(3) 当0D值接近0.4时，迅速将锥形瓶转入冰水混合物中，缓慢振摇15-30min，同时准备将离心管 置冰上预冷。
(4) 将齒液转入离心管，4 。C, 1000g，离心15 rain。
(5) 弃上清，用500 ml冰预冷的超纯水重悬沉淀。
(6) 离心，条件同上。
(7) 弃上清，用250 ml 10%冰预冷的甘油重悬沉淀。
(8) 离心，条件同上。
(9) 弃上清，用10 ml 10%冰预冷的甘油重悬沉淀。
(10) 离心，条件同上。
(11) 小心弃上淸，除去痕量液体，用冰预冷的1 mlGYT培养基重悬沉淀。
(12) 分装11步获得的菌液，每只EP管40 ul。(13) 每40ul菌液加入质粒20pg，在电脉冲25nF，电压2,5 kV，电阻200Q的条件下进行电穿孔转化。
(14) 将转化结束的齒液稀释104倍，取200 ul铺相应抗生素SOB琼脂平板。用酶切法鉴定转化子。 瘤内注射本发明疫苗后须在48小时后连续5天静脉注射HSV-TK前体药物更昔各韦(Gancivol ，
GCV)。 例2
1、 mtHsp70和HSV-tk基因的获得与例1同。
2、 pCMV-mtHsp70-IRES-tk的构建:与例1同。
3、 本发明DNA疫苗的制备将pCMV-mtHsp70-lRES-tk转化到乳酸杆菌中，具体操作与例i相同。 例3
1、 mtHsp70和HSV-tk基因的获得与例1同。
2、 pCMV-mtHsp70-IRES-tk的构建与例1同。
3、 本发明DNA疫苗的制备将pCMV-mtHsp70-IRES-tk转化到双歧杆菌中，具体操作与例相同。 例4
1、 mtHsp70和HSV-tk基因的获得与例1同。
2、 pCMV-mtHsp70-IRES4k的构建与例1同。
3、 本发明DNA疫苗的制备将pCMV-mtHsp70-lRES-tk转化到减毒结核杆菌中，具体操作与例1相同。
例5
1、 CD基因的获得
上游引物5'-GCGGCCGC GAC GCA TGT GGA GGC TAA CAATG-3' ( SEQNO. 7) 下游引物为5'-GCGGCCGC GCTCGC TGTAAC CCA GTC GT-3' (SEQ NO. 8)。 上、下游引物均含NtoI酶切位点。将上述设计的引物序列提交生物工程公司，委托进行引物寡核苷 酸链OPC级合成。
用CD引物扩增CD质粒DNA得到CD基因的cDNA全长(SEQ NO. 9)，将CD基因的cDNA片段与 T载体连接成PMD18-T-CD。
2、 用NOtI酶切例1所得pCMV-mtHsp70-lRES-汰禾ll PMD]8-T國CD，用CD基因cDNA置换 pCMV-mtHsp70-IRES-tk质粒中的tk基冈获得pCMV-mtHsp70-lRES-CD质粒。
3、 本发明DNA疫苗的制备将pCMV-mt Hsp70-IRES-CD转化到SL7207中，具体操作与例1相同。
4、 上述所得疫苗的使W方法行瘤内注射所得疫苗，48小时后连续5天给予前体药物5-FC。序列表
〈110〉南方医科大学
<120> —种抗肿瘤DNA疫苗及其制备方法
〈歸 9
〈170> Patentln version 3. 3
〈210〉 1
〈211〉 28
〈212> 腿
〈213〉 人工序列
<400> 1
gcggccgcgc gccttgt卿agcgcgta
〈210〉 2
<211> 30
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
〈400> 2
gcggccgccc ttccggtatt gtctccttcc
<210> 3
〈211〉 24
<212〉 DNA <213>人工序列
〈400> 3
ctcgagcgcc tacatggctc gtgc
〈210> 4
<211> 23
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<400> 4
gaattcttca cttggcctcc egg
13〈210〉 5
<211〉 1740
〈212〉 DNA
〈213〉 mycobacterium
tuberculosis
〈400〉 5
atggctcgtg cggtcgggat cgacctcggg accaccaact ccgtcgtctc ggttctggaa 60
ggtggcgacc cggtcgtcgt cgccaactcc gagggctcca ggaccacccc gtcaattgtc 120
gcgttcgccc gcaacggtga ggtgctggtc ggccagcccg ccaagaacca ggcagtgacc 180
aacgtcgatc gcsccgtgcg ctcggtcaag cgacacatgg gcagcgactg gtccatagag 240
attgEicggca agaaatacac cgcgccggag atcagcgccc gcattctgat g犯gctgaag 300
cgcgacgccg aggcctacct cggtgaggac attaccgacg cggttatcac gacgcccgcc 360
tacttcaatg acgcccagcg tcaggccacc aaggacgccg gccagatcgc cggcctcaac 420
gtgctgcgga tcgtcaacga gccgaccgcg gccgcgctgg cctacggcct cgac犯gggc 480
gagaaggagc agcgaatcct ggtcttcgac ttgggtggtg gcactttcga cgtttccctg 540
ctggagatcg gcgagggtgt ggttgaggtc cgtgccactt cgggtgacaa ccacctcggc 600
ggcgacgact gggaccagcg ggtcgtcgat tggctggtgg acaagttcaa gggcaccagc 660
ggcatcgatc tgaccaagga caagatggcg atgcagcggc tgcgggaagc cgccgagaag 720
gcaaagatcg agctgagttc gagtcagtcc acctcgatca acctgcccta catcaccgtc 780
gacgccgaca agaacccgtt gttcttagac gagcagctga cccgcgcgga gttccaacgg 840
atcactcagg acctgctgga ccgcactcgc aagccgttcc agtcggtgat cgctgacacc 900
ggcatttcgg tgtcggagat cgatcacgtt gtgctcgtgg gtggttcgac ccggatgccc 960
gcggtgaccg atctggtcaa ggaactcacc ggcggcaagg aacccaacaa gggcgtcaac 1020
cccgatgagg ttgtcgcggt gggagccgct ctgc鄉ccg gcgtcctcaa gggcgaggtg 1080
aa卿cgttc tgctgcttga tgttaccccg ctgagcctgg gtatcgagac c犯gggcggg 1140
gtgatgacca ggctcatcga gcgcaacacc acgatcccca ccaagcggtc ggagactttc 1200accaccgccg acgacaacca accgtcggtg cagatccagg tctatcaggg ggagcgtgag 1260
atcgccgcgc acaacaagtt gctcgggtcc ttcgagctga ccggcatccc gccggcgccg 1320
cgggggattc cgcagatcga ggtcactttc gacatcgacg ccaacggcat tgtgcacgtc 1380
accgccaagg acaagggcac cggcaaggag aacacgatcc gaatccagga aggctcgggc 1440
ctgtccaagg aagacattga ccgcatgatc aaggacgccg aagcgcacgc cgaggaggat 1500
cgcaagcgtc gcgaggaggc cgatgttcgt aatcaagccg agacattggt ctaccagacg 1560
gagaagttcg. tcaaagaaca gcgtgaggcc gagggtggtt cgaaggtacc tgaagacacg 1620
ctgaacaagg Ugatgccgc ggtggcggaa gcgaaggcgg cacttggcgg atcggatatt 1680
tcggccatca agtcggcgat gg卿agctg ggccaggagt cgcaggctct ggggcaagcg 1740
<210> 6〈211> 1177〈212〉 DNA
<213> herpessimplevirns<400> 6
gcgccttgta gaagcgcgta tggcttcgta cccctgccat caacacgcgt ctgcgttcga 60
ccaggctgcg cgttctcgcg gccatagcaa ccgacgtacg gcgttgcgcc ctcgccggca 120
gcaagaagcc acggaagtcc gcctggagca gaaaatgccc acgctactgc gggtttatat 180
卿cggtcct cacgggatgg ggaaaaccac caccacgcaa ctgctggtgg ccctgggttc 240
gcgcgacgat atcgtctacg tacccgagcc gatgacttac tggcaggtgc tgggggcttc 300
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cggggacgcg gcggtggtaa tgacaagcgc ccagataaca atgggcatgc cttatgccgt 420
gaccgacgcc gttctggctc ctcatatcgg gggggaggct gggagctcac atgccccgcc 480
cccggccctc accctcatct tcgaccgcca tcccatcgcc gccctcctgt gctacccggc 540
cgcgcgatac cttatgggca gcatgacccc ccaggccgta ctggcgttcg tggccctcat 600
cccgccgacc ttgcccggca caaacatcgt gttgggggcc cttccggagg acagacacat 660<formula>formula see original document page 16</formula>cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag 180
ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc 240
acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat 300
gtgaaacaac gcgcatggca犯cgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg 360
cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcascg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg 420
aagctggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt 480
ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcsg已tgta 540
gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa 600
accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat 660
gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccgtga aggcatgggc 720
gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactctt ataacggggc gtatacctca 780
cgtctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat 840
attcatctgc aaggacgatt cgatacgtEit ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa 900
gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg 960
tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag 1020
ctgatgggct atgggcagat t犯cgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgccagg 1080
acgttgaatt tgcaggatta cagcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg 1140
ccggctgaaa atggatttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt 1200
ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagccg 1260
gaagcc已tcg attacaaacg gtga
1284
1权利要求
1、一种抗肿瘤DNA疫苗，该疫苗由人体益生的兼性厌氧细菌、人体益生的厌氧细菌、减毒的兼性厌氧细菌或减毒的专性需氧菌携带pCMV-mt Hsp70-IRES-自杀基因构成；所述的pCMV-mt Hsp70-IRES-自杀基因是以pCMV质粒为表达载体，以结核杆菌热休克蛋白70基因和自杀基因为抗原基因构成的重组质粒，其中所述的结核杆菌热休克蛋白70基因和自杀基因分别位于pCMV质粒中的内部核糖体进入位点的上游和下游。
2、 权利要求l所述的疫苗，其特征在丁-所述的人体益生的兼性厌氧细菌是乳酸杆菌。
3、 权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的人体益生的厌氧细菌是双歧杆菌。
4、 权利要求l所述的疫苗，其特征在于所述的兼性厌氧细菌是沙门氏菌。
5、 权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的专性需氧菌是结核分支杆菌。
6、 权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的S杀基因是单纯疱疹病毒I观胸苷激酶基因或大肠杆 菌胞嘧啶脱氨酶基因。
7、 权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的Q杀基冈是单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基闵。
8、 权利要求1 7之一所述疫苗的制备方法，该方法由以下步骤组成(1) 从含冇结核杆齒热休克蛋^70的质粒成DNA中通过PCR扩增出结核杆齒热休克蛋A70基闪的 cDNA;从含有白杀基闪的质粒或DNA中通过PCR扩增出自杀基因的cDNA;(2) 先用自杀基W的cDNA置换pCMV- IRES -EGFP质粒中位于内部核糖体进入位点的卜游的EGFP 基因，得到pCMV - IRES -自杀基冈，然后mt Hsp70cDNA连接到pCMV -ires-自杀基因中的内部核糖体进入 位点上游，得到pCMV-mt Hsp70-IRES-自杀基H;(3) 通过电穿孔方法将所得pCMV-mt Hsp70-IRES-自杀基因转化到人体益生的兼性厌氧细菌、人体 益生的厌氧细菌、减毒的兼性厌氧细菌或减毒的专性需氧菌中，即得本发明疫苗。
全文摘要
本发明提供了一种抗肿瘤DNA疫苗，该疫苗是将pCMV-mt Hsp70-IRES-自杀基因转化到人体益生的兼性厌氧细菌、人体益生的厌氧细菌、减毒的兼性厌氧细菌或减毒的专性需氧菌中得到；所述的pCMV-mtHsp70-IRES-自杀基因是以pCMV质粒为表达载体，以结核杆菌热休克蛋白70基因和自杀基因为抗原基因构成的重组质粒，其中所述的结核杆菌热休克蛋白70基因和自杀基因分别位于pCMV质粒中的内部核糖体进入位点的上游和下游。本发明所述DNA疫苗用于治疗实体瘤，通过局部注射给药。
文档编号A61K48/00GK101485888SQ20091003723
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月18日 优先权日2009年2月18日
发明者张积仁, 曾曙光, 章锦才 申请人:南方医科大学