一种自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用。具体地，对自体肿瘤细胞进行放射和/或加热的处理，可以大大激发自体肿瘤细胞的抗原性，热休克蛋白增强抗原提呈性；再进行肿瘤细胞灭活，辅以佐剂，制成疫苗。用本发明方法制备的疫苗具有被提呈性强，肿瘤免疫原性强的特殊优点，能强烈激发肿瘤患者对自体肿瘤的体液及细胞免疫反应，以达到提高抗原发性及转移性肿瘤效应，延长肿瘤患者存活时间的目的。
【专利说明】一种自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和免疫学领域，具体地，本发明涉及一种自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤是目前引起人类的主要死亡原因之一。尽管近年来在肿瘤的诊断和治疗方面的水平不断得到改进和提高，化疗和放疗的方案也在不断地改进，但最终大部分病人仍难以逃脱死亡的厄运。
[0003]在恶性肿瘤不同的治疗模式中，免疫治疗因为其特异性的杀伤肿瘤细胞，具有高效率和低毒副作用的特点，越来越受到关注。近年来，分子生物学的进展和对免疫系统功能的进一步的了解使得的研制和开发生物治疗方法进入了一个飞速发展的阶段。肿瘤疫苗的研制是目前肿瘤生物治疗的最主要的方向。
[0004]然而由于恶性肿瘤具有多种免疫逃逸机制，主要包括肿瘤细胞抗原含量低，肿瘤抗原的破坏或不断变异，或者肿瘤抗原的处理提呈差，或者缺乏一些免疫辅助因子的表达，或者机体免疫功能低下等，使得现有肿瘤瘤苗的临床治疗效果不佳。由于恶性肿瘤异质性，多样性，多变性使不同个体在患同种肿瘤时，其个体肿瘤抗原极不相同。因而，肿瘤免疫治疗应为个体化，以诱导个体特异性的杀伤自体肿瘤细胞的主动免疫。
[0005]目前全细胞作为肿瘤疫苗，可以提供那些未知的肿瘤抗原来激活免疫系统肿瘤抗原。小鼠肿瘤模型中，通常使用灭活的肿瘤细胞免疫小鼠，以保护小鼠免受接种的肿瘤的侵袭。但当肿瘤细胞疫苗使用的时间推迟到接种肿瘤细胞后一周时，疫苗就失去了保护小鼠的能力。导致目前肿瘤细胞疫苗的临床治疗反应比较差，仅仅适用于无特殊肿瘤抗原的肿瘤病人的预防复发。对于进展期病人在临床研究方面很少获得良好效果。
`[0006]理想的肿瘤-特异的抗原应具有免疫原性，为肿瘤细胞所表达但不表达于正常的细胞。不幸的是，大多数肿瘤抗原都没有足够的免疫原性以诱导有效的免疫反应。
[0007]目前尚缺乏具有良好的免疫原性和特异性自体肿瘤疫苗及其制备方法，本领域迫切需要开发相应方法和疫苗。
【发明内容】
[0008]本发明的目的就是提供一种自体肿瘤疫苗的制备方法。
[0009]本发明的另一目的提供一种自体肿瘤疫苗及其应用。
[0010]在本发明的第一方面，提供了一种制备自体肿瘤疫苗的方法，包括步骤:
[0011](I)获得分离的自体肿瘤细胞；
[0012](2)用放射法和/或加热法处理步骤(1)的自体肿瘤细胞，获得抗原性和抗原提呈性增强的肿瘤细胞；
[0013](3)对步骤(2)获得的肿瘤细胞进行灭活处理，获得灭活的肿瘤细胞；
[0014](4)将步骤(3)获得的灭活的肿瘤细胞制备为自体肿瘤疫苗。[0015]在另一优选例中，所述的肿瘤为:实体瘤或非实体瘤。
[0016]在另一优选例中，所述的实体瘤来源于:脑、肺、头颈部、皮肤、胰、胃肠道、膀胱、生殖道、脊髓、脾、肾、肝、四肢、骨骼、舌、或喉。
[0017]在另一优选例中，所述的非实体瘤来源于血液或骨髓。
[0018]在另一优选例中，所述的肿瘤为原发性肿瘤或继发转移性肿瘤。
[0019]在另一优选例中，所述的肿瘤来源于非人哺乳动物组织或人的组织。
[0020]在另一优选例中，步骤(1)所述获得分离的自体肿瘤细胞的方法选自下组:
[0021]酶消化法、机械剪切法、或人工磨碎肿瘤组织法将肿瘤组织处理为可培养的分离的自体肿瘤细胞。
[0022]在另一优选例中，步骤⑵所述的放射法选自下组:用选自α，β、Y、质子、或重离子放射线、以任选自0.l_50Gy剂量范围、任选自0.1-1OGy/min剂量率，处理步骤(1)的自体肿瘤细胞，获得抗原性和抗原提呈性增强的肿瘤细胞。
[0023]在另一优选例中，放射线来源于天然的或人工的放射源。
[0024]在另一优选例中，步骤⑵所述的加热法选自下组:加热温度任选自37.50C -500C (优选380C _45°C )，加热时间任选自lmin-2小时(优选30min_l小时)。
[0025]在另一优选例中， 在步骤(2)和步骤(3)之间，还包括步骤:对步骤(2)获得抗原性和抗原提呈性增强的肿瘤细胞进行培养处理。
[0026]在另一优选例中，培养处理时间选自:6小时到2星期。
[0027]在另一优选例中，在培养处理中，使用基本细胞培养液，和/或加入生长因子或小分子化合物。
[0028]在另一优选例中，步骤(3)所述的灭活处理选自下组:微波细胞灭活法、电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法、高温细胞灭活法、超声破碎细胞灭活法、反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法、酶学消化细胞灭活法、低渗破裂法、或其组合。
[0029]在另一优选例中，在步骤(4)中，将步骤(3)获得的灭活的肿瘤细胞与佐剂混合，获得自体肿瘤疫苗。
[0030]在另一优选例中，所述的佐剂为福氏完全佐剂或不完全佐剂。
[0031]在另一优选例中，所述的佐剂选自下组:脂质体、细胞因子(如GM-CSF、G-CSF,CSF、IFN、IL-2等)，各种植物蛋白、DNA、减活或灭活病毒、细菌、真菌、微生物、或其组合。
[0032]在本发明的第二方面，提供了一种自体肿瘤疫苗，所述疫苗是用第一方面所述的方法制备的。
[0033]在本发明的第三方面，提供了第二方面所述自体肿瘤疫苗的用途，它被用于制备预防或治疗肿瘤的组合物。
[0034]在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物或疫苗组合物。
[0035]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0037]图1显示注射自身肿瘤疫苗后3周抗肿瘤抗体IgG的测定结果。
[0038]图2显示抗肿瘤T细胞杀伤实验。
[0039]图3显示实验分组以及操作流程。
[0040]图4显示抗肿瘤效应突光实时动态测定(Live Image)结果。
[0041]图5显示本发明实施例1的方法制备的疫苗抗原位癌(4T1-Luc)效应(试验一)结
果O
[0042]图6显示本发明实施例1的方法制备的疫苗抗原位癌(4T1-Luc)效应(试验二)结
果O
[0043]图7显示本发明实施例1的方法制备的疫苗与Taxol抗癌效应的比较(试验三，与化疗药Taxol比较)结果。
[0044]图8显示本发明一个实施例的方法对实验性肺转移癌的杀伤抑制作用。
[0045]图9显示本发明一个实施例制备自体肿瘤疫苗的流程。
【具体实施方式】
[0046]本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，对自体肿瘤细胞进行放射和/或加热的处理，可以大大激发自`体肿瘤细胞的抗原性，热休克蛋白增强抗原提呈性；再进行肿瘤细胞灭活，辅以佐剂，制成疫苗。所述疫苗具有被提呈性强，肿瘤免疫原性强的特殊优点，能强烈激发肿瘤患者对自体肿瘤的体液及细胞免疫反应，以达到提高抗原发性及转移性肿瘤效应，延长肿瘤患者存活时间的目的。在此基础上完成了本发明。
[0047]制备方法
[0048]本发明提供了一种制备自体肿瘤疫苗的方法，在一个优选例中，包括步骤:
[0049](I)获得分离的自体肿瘤细胞；
[0050](2)用放射法和/或加热法处理步骤(1)的自体肿瘤细胞，获得抗原性和抗原提呈性增强的肿瘤细胞；
[0051](3)对步骤⑵获得的肿瘤细胞进行灭活处理，获得灭活的肿瘤细胞；
[0052](4)将步骤(3)获得的灭活的肿瘤细胞制备为自体肿瘤疫苗。
[0053]具体地，包括如下步骤(图9):
[0054]通过外科手术或活检获取肿瘤组织；
[0055]将所得肿瘤组织按如下方法准备肿瘤细胞:在无菌条件下取肿瘤新鲜、血供好的未坏死部分，放入DMEM或其它培养液中在4°C下保存，用PBS冲洗，通过酶消化法或/及机械分离法得到纯化的肿瘤细胞，将其移入培养瓶中，370C，5%C02恒温培养箱传代培养，达到所需细胞数后进入肿瘤全细胞瘤苗制备程序；
[0056]通过放射和/或加热的方法处理培养中的肿瘤细胞使其抗原激发，利用增加的热休克蛋白增强抗原提呈性。；
[0057]进一步的，处理培养后的肿瘤细胞采用下述方法进行灭活:微波细胞灭活法、电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法，高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法，酶学消化细胞灭活法、低渗破裂等方法中至少一种；
[0058]灭活后，即得肿瘤全细胞疫苗。[0059]本发明辅以上述肿瘤全细胞疫苗以佐剂，其佐剂可为福氏完全佐剂或不完全佐剂，经过油包水佐剂、脂质体、细胞因子(如GM-CSF、各种植物蛋白DNA)，减活或灭活病毒、细菌、真菌、微生物。在辅以佐剂后，能更好的增强主动免疫反应，减少免疫负调节，并且增强免疫记忆。
[0060]本发明方法是将肿瘤细胞经过抗原性刺激处理和增强抗原提呈能力后，再经过灭活处理,使其丧失致瘤性,并且保留了刺激后的免疫原性，以此作为个体化肿瘤瘤苗，同时联合免疫佐剂，建立起个体化的治疗方法，不断跟踪个体免疫状态及肿瘤病情不断调整个体化免疫治疗方案，以达最佳抗肿瘤疗效。
[0061]免疫效果监测
[0062]本领域的普通技术人员可以使用常规方法判断疫苗抗肿瘤免疫反应。包括:抗肿瘤体液免疫反应评价、抗肿瘤细胞免疫反应评价、抗肿瘤临床反应评价等。
[0063]抗肿瘤体液免疫反应评价是以个体化瘤苗为抗原包被的ELISA方法检测对个体化瘤苗免疫前后患者自身血清中抗自身肿瘤抗体滴度，以客观判断抗肿瘤体液免疫反应。
[0064]抗肿瘤细胞免疫反应评价，一般地，包括皮内注射所制备的新型个体化瘤苗后，1-3天内观察患者自身皮丘大小(迟发型个体化瘤苗免疫反应)；或自身肿瘤刺激特异性淋巴细胞转化实验:包括步骤:取抗凝血，分离淋巴细胞，无血清培养，加入个体化瘤苗或对照载体，培养，判断淋巴细胞转化性增殖水平(MTT法)；个体化瘤苗的免疫调节反应。个体化瘤苗的免疫调节反应包括:检测白细胞分群(如CD4/CD8/CD llb/Gr-1等)及其表面杀伤性标志(如FasL/LIGHT/⑶25/TNF- a /IFN- Y等)，根据结果可以分为反应好和反应差两类，反应好的抗体滴度高，皮丘大于0.5cm,因此可以维持原个体化免疫方案；反应差的抗体滴度低，皮丘少于0.5cm,因此可以改变个体化瘤苗使用方法及使用不同手段增强免疫反应。免疫调节细胞亚群包括:调节性T细胞Treg (⑶4+⑶25+)、髓系来源的抑制性细胞MDSC (CD14-CDllb+)、肿瘤相关巨噬细胞ΤΑΜ (M1/M2)、调节性树突状细胞DCreg (CDllb+/Gr-Ι+)，用流式细胞术可检测各亚群。
[0065]抗肿瘤临床反应:以肿瘤影像大小评价，根据实验结果，病人免疫状态，肿瘤病情及其它抗肿瘤治疗方案的应用，决定何时加强抗肿瘤免疫，调整个体化治疗方案，继续2、3、4或更多疗程。效果监测包括但不限于影像学指标观察、无瘤生存时间、总生存时间等肿瘤疗效判断标准来判断。
[0066]总之，不断跟踪个体免疫状态及根据肿瘤病情不断调整个体化免疫治疗方案，以达最佳抗肿瘤疗效。
[0067]如上所述,个体化瘤苗的免疫反应效应可用细胞免疫、体液免疫、临床肿瘤反应来监测，监测时间可在首次免疫后约15天-60天，并通过数据评价，若反应效果不佳时，可重新调整个体化免疫治疗方案，如通过调整免疫佐剂结合、免疫剂量、免疫部位、免疫时间、免疫次数，低剂量放射刺激骨髓等免疫器官。
[0068]组合物和给药方式
[0069]本发明还提供了一种组合物，所述的组合物可以是药物组合物，也可以是疫苗组合物。本发明的组合物可以是治疗性的或预防性的。本发明的组合物包括有效量的本发明的自体肿瘤疫苗，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0070]本发明的药物组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于):注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
[0071](i)药物组合物
[0072]本发明的药物组合物包括有效量的用本发明方法制备的自体肿瘤疫苗。
[0073]本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。
[0074]为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.2微克/千克至2微克/千克。
[0075]药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如蛋白质、VLP或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体:它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’ s PharmaceuticalSciences (Mack Pub.C0.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
[0076]组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
[0077](ii)疫苗组合物
[0078]本发明的疫苗组合物可以是预防性的(即预防感染)，也可以是治疗性的。所述的疫苗组合物包含免疫性抗原(本发明的自体肿瘤疫苗)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
[0079]增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于:(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见W090/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi? 佐剂系统(RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), (3)阜素佐剂;(4) Freund 完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA) ； (5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如Y干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体，参见例如W093/13302和W092/19265 ;以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
[0080]包括免疫原 性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等可存在于这类运载体中。[0081 ] 更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
[0082]通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
[0083](iii)给药途径和剂量
[0084]所述组合物可以直接给予对象。对象可以是人或非人哺乳动物，较佳地为人。当用作疫苗时，可用已知的方法直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径施用这些组合物。
[0085]给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于):配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于):如皮内单点/多点注射、皮下单点/多点注射、淋巴结内或周围注射、肌肉注射、胸腔/腹腔注射、静脉注射、瘤周/瘤内注射。上述途径可视具体情况单独运用，必要时联合应用。注入患者自身的部位，可为但不限于原发灶、转移灶或其周围淋巴引流区及四肢远端或近端、胸背部、腹部、颈部、局部可触及的淋巴结或淋巴引流区。
[0086]使用药物组合物时，应考虑使用剂量控制在安全有效量的范围内，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康 状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0087]此外，本发明的疫苗还可与其他药物联用，其中包括(但并不限于):各种细胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各种肿瘤化疗药物，如5_Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物及某些激素等各类药物。
[0088]本发明的主要优点如下:
[0089](I)本发明用照射和/或加热主动激发肿瘤抗原表达和抗原加工提呈功能，再经灭活后，辅以佐剂，并按照个体免疫反应情况调节免疫治疗方案，达到真正个体化肿瘤免疫治疗的目的；
[0090](2)本发明能促进机体内提高免疫能力，特别是针对肿瘤的细胞免疫和体液免疫；
[0091](3)本发明中所述治疗或预防肿瘤的技术方法，适用于医疗领域，特别是预防或者治疗肿瘤，亦适用于术后肿瘤残留及存在微转移灶的患者，为本领域提供了一种新的选择，具有广阔的应用前景。
[0092]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York: ColdSpring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0093]实施例1[0094]个体化瘤苗的制备
[0095]取处于对数生长期的4T1细胞或Lewis肺癌细胞1*107个，经Y射线(4_10Gy，
1.0Gy/min)照射处理30-60分钟后，37_40°C水浴加热20分钟；在37°C，5%C02恒温培养箱48小时，再经超声破碎细胞后加入福氏佐剂，制备成乳化剂即为肿瘤全细胞疫苗。
[0096]实施例2
[0097]个体化瘤苗治疗小鼠皮下乳腺癌肿瘤
[0098]在本实施例中，经细胞、动物实验各相关指标证实，本发明方法制备的瘤苗有很强的抗原递呈性及激发抗体免疫反应的能力。具体结果如下:
[0099]1.促进抗肿瘤抗体的产生
[0100]实验方法:常规的Balb/c小鼠经过实施例1制备的肿瘤细胞抗原免疫后3周，取血浆倍比稀释，加入用肿瘤细胞包被的ELISA板，以抗鼠IgG-HRP及TMB底物显示抗体滴度(本实验为1:100000)。
[0101]结果表明，用实施例1制备的肿瘤抗原与对照方法制备的瘤苗相比，有更强的促抗肿瘤抗体产生能力(图1):在免疫Balb/c小鼠3周后，实施例1制备的抗原刺激更多的抗4T1乳腺癌细胞的抗体(t检验，p〈0.05，n=10)，NC:对照；NS:佐剂对照ORIGINAL:对照方法制备的瘤苗；NEW:本发明制备的瘤苗。
[0102]2.促进抗肿瘤细胞免疫反应
[0103]方法同上。Balb/c`小鼠经实施例1制备的肿瘤细胞抗原免疫3周后，取淋巴细胞(LN)及脾细胞(SP)与构建的含有Luciferase的4T1肿瘤细胞(4Tl_luc)以10:1，100:1，1000:1的比例混合培养，72小时后测定由死亡4T1细胞释放的Luciferase的活性(RLu表示)。
[0104]结果如图2所示，小鼠接受实施例1制备的肿瘤细胞抗原免疫能够产生较佐剂免疫更强的T细胞杀伤(p〈0.05，n=5);图2上图为佐剂组抗肿瘤T细胞杀伤实验，图2下图为实施例1方法组制备的肿瘤细胞抗原抗肿瘤T细胞杀伤实验,Rlu指Luciferase的活性；NC指正常对照组；LN指淋巴结细胞；SP指脾细胞。
[0105]实施例3
[0106]对小鼠肿瘤的抑制作用
[0107]根据免疫学原理，小鼠抗肿瘤免疫试验分两步:
[0108]1.肿瘤免疫致敏:将处理后的肿瘤抗原新型瘤苗先接种在待试小鼠皮下，14天后，再强化免疫一次，7天后接种同源性小鼠肿瘤细胞(图3)。
[0109]2.免疫抗癌效应:分两类:
[0110]a、对原位癌的抑制作用:使用BALB/c小鼠与4T1乳腺癌细胞株；
[0111]b、对转移瘤的抑制作用:使用C57BL/6小鼠和Lewis肺癌细胞株。Lewis及4T1癌细胞均为高度恶性，生长快，难以控制，且能够形成肺转移癌。
[0112]抗肿瘤效应的判断:
[0113]1.抗原位癌疗效判断:
[0114]a、活体肿瘤荧光定量法:上述4T1细胞带有Luciferase基因，故4Tl_Luc肿瘤大小可经向麻醉荷瘤小鼠腹腔灌注Luciferin底物，5分钟后测定荧光强度；
[0115]b、游标卡尺测定肿瘤直径；这两种方法均能客观反应肿瘤大小。[0116]2.抗肺转移癌疗效:由于实验性Lewis肺癌生长速度快，癌结节迅速融合成片，无法计算结节数目，故以全肺称重计算结果。
[0117]经过实施例1制备的肿瘤抗原免疫后的小鼠，再接受活肿瘤细胞的静脉注射或皮下注射形成转移癌和原位癌，供抗肿瘤效应的研究。
[0118]实验结果如下:[0119]1.对原位癌的杀伤抑制作用
[0120]如图4所示,荷瘤Balb/c小鼠肿瘤突光活体成像所示,与对照组(佐剂免疫)及原有方法制备的瘤苗(佐剂+灭活肿瘤细胞)组相比，实施例1制备的疫苗组肿瘤个数少，且体积小。
[0121]肿瘤生长曲线(图5)表明新型瘤苗免疫组原位癌生长速度较原有瘤苗制备法免疫组、单独佐剂组、及生理盐水组明显缓慢(P〈0.01)，该实验经过三次重复均获得相似结果(图6、图7)。值得注意的是，4T1-LUC细胞增长最快的肿瘤不能为Taxol 5mg/kg (每日注射)所抑制，却能被本发明方法制备的疫苗所抑制。
[0122]2.对肺转移癌的杀伤抑制
[0123]转移是肿瘤致死的主要原因，为探讨本发明疫苗对转移性肿瘤的杀伤抑制作用，将Lewis肺癌细胞在同源性C57BL/6小鼠上的实验性肺转移作为检测模型。
[0124]常规市售的C57BL/6小鼠(8周龄、雌性、5只/组)分为四组:
[0125]A、生理盐水对照组，以生理盐水皮下注射模拟免疫过程；
[0126]B、佐剂对照组，只接受佐剂而无肿瘤细胞抗原；
[0127]C、新方法(新型瘤苗)组，佐剂+处理后的肿瘤抗原；
[0128]D、Taxol组(紫杉醇组):常规化疗药，作为阳性对照组。
[0129]四组小鼠均在接受不同免疫处理后21天，经静脉注入I X IO5个活Lewis肺癌细胞。23天后，称量小鼠肺肿瘤重量，得到均值和标准差。
[0130]结果表明(图8):三个对照组(无免疫、佐剂、Taxol)之间的肺重量无差异，Taxol5mg/Kg不能抑制住Lewis肺肿瘤的生长；但新方法(新型瘤苗)组却使肿瘤减少400mg,t-test分析表明该数据具有统计学差异(p=0.0069)。
[0131]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种制备自体肿瘤疫苗的方法，其特征在于，包括步骤: (1)获得分离的自体肿瘤细胞； (2)用放射法和/或加热法处理步骤(1)的自体肿瘤细胞，获得抗原性和抗原提呈性增强的肿瘤细胞； (3)对步骤(2)获得的肿瘤细胞进行灭活处理，获得灭活的肿瘤细胞； (4)将步骤(3)获得的灭活的肿瘤细胞制备为自体肿瘤疫苗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤为:实体瘤或非实体瘤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述获得分离的自体肿瘤细胞的方法选自下组:用酶消化法、机械剪切法、或人工磨碎肿瘤组织法将肿瘤组织处理为可培养的分离的自体肿瘤细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的放射法选自下组:用选自α，β、Y、质子、或重离子放射线、以任选自0.l_50Gy剂量范围、任选自0.Ι-lOGy/min剂量率，处理步骤(1)的自体肿瘤细胞，获得抗原性和抗原提呈性增强的肿瘤细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的加热法选自下组:加热温度任选自37.50C -500C (优选38°C _45°C )，加热时间任选自lmin-2小时(优选30min_l小时)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)和步骤(3)之间，还包括步骤:对步骤(2)获得抗原性和抗原提呈性增强的肿瘤细胞进行培养处理。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的灭活处理选自下组:微波细胞灭活法、电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法、高温细胞灭活法、超声破碎细胞灭活法、反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法、酶学消化细胞灭活法、低渗破裂法、或其组合。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，将步骤(3)获得的灭活的肿瘤细胞与佐剂混合，获得自体肿瘤疫苗。
9.一种自体肿瘤疫苗，其特征在于，所述疫苗是用权利要求1所述的方法制备的。
10.权利要求9所述自体肿瘤疫苗的用途，其特征在于，它被用于制备预防或治疗肿瘤的组合物。
【文档编号】A61K39/00GK103800896SQ201210466990
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月15日 优先权日:2012年11月15日
【发明者】韩德平, 林建华, 张鲁榕, 张美 , 张震寰, 张亨山, 吕文龙, 洪金省 申请人:厦门鹭佳生物科技有限公司