一种高细胞毒活性cik细胞及在肿瘤细胞免疫治疗中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种高细胞毒活性CIK细胞及在肿瘤细胞免疫治疗中的应用，该CIK细胞通过如下步骤制备：(1)取患者外周血，收集外周血单个核细胞部分；(2)将步骤(1)收集的外周血单个核细胞部分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；(3)取单个核细胞按照1×106/mL细胞，加入含500～2000IU/mLγ干扰素和80～120ng/mL化合物(Ⅰ)的完全培养基，开始诱导培养；完全培养基包括含体积百分比为10％FBS的RPMI 1640细胞培养液；(4)步骤(3)的细胞培养20～28小时后，加入50～1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500～2000IU/mL重组人IL?2，继续诱导培养，每隔2～3天传代培养一次，诱导培养时间为13～21天，获得CIK细胞。该CIK细胞可用于肿瘤细胞免疫治疗。
【专利说明】
一种高细胞毒活性CIK细胞及在肿瘤细胞免疫治疗中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于细胞免疫领域，具体涉及一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性 CIK细胞以及制备该高细胞毒活性CIK细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 免疫治疗作为肿瘤综合治疗的第四种模式，越来越受到重视。肿瘤免疫治疗主要 包括肿瘤疫苗治疗、细胞因子治疗、过继性细胞免疫治疗及单克隆抗体免疫治疗等。肿瘤疫 苗是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体 的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发。用于抗肿瘤研究的细胞因子主要有干扰素类、 白细胞介素类、集落刺激因子类等，其中以IFN-α、IL-2、粒-巨噬细胞集落刺激因子为多。过 继性细胞免疫包括淋巴细胞因子活化的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、DC-CIK等。单克隆抗体免疫疗法的现有研究结果表明，肿瘤分子靶向治疗具有较好的安全性和 有效性，如小分子表皮生长因子受体(EGFR)、酪氨酸激酶抑制剂、抗EGFR单克隆抗体、抗血 管内皮生长因子单克隆抗体以及其他分子靶向治疗药物，已在临床中取得较好的疗效。
[0003] 目前用于肿瘤细胞免疫治疗的免疫活性细胞主要有肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、 树突状细胞(DC)以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)等。CIK细胞是一种杀伤力强的免疫活 性细胞，其主要效应细胞的表面标志为CD3+CD56+，与其他过继性免疫治疗细胞相比，具有增 殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。但是，肿瘤病人免疫功能受损，免疫细胞功能减 弱，因此，来源于肿瘤病人外周血制备的CIK细胞杀伤肿瘤能力低下，影响CIK细胞疗效。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞以及 制备该高细胞毒活性CIK细胞的方法，该CIK细胞具有很强的增殖力，⑶3+、⑶8+和⑶3+⑶56+ 细胞的比例高，并且对肿瘤治疗效果优异。
[0005] 上述目的是通过如下技术方案实现的：
[0006] -种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞，通过如下步骤制备：（1)取 患者外周血，收集外周血的单个核细胞部分；（2)将步骤（1)收集的外周血的单个核细胞部 分离心，弃去上清液，获得单个核细胞；（3)取单个核细胞按照1 X 106/mL细胞，加入含500~ 2000IU/mLy干扰素和80~120ng/mL如下结构所示化合物（I)的完全培养基，开始诱导培 养;其中，完全培养基，包括含体积百分比为1 〇 %FBS的RPMI 1640细胞培养液；（4)步骤(3) 的细胞培养20~28小时后，加入50~1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500~2000IU/mL重 组人IL-2,继续诱导培养，其中，每隔2~3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13~21 天，获得高细胞毒活性CIK细胞;化合物(I)结构为：
[0008] 进一步地，步骤（1)所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为：（a)患者外周血 中，加入1~1.5倍体积的不含血清的细胞培养液或pH7.2PBS缓冲液稀释，充分混匀；其中， 细胞培养液包括:RPMI1640培养液和頂DM培养液；（b)将步骤(a)获得的血液稀释液加入到 淋巴细胞分离液的界面上；（c)1500~2500转/分钟，离心15~20分钟，收集中间层，获得单 个核细胞。
[0009] 进一步地，步骤（1)中所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为:患者经采用血 细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集患者的外周血单个核细胞。
[0010] 进一步地，步骤⑵中，离心的转速为1〇〇〇~1500转/分钟，离心的时间为7~10分 钟。
[0011] 进一步地，步骤(4)所述继续诱导培养，每2~3天用含500~2000IU/mL重组人IL-2 的完全培养基或含500~2000IU/mL重组人IL-2和100~500IU/mL重组人IL-1的完全培养基 传代培养。
[0012] 上述化合物(I)在制备高细胞毒活性的CIK细胞中的应用。
[0013] 上述用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应 用。
[0014] 有益效果：
[0015] 本发明提供了一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞以及制备该高 细胞毒活性CIK细胞的方法，该CIK细胞具有很强的增殖力，CD3+、⑶8+和⑶3+⑶56+细胞的比 例高，并且对肿瘤治疗效果优异，可用于肿瘤的细胞免疫治疗。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。以下实施例中，所用的原料或 试剂除特别说明外，均为市售可得。所述患者指需要进行CIK细胞免疫治疗的患者，如癌症 患者。另外，以下实施例中，涉及的完全培养基为含10 % (体积百分比)FBS的RPMI 1640培养 液;冷冻保护剂是含10 % (体积百分比）DMS0的培养基，其中，该培养基是由70 % (体积百分 比)RPMI1640培养液和20% (体积百分比)FBS(胎牛血清)所构成。化合物（I)自制。
[0017] 实施例1 :CIK细胞的诱导制备和检测
[0018] 一、CIK细胞的诱导制备
[0019] (1)取患者外周血30mL加入等体积RPMI 1640培养液（Invitrogen公司），充分混 匀。
[0020] (2)将步骤（1)获得的倍比稀释的外周血60mL，加入到30mL淋巴细胞分离液(上海 华精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破坏界面），以2000转/分钟，离心20 分钟，取中间层一富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20mL。取少量细胞进行细胞计数 及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99 %。
[0021 ] (3)将步骤(2)获得的含有完全培养基的白膜层，以1000转/分钟，离心10分钟，弃 上清液，沉淀为单个核细胞。
[0022] (4)加入完全培养基，细胞计数，用完全培养基调整单个核细胞浓度为1 X 106/mL。
[0023] (5)按照1 X 106/mL细胞，加入γ -IFN(Pepr〇teCh公司）和化合物（I)使其浓度分别 为1000 IU/mL和100ng/mL，置37 °C、5 % C〇2培养箱中，开始诱导培养。
[0024] (6)步骤(5)的细胞培养24小时后，在培养的细胞中，加入500ng/mL抗人CD3单克隆 抗体(Biolegend公司）和1000IU/mL重组人IL-2(Peprotech公司），置37°C、5%⑶2培养箱 中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。CIK细胞鉴定方法:细胞数量扩增，⑶3+CD56+双阳性标 志细胞数量升高，杀伤肿瘤细胞能力增强(非MHC限制性）。
[0025]其中，单个核细胞中加入γ -IFN和化合物（I)，经培养24小时后(诱导第1天），光镜 观察发现，细胞活化透亮，折光性强。在单个核细胞中加入抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2,经培养24小时后(诱导第2天），光镜观察发现，细胞聚集，并且有很多小集落开始形成，细 胞明显增大。
[0026] (7)诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含1000IU/mL重 组人IL-2的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测⑶3、⑶56、⑶4、 CD8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞活性。
[0027] (8)此后，每3天按照上述方法，传代一次，并做相同的检测。诱导培养的第19天终 止培养。以上方法均在严格无菌环境内进行。
[0028] 其中，在诱导第7天时，肉眼下即可观察到白色斑点，光镜下观察发现，细胞集落明 显增多、增大，大集落成黑团，看不清细胞形态，周边游离细胞饱满折光性好，大小形态各 异。
[0029] 二、按照以上方法进行诱导制备CIK细胞的相应检测结果
[0030] 1、检测CIK细胞扩增倍数
[0031] 检测方法为：按IX 1〇6单个核细胞/孔，接种在24孔板内，按照上述方法进行诱导 制备CIK细胞和细胞换液，第7天开始换成25平方厘米细胞培养瓶培养，对诱导的第0、4、7、 10、13、16、19天，取111^样本，通过血细胞计数仪（日本光电公司，1^1(-641(^)，进行(：11(细胞 扩增倍数检测，取5次试验结果的平均值，绘制生长曲线。从生长曲线可以看出，CIK细胞在 诱导培养的第4天开始增值，第7天到第16天进入快速增长期，16天后增殖速度趋缓，第19天 CIK细胞最高增殖637倍，最低286倍，平均增殖477.2倍。
[0032] 2、CIK细胞的杀伤K562肿瘤细胞活性的检测
[0033]患者外周血单个核细胞诱导制备的CIK细胞的杀伤K562肿瘤细胞活性的检测方法 为:取对数生长的K562肿瘤细胞，用含有体积百分比为10%FBS的頂DM培养液，调整细胞数 为5X104/mL，每孔100yL，铺于96孔板中，每组设4个复孔。取第7、10、13、16、19天(：11(细胞， 及未经培养的单个核细胞，用完全培养基调整诱导的CIK细胞数为1 X 106/mL，取100yL加入 96孔板中，效靶比（即CIK细胞:K562肿瘤细胞)20:1，设空白对照组、效应细胞对照组和靶细 胞对照组，置37 °C、5 %C02培养箱中，培养48小时后，加入20yL CCK-8(日本同仁化学研究所 产品），继续孵育5小时，显黄色，采用Thermofisher公司mult iscanFC酶联仪，双波长，参比 波长620mm、检测波长450mm检测0D值。取4次试验结果的平均值，绘制杀伤率曲线。
[0034]杀伤率的计算公式为:杀伤率（％ ) = [ 1 -(效靶细胞组0D值-效应细胞组0D值)/ (靶 细胞组0D值-空白对照组0D值）]X 100 %。其中，
[0035] 效靶细胞组0D值为：CIK细胞和K562靶细胞组检测的波长450nm0D值一波长 620nm0D 值。
[0036] 效应细胞组0D值为:单纯CIK细胞检测的波长450nm0D值一波长620nm0D值。
[0037] 靶细胞组0D值为:K562靶细胞组检测的波长450nm0D值一波长620nm0D值。
[0038]空白对照组0D值为：完全培养基和10 % FBS的IMDΜ培养液混合后，检测的波长 450nm0D 值一波长620nm0D 值。
[0039] 由杀伤率曲线可知，单个核细胞经过1-19天的诱导，第7天，CIK细胞杀伤靶细胞 K562活性最高，平均达96.8%，此后逐步下降，第19天最低，平均83.5%。
[0040] 3、流式细胞仪进行诱导的CIK细胞检测
[0041] 采用流式细胞仪(BD公司FACS Calibur)，对诱导前的外周血单个核细胞和诱导后 的第19天进行⑶3、⑶4、⑶8、⑶3CD56检测。结果:诱导CIK细胞前，外周血单个核细胞的⑶3+ 为52 · 84%，CD4+为36 · 58%，CD8+为24 · 98 %，CD3+CD56+为 1 · 35 % ;诱导CIK细胞的第 19天， CD3+为98 · 91 %，CD4+为 1 · 56 %，CD8+为91 · 37 %，CD3+CD56+为63 · 72 %。
[0042] 4、CIK细胞表型测定
[0043] 用pH7.4的1 X roS调整细胞密度至1 X 106/mL，加入到流式细胞检测管中，200yL/ 管，分别加入不同荧光标记的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗体(BD公司），置 暗处，4°C标记20分钟，ρΗ7.4的1 X PBS洗涤2次，1500转/分钟，离心5分钟，1 %甲醛固定后， 用流式细胞仪检测。取5次试验结果的平均值，结果见表1。从表1可以看出，随着诱导时间的 延长，CIK主要效应细胞CD3 + CD56 +双阳性细胞所占比例大幅上升，第19天达到均数为 58.8%，范围为52·3%-65·3%。
[0044] 表1单个核细胞诱导CIK细胞表型的变化(X土S，％ )
[0046]实施例2: CIK细胞的诱导制备
[0047] (1)取患者外周血30mL加入等体积RPMI 1640培养液（Invitrogen公司），充分混 匀。
[0048] (2)将步骤（1)获得的倍比稀释的外周血60mL，加入到30mL淋巴细胞分离液(上海 华精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破坏界面），以1500转/分钟，离心20 分钟，取中间层一富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20mL。取少量细胞进行细胞计数 及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99 %。
[0049] (3)将步骤(2)获得的含有完全培养基的白膜层，以1500转/分钟，离心7分钟，弃上 清液，沉淀为单个核细胞。
[0050] (4)加入完全培养基，细胞计数，用完全培养基调整单个核细胞浓度为1 X 106/mL。
[00511 (5)按照1 X 106/mL细胞，加入γ -IFN(Pepr0teCh公司）和化合物（I)使其浓度分别 为500IU/mL和80ng/mL，置37 °C、5 % C02培养箱中，开始诱导培养。
[0052] (6)步骤(5)的细胞培养20小时后，在培养的细胞中，加入50ng/mL抗人CD3单克隆 抗体(Biolegend公司）和500IU/mL重组人IL-2(Peprotech公司），置37°C、5 %C02培养箱中， 继续诱导培养，从而获得CIK细胞。CIK细胞鉴定方法:细胞数量扩增，⑶3+⑶56+双阳性标志 细胞数量升高，杀伤肿瘤细胞能力增强(非MHC限制性）。
[0053]其中，单个核细胞中加入γ -IFN和化合物（I)，经培养24小时后(诱导第1天），光镜 观察发现，细胞活化透亮，折光性强。在单个核细胞中加入抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2,经培养24小时后(诱导第2天），光镜观察发现，细胞聚集，并且有很多小集落开始形成，细 胞明显增大。
[0054] (7)诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含500IU/mL重 组人IL-2的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测⑶3、⑶56、⑶4、 CD8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞活性。
[0055] (8)此后，每3天按照上述方法，传代一次，并做相同的检测。诱导培养的第19天终 止培养。以上方法均在严格无菌环境内进行。
[0056] 本实施例获得CIK细胞具有和实施例1近似的生物学性质和生物活性。
[0057]实施例3: CIK细胞的诱导制备和检测
[0058] (1)取患者外周血30mL加入等体积RPMI 1640培养液（Invitrogen公司），充分混 匀。
[0059] (2)将步骤（1)获得的倍比稀释的外周血60mL，加入到30mL淋巴细胞分离液(上海 华精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破坏界面），以2500转/分钟，离心15 分钟，取中间层一富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20mL。取少量细胞进行细胞计数 及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99 %。
[0060] (3)将步骤(2)获得的含有完全培养基的白膜层，以1500转/分钟，离心7分钟，弃上 清液，沉淀为单个核细胞。
[0061 ] (4)加入完全培养基，细胞计数，用完全培养基调整单个核细胞浓度为1 X 106/mL。
[0062] (5)按照1 X 106/mL细胞，加入γ -IFN(Pepr〇teCh公司）和化合物（I)使其浓度分别 为2000IU/mL和120ng/mL，置37°C、5 % C02培养箱中，开始诱导培养。
[0063] (6)步骤(5)的细胞培养28小时后，在培养的细胞中，加入1000ng/mL抗人CD3单克 隆抗体(Biolegend 公司）和 2000IU/mL 重组人 IL-2(Peprotech 公司），置 37°C、5%C02 培养箱 中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。CIK细胞鉴定方法:细胞数量扩增，⑶3+CD56+双阳性标 志细胞数量升高，杀伤肿瘤细胞能力增强(非MHC限制性）。
[0064]其中，单个核细胞中加入γ -IFN和化合物（I)，经培养24小时后(诱导第1天），光镜 观察发现，细胞活化透亮，折光性强。在单个核细胞中加入抗人CD3单克隆抗体和重组人IL-2,经培养24小时后(诱导第2天），光镜观察发现，细胞聚集，并且有很多小集落开始形成，细 胞明显增大。
[0065] (7)诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含2000IU/mL重 组人IL-2和300IU/mL重组人IL-1的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细 胞仪检测⑶3、⑶56、⑶4、⑶8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞活性。
[0066] (8)此后，每3天按照上述方法，传代一次，并做相同的检测。诱导培养的第19天终 止培养。以上方法均在严格无菌环境内进行。
[0067] 本实施例获得CIK细胞具有和实施例1近似的生物学性质和生物活性。
[0068] 实施例4:实施例1的对比实例，不添加化合物(I)
[0069] (1)取患者外周血30mL加入等体积RPMI 1640培养液（Invitrogen公司），充分混 匀。
[0070] (2)将步骤（1)获得的倍比稀释的外周血60mL，加入到30mL淋巴细胞分离液(上海 华精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破坏界面），以2000转/分钟，离心20 分钟，取中间层一富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20mL。取少量细胞进行细胞计数 及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99 %。
[0071 ] (3)将步骤(2)获得的含有完全培养基的白膜层，以1000转/分钟，离心10分钟，弃 上清液，沉淀为单个核细胞。
[0072] (4)加入完全培养基，细胞计数，用完全培养基调整单个核细胞浓度为1 X 106/mL。
[0073] (5)按照lX106/mL细胞，加入 y-IFN(Peprotech公司）使其浓度为 1000IU/mL，置 37 °C、5 % C02培养箱中，开始诱导培养。
[0074] (6)步骤(5)的细胞培养24小时后，在培养的细胞中，加入500ng/mL抗人CD3单克隆 抗体(Biolegend公司）和1000IU/mL重组人IL-2(Peprotech公司），置37°C、5%⑶2培养箱 中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。其中，单个核细胞中加入γ -IFN，经培养24小时后(诱 导第1天），光镜观察发现，细胞折光性一般。在单个核细胞中加入抗人CD3单克隆抗体和重 组人IL-2,经培养24小时后(诱导第2天），光镜观察发现，细胞有一定程度的聚集，零零散散 有小集落开始形成，细胞略有增大。
[0075] (7)诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含1000IU/mL重 组人IL-2的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测⑶3、⑶56、⑶4、 CD8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞活性。
[0076] (8)此后，每3天按照上述方法，传代一次，并做相同的检测。诱导培养的第19天终 止培养。以上方法均在严格无菌环境内进行。
[0077] 该实施例制备的CIK细胞的相应检测结果表明：
[0078] (l)CIK细胞在诱导培养的第4天开始增值，第7天到第16天进入快速增长期，16天 后增殖速度趋缓，第19天CIK细胞最高增殖313倍，最低35倍，平均增殖174倍，显著低于实施 例1制备方法制备的CIK细胞。
[0079] (2)单个核细胞经过1-19天的诱导，第7天，CIK细胞杀伤靶细胞K562活性最高，平 均达54.1 % (范围54.1 ±3.3%)，此后逐步下降，第19天最低，平均36% (范围36±7.5%)， 对靶细胞K562的杀伤率明显不及实施例1。
[0080] (3)采用流式细胞仪(BD公司FACS Calibur)，对诱导前的外周血单个核细胞和诱 导后的第19天进行003、004、008、0030056检测。结果:诱导(：11(细胞前，外周血单个核细胞的 CD3+为52.84%，CD4+为36.58%，CD8+为24.98%，CD3+CD56+为 1.35% ;诱导CIK 细胞的第19 天，CD3+为68 · 81 %，CD4+为2 · 03%，CD8+为44 · 77%，CD3+CD56+为22 · 54%，显著不及实施例 1。
[0081 ] (4)用pH7 · 4的1 X ros调整细胞密度至1 X 106/mL，加入到流式细胞检测管中，200μ L/管，分别加入不同荧光标记的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗体(BD公司）， 置暗处，4°C标记20分钟，ρΗ7.4的1 X roS洗涤2次，1500转/分钟，离心5分钟，1 %甲醛固定 后，用流式细胞仪检测。结果表明随着诱导时间的延长，CIK主要效应细胞CD3+CD56+双阳性 细胞所占比例上升不明显。
[0082]对比实施例4和实施例1可发现，化合物（I)可协同γ干扰素诱导产生高纯度、高增 殖力、高细胞毒活性的CIK细胞。
[0083]上述实例中，收集外周血的单个核细胞部分的方法也可以为:采用COBE Spectra 型血细胞分离机(Gambro BC公司）上的淋巴细胞采集程序，单采正常人外周血单个核细胞 30mL〇
[0084]实施例5:化合物(I)的分离制备和结构确证
[0085]分离方法：（a)将黄连（2kg)粉碎，用85%乙醇热回流提取（15LX 3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水饱和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用30%乙醇洗脱6个柱体积，再用85%乙醇洗脱 12个柱体积，收集85%洗脱液，减压浓缩得85%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中85%乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为100:1 (12个柱体积）、50:1 (10个柱体积）、25:1 (8个柱体积)和12:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组 分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(6个柱体积）、12:1(8个柱体积)和2:1(6 个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键 合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为88 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集13~16个柱体积 洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (HPLC归一化纯度大于98% )。
[0086] 结构确证:册431-]\^显示[]\?1]+为111/2 235.1983，结合核磁特征可得分子式为 C16H260，不饱和度为4。核磁共振氢谱数据δΗ(ΡΡπι，CDC1 3，500MHz): H-1 (5 · 75，dd，J = 12 · 4， 3.4Hz)，H-2(5.86，dd，J=12.4,5.8Hz)，H-3a(2.17，dd，J=13.2,3.4Hz)，H-3b(2.35，dd，J = 13·2,5·8Ηζ)，H-5(1.91，d，J=10.4Hz)，H-6(3.62，t，J=10.4Hz)，H-7(1.41，m)，H-8 (1.17，dddd，J=13.2，12.8，12.4,3.0Hz，2H)，H-9(1.04，ddd，J=13.2，12.6,3.3Hz)，H-9 (1.81，ddd，J=12.6,3.6,3.0Hz)，H-ll(2.11，m)，H-12(0.87，d，J = 6.8Hz)，H-13(0.94，d，J = 6.8Hz)，H-14(0.81，s)，H-15(4.79，s)，H-15(4.91，s)，H-16(3.18，s);核磁共振碳谱数 据3。（ ？？111，口74(^116-(15，12510^):134.5(01，1-〇，123.2(01，2-〇,37.7(012,3-〇，146.8 (C，4-C)，51.8(CH，5-C)，75.9(CH，6-C)，46·1(CH，7-C)，18·1(CH2,8-C)，36.9(CH 2,9-C)， 44.1(C，10-C)，25.9(CH，11-C)，16.1(CH3，12-C)，21.7(CH3，13-C)，11.9(CH 3，14-C)，108.9 (〇12，15-〇,52.1(〇13，16-〇。该化合物的氢谱中显示了两个双峰甲基61 10.87(3!1，(1，了 = 6.8他）和0.94(3!1，(1，1 = 6.8抱），一个单峰甲基5110.81(3!1，8)，一个环外亚甲基质子信号3 114.79(1!1，8)和4.91(1!1，8)，两个烯属次甲基质子信号61 15.75(1!1，(1(1，1=12.4,3.4泡）和 5.86(1!1，(1(1，1=12.4,5.8泡）以及一个连氧次甲基质子信号51 13.62(1!1，^=10.4抱）。在 该化合物的碳谱中，结合化合物的HSQC谱，可以观察到15个碳信号，其中有一个连氧碳信号 以及两组双键信号。通过以上的信息可以推测出该化合物可能为一个倍半萜类化合物。通 过查阅文献，发现该新化合物和已知化合物6a-methoxyeudesm-4(15)-en-10-〇l具有相似 的结构。比较两者的核磁数据可以发现，该化合物仅仅在c-l和C-2位附近的信号和已知化 合物6a-methoxyeudesm_4( 15)-θη_1β-〇1存在着很大的区别。进一步的HMBC谱解析，!1-2/0 l，H-5/C-l，H-14/C-l以及H-1/C-14的相关性说明该化合物在C-1和C-2位是一组双键。至 此，将该化合物的平面结构解析如下所示。NOESY谱中，H-5与H-7的相关性表明它们为β构 型，则C-7位的异丙基为a构型。此外，Η-6与Η-14的相关性表明两者为a构型，则C-6位的甲氧 基为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确 定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。
[0087]该化合物化学式及碳原子编号如下：
[0089]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞，其特征在于，通过如下步骤制 备：（1)取患者外周血，收集外周血的单个核细胞部分；（2)将步骤（1)收集的外周血的单个 核细胞部分离屯、，弃去上清液，获得单个核细胞；（3)取单个核细胞按照IX lOVmL细胞，加 入含500~2000IU/mL 丫干扰素和80~120ng/mL如下结构所示化合物（I)的完全培养基，开 始诱导培养;其中，完全培养基，包括含体积百分比为10%FBS的RPMI 1640细胞培养液；（4) 步骤（3)的细胞培养20~28小时后，加入50~lOOOng/mL抗人CD3单克隆抗体和500~ 2000IU/mL重组人IL-2，继续诱导培养，其中，每隔2~3天传代培养一次，整个诱导培养的时 间为13~21天，获得高细胞毒活性CIK细胞;化合物(I)结构为：2. 根据权利要求1所述的高细胞毒活性CIK细胞，其特征在于，步骤(1)所述收集外周血 的单个核细胞部分的方法为：（a)患者外周血中，加入1~1.5倍体积的不含血清的细胞培养 液或抑7.2PBS缓冲液稀释，充分混匀；其中，细胞培养液包括:RPMI1640培养液和IMDM培养 液；（b)将步骤(a)获得的血液稀释液加入到淋己细胞分离液的界面上；（c)1500~2500转/ 分钟，离屯、15~20分钟，收集中间层，获得单个核细胞。3. 根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞，其特征在 于，步骤(1)中所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为：患者经采用血细胞分离机上的 淋己细胞采集程序，单采集患者的外周血单个核细胞。4. 根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞，其特征在 于:步骤(2)中，离屯、的转速为1000~1500转/分钟，离屯、的时间为7~10分钟。5. 根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞，其特征在 于:步骤(4)所述继续诱导培养，每2~3天用含500~2000IU/mL重组人IL-2的完全培养基或 含500~2000IU/mL重组人比-2和100~500IU/mL重组人比-1的完全培养基传代培养。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备高细胞毒活性的CIK细胞中的应用。7. 权利要求1-5任一所述的用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性CIK细胞在制备抗 肿瘤药物中的应用。
【文档编号】C12N5/0783GK105969728SQ201610339160
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月21日
【发明人】丁露露
【申请人】丁露露