专利名称：一种cik细胞及其制备方法和细胞制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于体外细胞培养领域，特别涉及一种CIK细胞及其制备方法和 细胞制剂。
背景技术：
肿瘤生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗模式，CIK细胞 (Cytokine induced killer cell, CIK)治疗是目前国际上公认的最有效的肿瘤生 物治疗手段。
CIK细胞是在体外条件下，将人外周血单个核细胞用多种细胞因子(如 抗CD3McAb、 IL-2、 IFN-Y 、 IL-1等)共同培养一段时间后获得的一群异 质细胞。由于其主要效应细胞表面既有T细胞的表面标志(TCR- a / 3 ， CD3)， 也有NK细胞的表面标志(CD56)，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK 细胞的非MHC (主要组织相容性复合体)限制性杀瘤优点。CIK细胞中的 主要效应细胞CD3CD56细胞在正常人外周血中极为罕见，仅1% 5%，在 体外经多因子培养28 30天，CD3CD56细胞迅速增多，较培养前升幅达 1 000倍以上。将CIK细胞注入患者体内来治疗肿瘤，可以在没有损伤机体 免疫系统结构和功能的前提下，直接杀伤肿瘤细胞，并且调节和增强机体的 免疫功能，最大可能地恢复细胞正常的生长调节，为彻底地进行肿瘤治疗提 供了新的途径。CIK细胞治疗法是由美国斯坦福大学骨髓移植于1991年建 立(Schmidt-WolfIGH， etal. J. Exp. Med. 1991; 174:139-149)。目前该方法在 国内外肿瘤治疗中已得到广泛应用。与过去过继免疫治疗所使用过的淋巴因 子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer, LAK)和肿瘤浸润淋巴细胞 (tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)相比，CIK具有更强的细胞增殖能力和更强的抗肿瘤细胞作用，且毒副作用很小。
CIK细胞治疗肿瘤的疗效主要取决于输注细胞的数量和杀伤活性。因为 CIK细胞为一种以T淋巴细胞为主的异质细胞群，其中对肿瘤有杀伤作用的
主要是靠CD3+CD56+和CD8+这两种细胞，因此，提高CD3+CD56+和CD8+ 的比例以及提高体外培养CIK细胞的数量对提高肿瘤治疗效果非常重要。目 前传统的方法是将分离得到的患者外周血单个核细胞，用干扰素-Y刺激 24h，随后再用CD3单抗、IL-1 a 、 IL-2等剌激因子进行诱导。这些方法的 CIK细胞的增殖力较低，CIK细胞中的CD3+CD56+细胞、CD8+细胞的比例 不高，对肿瘤的治疗效果有待进一步提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的方法所得CIK细胞存在增殖 力较低，CD3+CD56+细胞、CD8+细胞的比例不高的不足，提供一种新的 制备方法以及所制得CIK细胞，该CIK细胞的增殖力较强，CD3+CD56+和 CD8+细胞的比例较高，具有更佳的治疗肿瘤的效果。
本发明人经过广泛的研究和反复试验发现1) CIK细胞制备中，干扰 素-Y刺激外周血单个核细胞(PBMC)后很多细胞会发生凋亡，也就是说干 扰素-Y刺激是造成这些细胞调亡的重要原因，这直接影响了细胞数量的扩 增，而植物血凝素(PHA)对PBMC的诱导效果和干扰素-Y相同，干扰素-Y可以完全由PHA代替用于制备CIK细胞；2)抗CD3单抗与抗CD28单 抗联合共同诱导CIK细胞，比抗CD3单抗一种单抗诱导的CIK细胞具有更 高的增殖力；3)将抗CD3单抗与抗CD28单抗包被在培养瓶壁上，比游离 状态的效果更好，所需的单抗总量降低，而又增加了CIK细胞的增殖力。因 此，本发明人从以上三方面对现有的CIK细胞制备方法进行改进，终于令人 惊喜的获得了增殖力强、CD3+CD56+和CD8+细胞的比例高、肿瘤的治疗效 果更好的CIK细胞，从而完成了本发明。因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是 一种制备 CIK细胞的方法，包括以下步骤将分离好的单个核细胞置于含有植物血凝
素的培养液中，培养24 72小时后，移植到包被有抗CD3单抗和抗CD28 单抗的培养瓶中，同时加入含IL-lci和IL-2的培养液，继续培养5 15天， 其中每隔2~3天分瓶培养一次。
根据本发明，所述的植物血凝素的终浓度较佳的为1U/ml。植物血凝素 可以刺激培养24 72小时，较佳的刺激48小时。因为一般情况，T淋巴细 胞的增殖周期是48 60小时，因此刺激48小时，就能够保证细胞开始增殖。 所述的培养液较佳的是GT-T503或1640培养基。所述的抗CD3单抗和抗 CD28单抗较佳的包被密度是采用两种单抗的浓度各为1~2 pg/ml的包被液 包被。当包被浓度小于1 )Lig/ml，对细胞增殖有影响，增殖倍数降低；大于 2pg/ml后对提高增殖倍数没有明显影响，由于抗CD3、 CD28单抗价格昂贵， 增大浓度就将增加成本，最佳的浓度为1吗/ml。所述的IL-1 ct的终浓度较 佳的为20U/ml， IL-2的终浓度较佳的为300U/ml。继续培养5~15天，最佳 的继续培养10天。一般继续培养20天以后CIK细胞的增殖力、CD3+CD56+、 CD8+两种细胞的比例不会再增加，15天后CIK细胞的杀伤能力将逐渐下降， 因此选择15天收获细胞，进行临床应用。继续培养到细胞密度达到3 5 X 108 细胞/ml时，较佳的应该分瓶培养， 一般每隔2~3天分瓶培养一次，较佳的 每2天就分瓶培养。
本发明解决上述技术问题所釆用的技术方案之二是 一种如上所述的方 法所制备的CIK细胞。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是 一种CIK细胞制 剂，包括CIK细胞和IL-2，其中，所述的CIK细胞为如上所述的CIK细胞。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。 本发明制备出的CIK细胞的生物学特性 (1)细胞组成T淋巴细胞(CD3+)大于90%。 T淋巴细胞中各亚群围， 一般为CD3+CD56+细胞为40~60%， CD8+细胞为65 85%， CD3-CD56+细胞为25~45%。
(2) 增殖数量高新型人体CIK细胞培养方法扩增的数量比传统CIK 细胞明显强大，体外培养10天后前者细胞的扩增数是后者的3~5倍，是LAK 细胞的100倍左右。
(3) 杀瘤活性高用MTT法检测二者的杀伤活性，结果新型人体 CIK细胞培养方法诱导出的CIK细胞比传统CIK细胞明显强大，前者是后 者的3 5倍。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下该方法制备出的CIK细胞具 有细胞增殖明显提高，CD8细胞比例较大增加，抗瘤谱广，杀瘤活性增强等 特点。对手术后的肿瘤患者可有效预防转移复发；与放化疗联合应用可降低 前者的毒副作用，增强患者耐受性，提高疗效；对晚期患者可明显延长生命 周期，提高生活质量。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建 议的条件。
实施例1本发明的CIK细胞的制备
(1) 外周血单个核细胞(PBMC)采集制备 用血细胞分离机在无菌条件下采集肿瘤患者抗凝血，生理盐水对倍稀
释，比重为1.077的淋巴细胞分离液(中科院天津血研所生物科技公司产品) 与稀释血按l: 2加入离心管中，离心2500 rpm/30min，分离得PBMC，用 Hanks液洗涤2次，用无血清培养液GT-T503调整细胞浓度，使得细胞浓度 为2Xl()S细胞/ml的细胞悬液。
(2) 本发明的新型人体CIK细胞诱导与扩增
6将分离获得的细胞悬液置于含有PHA(植物血凝素)IO U/ml的GT-T503 培养液中，放入225cn^的培养瓶(美国CORNING公司)中，150 ml/瓶， 置入37。C， 5% (v/v) C02培养箱中培养48h，移植到包被有抗CD3单抗 和抗CD28单抗的225cm2的培养瓶中，同时加入CIK细胞诱导液(含终浓 度100 U/ml的IL-1 a禾n 100 U/ml的IL-2的GT-T503培养液)继续培养48 h， 每24 h观察细胞生长情况，并做细胞计数。离心去上清，在如上包被的225cm2 的培养瓶中用上述CIK细胞诱导液调整细胞浓度为2Xl(^细胞/ml继续培 养。每隔48小时，按上述细胞密度分瓶扩增培养一次，培养十天后收获细 胞(共分瓶扩增培养5次)。
其中的抗CD3、 CD28单抗包被方法为在GT-T503培养液中加入抗 CD3、 CD28单抗(美国Sigma公司)，制备成抗CD3、 CD28单抗浓度分别 为l pg/ml的包被液，将50 ml该包被液置入225cmn咅养瓶中，4。C过夜或 37°C4h，弃去包被液，将培养瓶口旋紧备用。
对比例1传统的CIK细胞的制备
按照参考文献(任欢，邢淑贤等CIK细胞体外增殖及体内外杀瘤活性 的实验研究，中国肿瘤生物治疗杂志。1999， 6(1): 17-21)中的方法进行传 统CIK细胞培养分离外周血PBMC细胞，将分离的细胞置入含有干扰素-Y (浓度为1000U/ml)，浓度5% (v/v) C02培养箱中培养24小时，加入抗 CD3单抗(10jig/ml)， IL-la (100U/ml)， IL-2 (100U/ml)据细胞生长情 况进行扩增，IO天后收获即为CIK细胞。
实施例2 CIK细胞各指标的检测
1) 无菌试验和热源检测
实施例1和对比例1收获的CIK细胞，无菌试验和热源检测均为阴性。
2) 表型检测
用流式细胞仪检测细胞表型。
表型检测结果，实施例1收获的CIK细胞中，T淋巴细胞(CD3+细胞)占细胞总数的90%以上。其中，T淋巴细胞中各亚群的比例因个体差异有一
定变化范围CD3+CD56+细胞的比例为40~60%， CD8+细胞的比例为 65~85%， CD3-CD56+细胞的比例为25~45%。对比例1收获的CIK细胞中， CD3+CD56+细胞的比例是25 35%; CD8+细胞的比例是45~60%。
3) 活细胞计数检测
检测方法为常规从培养瓶中吸取0.1ml培养液，对其所含的CIK细胞 用台盼兰进行染色，活细胞被染成兰色，死细胞不能被染色，在显微镜下计 数200个细胞，看被染色细胞的比例。
活细胞计数检测结果50ml外周血分离出PBMC，按实施例1收获的 CIK细胞数为8乂109细胞；按对比例1收获的CIK细胞数为2乂109细胞。 可见，本发明的人体CIK细胞培养方法诱导出的CIK细胞比传统CIK细胞 明显强大，前者是后者的3 5倍。
4) MTT法检测CIK细胞的杀伤活性
将CIK细胞与肿瘤细胞共同培养(实验用肿瘤细胞株有两种1、对NK 敏感的K562肿瘤株；2、对NK不敏感的HL-60肿瘤株)，培养6小时后， 用MTT法检测肿瘤细胞死亡比例来比较杀瘤活性。结果换算为杀瘤单位 (LU)。
实施例1的CIK细胞为31LU/l(f细胞，对比例1的传统CIK细胞杀瘤 单位为23 LU/1()6细胞。
实施例3本发明的新型CIK细胞制剂
将实施例1中体外培养10天后收获的CIK细胞置入50 ml离心管中， 离心1000 rpm/10min，收集1乂101()细胞，生理盐水洗涤--次，弃上清液， 用生理盐水将沉淀细胞打均，转移到100ml输液瓶中，加IL-2 50万单位， 注射用生理盐水100ml，制备成细胞悬液，留样，进行指标检测。CIK细胞 活率记数大于95%，细菌检测、热源检测均为阴性的为合格。合格者加盖封 口，低温保存待用。实施例4肿瘤患者治疗
1、 治疗对象肝癌中、晚期无法手术患者ll例，年龄47~73岁，男性 10例，女性1例。所有患者均进行过化疗，病情未得到有效控制。血清肿瘤
标志物甲胎蛋白在400U/L以上。患者预期生存大于3个月；重要生命器官 正常；无严重细菌感染；无生物制品过敏史。上述是经无锡东方肿瘤医院诊 断确诊的患者。
2、 治疗过程所有患者均在化疗终止后15天采用实施例3所得的CIK 细胞静脉输注进行治疗。每天一次，5天为一个疗程，每次输注CIK细胞为 1乂109细胞。第一疗程完成后的第三个月进行第二疗程治疗，每患者接受两 个疗程治疗。
3、 疗效评估
1) 影象学指标(CT指标)
CIK细胞治疗疗效评定采用WHO通用实体瘤疗效评定标准。完全缓解
(CR):可测量的病灶完全消失，维持4周以上；部分缓解(PR):可测量
的病灶最大直径及最大垂直横径的乘积縮小一半及以上，无新病灶出现；好 转(MR):可测量的病灶两径乘积縮小25 50%，无新病灶出现；稳定(SD)-可测量的病灶两径乘积縮小<25%或增大<25%，无新病灶出现；进展(PD): 可测量的病灶两径乘积增大>25%，或出现新的病灶。有效率={ (CR+PR) /治疗病人总数}乂100%。
2) 血清动态肿瘤标志物(甲胎蛋白)检测
治疗前、治疗后每月进行一次检测，甲胎蛋白不再升高、稳定或持续下 降为有效。
3) 生命质量评分
按照国际通行标准KPS评分方法，对患者治疗前、后动态生命质量进
行评分，分数增加为有效。
4) 免疫功能检测对患者治疗前、后动态T淋巴细胞亚群进行检测，观察T淋巴细胞亚群变化情况，反映患者免疫功能恢复情况。 5、结果治疗后影象学指标CR0例、PR3例，MR4例，SD2例，PD2例。 有效率=3/11X100% = 27.2%。甲胎蛋白检测结果下降6例，稳定3例，升高2例。甲胎蛋白呈动态 下降，其中3例患者在第二疗程治疗后，甲胎蛋白降到正常植。结果表明80% 患者对治疗有反应，病情不再进展或好转。生命质量评分7例升高，2例稳定，2例降低。T细胞亚群检测治疗前，11例患者中有8例T细胞亚群异常，治疗后 有5例患者恢复正常，占72%。
权利要求
1、一种制备CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤将分离好的单个核细胞置于含有植物血凝素的培养液中，培养24～72小时后，移植到包被有抗CD3单抗和抗CD28单抗的培养瓶中，同时加入含IL-1α和IL-2的培养液，继续培养5～15天，其中每隔2～3天分瓶培养一次。
2、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物血凝素的终浓度为1 U/ml。
3、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养液是GT-T503或1640培养基。
4、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗CD3单抗和抗CD28单抗的包被密度是采用两种单抗的浓度各为1~2 pg/ml的包被液包被。
5、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的IL-la的终浓度为20 U/ml，所述的IL-2的终浓度为300 U/ml。
6、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞密度达到3~5Xl()S细胞/ml时，就分瓶培养。
7、 一种如权利要求1~6任一项所述的方法所制备的CIK细胞。
8、 一种CIK细胞制剂，包括CIK细胞和IL-2，其特征在于，所述的CIK细胞为如权利要求7所述的CIK细胞。
全文摘要
本发明公开一种CIK细胞及其制备方法和细胞制剂。该制备CIK细胞的方法，包括以下步骤将分离好的单个核细胞置于含有植物血凝素的培养液中，培养24～72小时后，移植到包被有抗CD3单抗和抗CD28单抗的培养瓶中，同时加入含IL-1α和IL-2的培养液，继续培养5～15天，其中每隔2～3天分瓶培养一次。该方法制备出的CIK细胞具有细胞增殖明显提高，CD8细胞比例较大增加，抗瘤谱广，杀瘤活性增强等特点。对手术后的肿瘤患者可有效预防转移复发；与放化疗联合应用可降低前者的毒副作用，增强患者耐受性，提高疗效；对晚期患者可明显延长生命周期，提高生活质量。
文档编号A61K35/14GK101519646SQ200910045790
公开日2009年9月2日 申请日期2009年2月6日 优先权日2009年2月6日
发明者鸣 徐 申请人:上海德嘉生物科技有限公司;徐 鸣