抗肝纤维化的干细胞制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗肝纤维化的干细胞制剂及其制备方法，其中，所述抗肝纤维化的干细胞制剂包括：间充质干细胞；维生素A；白鲜皮内酯；PBS缓冲液；在所述抗肝纤维化的干细胞制剂中，所述间充质干细胞的浓度为(1～5)×107个/ml，所述维生素A的浓度为20～100ng/ml，所述白鲜皮内酯的浓度为20～100mg/ml。本发明抗肝纤维化的干细胞制剂可以有效减轻肝脏炎症程度，逆转肝纤维化，促进肝功能恢复；且可以有效抑制肝星状细胞增殖，进而抑制肝纤维化形成。
【专利说明】
抗肝纤维化的干细胞制剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及干细胞与组织工程领域，尤其涉及一种抗肝纤维化的干细胞制剂及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化是肝硬化的前期阶段，具体是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常 增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉积的病理过程;而肝硬化则是过度纤维化使肝脏 萎缩变硬所导致的。
[0003] 在肝纤维化进程中，肝星状细胞的活化是关键事件。胶原纤维等细胞外基质多是 由肝星状细胞活化而成的肌成纤维细胞产生的。许多病因造成的肝损伤都能引起肝星状细 胞(Hepatic Stellate Cell，HSC)的活化--即由静止型HSC转变为具有增殖性、成纤维性 和收缩性的肌成纤维细胞（即活化型HSChHSC活化是一个高效有序并且可复现的过程，大 致可分为两个阶段:始动阶段和持续阶段。始动阶段出现能使HSC对细胞因子和其他局部刺 激因子具有反应性的基因表达及快速的表型变化;持续阶段即通过旁分泌或自分泌刺激和 细胞外基质重建，进一步放大HSC的表型变化，维持其活化状态，促使纤维生成。然而，临床 上尚无确切有效的抑制肝星状细胞的抗纤维化药物，肝纤维化仍缺乏有效治疗手段。
【发明内容】
[0004] 本发明的主要目的在于提供一种抗肝纤维化的干细胞制剂，旨在抑制肝星状细胞 而治疗肝纤维化。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供一种抗肝纤维化的干细胞制剂，所述干细胞制剂包 括：
[0006] 间充质干细胞；白鲜皮内酯；维生素 A;细胞制剂用溶液;在所述干细胞制剂中，所 述间充质干细胞的浓度为（1~5) X 107个/ml，所述白鲜皮内酯的浓度为20~100mg/ml，所 述维生素 A的浓度为20~100ng/ml。
[0007] 优选地，所述间充质干细胞的浓度为(2~4) X 107个/ml。
[0008] 优选地，所述白鲜皮内酯的浓度为40~80mg/ml。
[0009 ]优选地，所述白鲜皮内酯包括涔酮和黄柏内酯。
[0010] 优选地，所述维生素 A的浓度为40~80ng/ml。
[0011] 优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
[0012] 优选地，所述细胞制剂用溶液为PBS缓冲液。
[0013] 本发明还提供一种上述抗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，包括步骤如下：
[0014] 获取间充质干细胞；
[0015] 将所述间充质干细胞、维生素 A、白鲜皮内酯加入细胞制剂用溶液中，而制得干细 胞制剂。
[0016] 优选地，所述将所述间充质干细胞、维生素 A、白鲜皮内酯加入细胞制剂用溶液中 的步骤中，
[0017] 先将所述维生素 A加入所述细胞制剂用溶液中。
[0018] 优选地，所述获取间充质干细胞的步骤，包括：
[0019] 获取并加工脐带组织，用II型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除所述II型胶原 酶残留，将所述单细胞悬液接种在含胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养，获得成纤维状细 胞，待所述成纤维状细胞达到70~80%融合时，进行消化、传代，并收集第3~5代间充质干 细胞。
[0020] 本发明技术方案，通过将间充质干细胞、维生素 A、白鲜皮内酯与细胞制剂用溶液 混合制得抗肝纤维化的干细胞制剂，进而该干细胞制剂能够有效减轻肝脏炎症程度，逆转 肝纤维化，促进肝功能恢复，且抑制肝星状细胞的增殖而抑制肝纤维化形成，能够治疗肝硬 化;其中，白鲜皮内酯可以影响肝星状细胞的功能并抑制其增殖，并且该白鲜皮内酯可以与 间充质干细胞协同而起到明显改善肝纤维化的作用；维生素 A可以促进间充质干细胞体外 快速增殖，且保持间充质干细胞长期培养中未分化状态和多潜能性。
【附图说明】
[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图示出的内容获得其他的附图。
[0022]图1为本发明实施例1、对比例1C、实施例2、对比例2C制备的间充质干细胞的生长 曲线图。
【具体实施方式】
[0023]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0024] 本发明提供一种抗肝纤维化的干细胞制剂，该干细胞制剂包括原料如下：
[0025] 间充质干细胞、维生素 A、白鲜皮内酯和细胞制剂用溶液;混合后，使得该干细胞制 剂中，该间充质干细胞的浓度为（1~5) X 107个/ml，该白鲜皮内酯的浓度为20~100mg/ml， 该维生素 A的浓度为20~100ng/ml。换而言之，在lml的干细胞制剂中，间充质干细胞有（1~ 5) X 107个，维生素 A为20~lOOng，白鲜皮内酯为20~lOOmg。需要说明的是，根据本领域技 术人员的常识，本发明抗肝纤维化的干细胞制剂中间充质干细胞的浓度、维生素 A的浓度和 白鲜皮内酯的浓度均仅为干细胞制剂刚刚配置好时的浓度，由于间充质干细胞具有活性， 因此，不能理解为配置放置一段时间后的浓度。
[0026] 本发明抗肝纤维化的干细胞制剂能够有效减轻肝脏炎症程度，逆转肝纤维化，促 进肝功能恢复，且抑制肝星状细胞的增殖而抑制肝纤维化形成，能够治疗肝硬化;其中，白 鲜皮内酯可以影响肝星状细胞的功能并抑制其增殖，并且该白鲜皮内酯可以与间充质干细 胞协同而起到明显改善肝纤维化的作用；维生素 A可以促进间充质干细胞体外快速增殖，且 保持间充质干细胞长期培养中未分化状态和多潜能性。
[0027] 需要说明的是，间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力 和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于脐带、骨髓等多种组织中，可在体外培养扩增， 并能在特定条件下分化成肝细胞、神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等； 具体地，本发明间充质干细胞可以来源于脐带、骨髓、脐血、全身结缔组织或器官间质。白鲜 皮为常见的一种中药材，白鲜皮提取物中的活性成分包括内酯类化合物和生物碱类化合 物，而本发明白鲜皮内酯即是白鲜皮提取物中的内酯类化合物。本发明细胞制剂用溶液只 要满足提供间充干细胞的存活的介质即可，具体可以是培养基或缓冲液等等，至于细胞制 剂用溶液的用量可根据实际需求进行调配，均为本领域技术人员的常规做法，在此不做赘 述。
[0028] 进一步地，该间充质干细胞的浓度为(2~4) X107个/ml。
[0029] 当浓度为（2~4) X107个/ml时，可以为受损伤的肝组织提供充足的干细胞，进而 对损伤的肝组织进行修复，该间充质干细胞改善肝纤维化的效果更加显著，且抗纤维化的 效果更明显。
[0030]进一步地，该白鲜皮内酯的浓度为40~80mg/ml。
[0031]当浓度为40~80mg/ml时，该白鲜皮内酯影响肝星状细胞的功能且抑制其增殖的 效果明显，更好地防止受损伤的肝组织进一步纤维化。
[0032]再进一步地，该白鲜皮内酯包括涔酮和黄柏内酯。
[0033]相对于其他内酯，该涔酮和黄柏内酯对控制肝星状细胞的增殖的效果更好，作用 更明显。
[0034] 进一步地，该维生素 A的浓度为40~80ng/ml。
[0035] 浓度为40~80ng/ml时，维生素 A对间充质干细胞具有显著的增殖作用，同时保持 间充质干细胞的未分化状态和多潜能性，防止干细胞制剂中的间充质干细胞发生分化，而 不纯，进而导致疗效降低。
[0036] 本发明还提供一种上述抗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，该制备方法包括步 骤如下：
[0037] S1、获取间充质干细胞；
[0038] S2、将该间充质干细胞、维生素 A、白鲜皮内酯加入细胞制剂用溶液中，而制得干细 胞制剂。
[0039] 本发明抗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法简单、高效，只需将维生素 A、间充质 干细胞和白鲜皮内酯加入细胞制剂用溶液中并配置成相应的浓度即可。
[0040] 需要说明的是，该间充质干细胞可以通过离体组织培养得到，也可以通过购置商 品化的间充质干细胞得到。
[0041] 进一步地，步骤S1具体包括：
[0042] 获取并加工脐带组织，用II型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除II型胶原酶残 留，将单细胞悬液接种在含胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养，获得成纤维状细胞，待成纤 维状细胞达到70~80%融合时，进行消化、传代，达到纯化和增扩间充质干细胞的目的，并 收集第3~5代间充质干细胞。
[0043] 进一步地，步骤S2中，维生素 A、间充质干细胞和白鲜皮内酯的加入细胞制剂用溶 液的先后顺序为:维生素 A、间充质干细胞、白鲜皮内酯;或者，维生素 A、白鲜皮内酯、间充质 干细胞。
[0044] 由于维生素 A先于间充质干细胞加入PBS缓冲液中，可以有效地避免了间充质干细 胞在细胞制剂用溶液分化，从而保证间充质干细胞在干细胞制剂中的纯度。
[0045] 现通过实施例对本发明抗肝纤维化的干细胞制剂及其制备方法做进一步解释，以 详细说明其技术方案及带来的技术效果。
[0046] 实施例1
[0047] 一、获取人脐带间充质干细胞 [0048] (1)、获取并加工人脐带组织
[0049] 获取离体的人脐带组织，约4~6cm长，在无菌条件下抽净脐带血后，置于PBS缓冲 液中、在4°C下保存，并在4h内进行处理；
[0050] 将约4~6cm长的人脐带组织放入超净台中，去除动静脉及外膜，使用PBS缓冲液 (KH2P〇4 0.2g，KCl 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HP〇4 1.15g定容比，卩!1 = 7.4)进行初次漂洗几次， 剪成lcm小段，再用同样的PBS缓冲液多次漂洗以尽可能去除血液，最后剪成肉糜状组织； [0051 ] (2)、分离纯化
[0052]将肉糜状组织移入50mL离心管，加入5mL、经37°C预热的、质量分数为0.1 %的Π 型 胶原酶(100ml PBS缓冲液溶解0. lg胶原酶），放入37°C水浴摇床中振荡消化180min，消化成 单细胞悬液；
[0053] 接着，加入30mL DMEM/F12，反复吹打，细胞筛过滤，收集滤液，而洗涤去除Π 型胶 原酶残留；
[0054] 滤液用1000转/min的转速离心10min，弃上清，将离心沉淀下来的单细胞悬液按1 X 106/mL的密度接种于含10%FBS(胎牛血清）的DMEM/F12培养基的培养瓶中，移入培养箱 中进行培养，次日首次换液，以后每3d换液1次，并培养成成纤维状细胞；
[0055]当成纤维状细胞达到70~80 %融合时，用胰蛋白酶(胰蛋白酶溶液配制：PBS缓冲 液200mL，胰蛋白酶0.5g，乙二胺四乙酸0.04g)不完全消化进行传代纯化，传代代数标记分 别为PI、P2、P3等，P3代后用完全消化进行传代，最后，收集P3~P5代人脐带间充质干细胞细 胞冻存。
[0056]二、制备干细胞制剂
[0057]将上述步骤制备得到的P3~P5代人脐带间充质干细胞复苏、备用后，先将400ng维 生素 A加入10ml PBS缓冲液中，然后将2 X 108个人脐带间充质干细胞加入roS缓冲液中，最 后将400mg白鲜皮内酯(涔酮+黄柏内酯)加入PBS缓冲液中。
[0058]对比例1A(人脐带间充质干细胞+维生素 A)
[0059]将实施例1制备得到的人脐带间充质干细胞复苏、备用后，先将400ng维生素 A加入 10ml PBS缓冲液中，然后将2 X 108个人脐带间充质干细胞加入PBS缓冲液中，制得对比制 剂。
[0060]对比例1B(白鲜皮内酯+维生素 A)
[0061 ]将400ng维生素 A加入10ml PBS缓冲液中，然后将400mg白鲜皮内酯(涔酮+黄柏内 酯)加入PBS缓冲液中，制得对比制剂。
[0062]对比例1C(人脐带间充质干细胞+白鲜皮内酯）
[0063] 将实施例1制备得到的人脐带间充质干细胞复苏、备用后，将2 X108个人脐带间充 质干细胞加入l〇ml PBS缓冲液中，然后将400mg白鲜皮内酯（涔酮+黄柏内酯）加入PBS缓冲 液中，制得对比制剂。
[0064] 实施例2
[0065] 一、获取人脐带间充质干细胞 [0066]与实施例1相同。
[0067]二、制备干细胞制剂
[0068]将实施例1制备得到的人脐带间充质干细胞复苏、备用后，先将800ng维生素 A加入 10ml PBS缓冲液中，然后将4X 108个人脐带间充质干细胞加入PBS缓冲液中，最后将800mg 白鲜皮内酯(涔酮+黄柏内酯)加入PBS缓冲液中。
[0069]对比例2A(人脐带间充质干细胞+维生素 A)
[0070]将实施例1制备得到的人脐带间充质干细胞复苏、备用后，先将800ng维生素 A加入 10ml PBS缓冲液中，然后将4 X 108个人脐带间充质干细胞加入PBS缓冲液中，制得对比制 剂。
[0071]对比例2B(白鲜皮内酯+维生素 A)
[0072]将800ng维生素 A加入10ml PBS缓冲液中，然后将800mg白鲜皮内酯(涔酮+黄柏内 酯)加入PBS缓冲液中，制得对比制剂。
[0073]对比例2C(人脐带间充质干细胞+白鲜皮内酯）
[0074]将实施例1制备得到的人脐带间充质干细胞复苏、备用后，将4X108个人脐带间充 质干细胞加入l〇ml PBS缓冲液中，然后将800mg白鲜皮内酯（涔酮+黄柏内酯）加入PBS缓冲 液中。
[0075] 验证例1
[0076]间充质干细胞的0D(optical density，光密度)值测定：
[0077] 取5块96孔板，每块96孔板以5 X103/孔的密度将实施例1制备的活细胞悬液中的 细胞各接种于5个孔中，同样将实施例2制备的活细胞悬液中的细胞各接种于另外5个孔中， 单纯干细胞悬液作为对照，接种于5个孔中；置于37 °C，5 %C02培养箱中培养，实施例孔和对 比例孔每三天换液一次。此后每天同一时间，随机抽取一板，测定0D值。测量时每孔加入MTT 溶液(5mg/ml)20yL，继续在37 °C，5 %C02培养箱中培养6小时后，小心吸弃孔内液体，每孔内 加入150yL DMS0(二甲基亚砜）。将96孔板放置在酶联免疫检测仪上震荡20分钟，采用双波 长测定法，酶联免疫测定仪设定检测波长492nm。参比波长630nm，测定0D值，如下表1所示， 表1为三组干细胞悬液在不同天数时测定的0D值。
[0078] 表 1
[0079]
[0080] 根据表1可知，随着天数的增加，实施例1和实施例2的0D值呈递增趋势，且明显高 于对照组的0D值，显然，本发明抗肝纤维化的干细胞制剂中的人脐带间充质干细胞相对于 对照组保持较高的活性，且细胞存活率高。
[0081 ] 验证例2
[0082]临床干细胞注射治疗实验：
[0083] 本验证例的病人均选自住院病人，总共35例，其中肝炎后肝硬化18例，吸血虫肝硬 化7例，酒精性及其原因肝硬化10例。将35例肝硬化患者随机分成7组，每组5人，分组及每组 的治疗如下：
[0084]组1为对照组，采用常规药物进行治疗；
[0085] 组2采用实施例1制备的干细胞制剂进行注射治疗；
[0086] 组3采用对比例1A制备的干细胞制剂进行注射治疗；
[0087] 组4采用对比例1B制备的干细胞制剂进行注射治疗；
[0088] 组5采用实施例2制备的干细胞制剂进行注射治疗；
[0089]组6采用对比例2A制备的干细胞制剂进行注射治疗；
[0090]组7采用对比例2B制备的干细胞制剂进行注射治疗；
[0091] 组2~7的病人用人脐带间充质干细胞注射治疗3次，每次相隔1个月时间，治疗后， 病人精神好转，食欲增加，腹水消退，血清学生化指标明显改善，并检测病人的血清学指标 (平均值）：ALT(丙氨酸转氨酶）、AST(谷草转氨酶）、ALB(血清白蛋白）、TBIL(总胆红素）、PT (凝血酶原时间）、ΡΤ% (凝血酶原时间活动度）、PT INR(凝血酶原时间国际标准化比率）、 AFP(甲胎蛋白）；请参见如下表2,该表2为上述7组病人治疗后测得的血清学指标的参数。
[0092] 表 2
[0093]
[0094] 由上表2可知，对比例1A(人脐带间充质干细胞+维生素 A)与对比例1B(白鲜皮内酯 +维生素 A)、对比例2A(人脐带间充质干细胞+维生素 A)与对比例2B(白鲜皮内酯+维生素 A) 对肝硬化均具有疗效，均可改善肝硬化，由此证明：间充质干细胞和白鲜皮内酯均可分别治 疗肝硬化，改善纤维化;本发明实施例1和实施例2制备的干细胞制剂可以使肝硬化患者的 血清学指标恢复正常，可以接近甚至达到治愈的效果，而且，实施例1的效果远远优于对比 例1A和对比例1B的效果之和，同样实施例2的效果远远优于对比例2A和对比例2B产生的效 果之和，因此，本发明干细胞制剂的白鲜皮内酯和间充质干细胞对肝纤维化引起的肝硬化 的治疗起协同作用，相对于白鲜皮内酯或间充质干细胞单独治疗肝纤维化，该效果远远优 于两者之和。
[0095] 验证例3
[0096] 人脐带间充质干细胞的生长曲线的绘制：
[0097]采用MTT法测定细胞生长曲线，分别取实施例1、对比例1C、实施例2、对比例2C的干 细胞制剂，以2500个细胞/孔的密度分别接种于96孔板进行培养，分别在培养1，2，3，4，5，6， 7d时按试剂盒说明对各组细胞进行MTT检测。加入MTT溶液10μL7孔，37°C孵育4h，加 formanzan液lOOyL/孔，37°C孵育至formanzan完全溶解，在酶联免疫检测仪上波长570nm处 检测各孔的光密度(0D)值，根据测得的吸光度值绘制细胞生长曲线，每组设6孔对照。细胞 以1 X 106/mL密度接种于24孔板培养24h后，
[0098] 采用胰酶消化法计算细胞群体倍增时间（populationdoubling time，PDT)，用以 下公式法求得:PDT = tX [lg2/(lgNt-lgNo)]，公式中t代表培养时间，No代表首次计数(细 胞培养24h时)获得的细胞数，Nt代表培养t时间后的细胞数。
[0099] 请参照图1，图1为四组人脐带间充质干细胞的生长曲线。由生长曲线结果显示，4 组细胞均经过1~2d的潜伏期后开始快速增殖进入对数生长期(3~6d)，在第6d后逐渐进入 平台期。实施例1和实施例2在1~5d内细胞增殖速率高于其他两组对比例，具有显著性差 异。实施例1和实施例2细胞倍增时间也明显缩短，实施例1细胞增殖稍慢于实施例2;因此， 维生素 A可以显著促进干细胞增殖，且保持干细胞未分化。
[0100] 验证例4
[0101] 肝星状细胞CyclinDl和P27蛋白表达Western blot检测：
[0102] ( -）、大鼠肝星状细胞及成纤维细胞的培养:细胞复苏后接种于塑料培养瓶中，于 37°C、体积分数为5 %的C〇2饱和湿度培养箱中常规培养，培养液为含体积分数为10 %胎牛 血清的L-DMEM，每2d换液1次。
[0103] (二）、分组处理：
[0104] 实施例1组(人脐带间充质干细胞+白鲜皮内酯）：
[0105] 实施例1制备的干细胞制剂与肝星状细胞按1:1共培养；
[0106] 对比例1A组(人脐带间充质干细胞）：
[0107] 对比例1A制备的对比制剂与肝星状细胞按1:1共培养；
[0108] 对照组：
[0109] 成纤维细胞与肝星状细胞按1:1共培养。
[0110](三)免疫染色
[0111]用细胞裂解液提取各时段肝星状细胞总蛋白，考马斯亮蓝比色法测定蛋白含量， 上样量为80yg，蛋白行15 % SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜，非特异性封闭。加入一抗小鼠抗 〇7(：1;[1101、？27单克隆抗体（1:500稀释），4 <€过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行杂 交。ECL发光剂1~5min，曝光、显影、定影。数码成像分析系统软件对结果进行分析，以目的 蛋白/GAPDH的灰度比值表示相对目的蛋白水平。
[0112](四）统计学分析：
[0113] 应用SPSS 13.0软件进行统计处理，计量资料以x±s表示，P〈0.05为差异有显著性 意义。统计结果如下表3和表4所示，表3为共培养后各组肝星状细胞Cycl inDl蛋白表达，表4 为共培养后各组肝星状细胞P27蛋白表达。
[0114] 表 3(x土s，n = 6，A)
[0115]
[0116] 表3中，共培养24h，实施例1组和对比例1A组的Cycl inDl蛋白表达开始下调，实施 例1组CyclinDl蛋白表达量显著低于对比例1A组，且共培养72h时表达量显著低于对照组(P <0.01)〇
[0117] 表 4(x土s，n = 6，A)
[0118]
[0119] 表4中，共培养24h，实施例1组和对比例1A组的p27蛋白表达较对照组均显著上调 (P〈0.01)，此后持续高表达状态，且实施例1组p27蛋白表达量显著高于对比例1A组。
[0120] 理论依据:细胞增殖是通过细胞周期的运行实现的，细胞周期调控是指各种调控 因子通过自身的激活和灭活，使细胞启动和完成细胞周期重要事件，并保障这些事件按次 序正常进行。其分子基础包括细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖蛋白激酶和细胞周期蛋白 依赖蛋白激酶抑制物。G0/G1期~S期的调控点是细胞内外信号经传递、整合、汇集到细胞 核，对细胞增殖进行调控的关键点，由G1期周期蛋白cyclinDl等调控。细胞能否通过限制点 从G1期进入S期很大程度取决于G1期内CyclinDl的积累。CyclinDl可与⑶K结合形成复合 物，在CDK激酶的介导下发生磷酸化，从而促进某些基因的表达，这些基因的表达产物可促 使细胞通过G1期~S期调控点，使细胞进入自主分裂程序。相反，阻滞Cyclin D1的表达，可 使细胞不能从G1期进入S期。P27是CKI家族的一员，主要与cyclin结合而发挥对cyclin⑶K 的抑制作用。P27对CDK的抑制作用有两方面，一方面能抑制已结合到cyclin并被激活的CDK 活性，另一方面也可以抑制CDK的激活过程，最终抑制细胞周期G1-S的转变。
[0121 ] 因此，结合上述表3和表4可知，对比例1A组的Cycl inDl蛋白质表达减少，P27蛋白 明显增加，与对照组相比差异有显著性意义，说明间充质干细胞对肝星状细胞增殖的抑制 的机制之一是通过下调细胞周期素 CyclinDl、上调P27蛋白的表达，使细胞周期停滞于G0/ G1期，从而发挥抑制肝星状细胞增殖的作用。实施例1组的CyclinDl蛋白质表达减少，P27蛋 白明显增加，与对比例1A组相比差异有显著性意义，说明白鲜皮内酯采用同样机理显著抑 制肝星状细胞增殖。
[0122]以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本 发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其 他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种抗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于，包括： 间充质干细胞； 白鲜皮内酯； 维生素 A; 细胞制剂用溶液； 在所述干细胞制剂中，所述间充质干细胞的浓度为（1~5) X107个/ml，所述白鲜皮内酯 的浓度为20~100mg/ml，所述维生素 A的浓度为20~100ng/ml。2. 如权利要求1所述的抗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于，所述间充质干细胞的浓 度为(2~4)X107个/ml。3. 如权利要求1所述的抗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于，所述白鲜皮内酯的浓度 为40~80mg/ml。4. 如权利要求3所述的抗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于，所述白鲜皮内酯包括涔 酮和黄柏内酯。5. 如权利要求1所述的抗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于，所述维生素 A的浓度为 40~80ng/ml。6. 如权利要求1至5任意一项所述的抗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于，所述间充 质干细胞为人脐带间充质干细胞。7. 如权利要求1至5任意一项所述的抗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于，所述细胞 制剂用溶液为PBS缓冲液。8. -种如权利要求1所述的抗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括步 骤如下： 获取间充质干细胞； 将所述间充质干细胞、维生素 A、白鲜皮内酯加入细胞制剂用溶液中，而制得干细胞制 剂。9. 如权利要求8所述的抗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述将所述 间充质干细胞、维生素 A、白鲜皮内酯加入细胞制剂用溶液中的步骤中， 先将所述维生素 A加入所述细胞制剂用溶液中。10. 如权利要求8所述的抗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述获取 间充质干细胞的步骤，包括： 获取并加工脐带组织，用II型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除所述II型胶原酶残 留，将所述单细胞悬液接种在含胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养，获得成纤维状细胞，待 所述成纤维状细胞达到70~80%融合时，进行消化、传代，并收集第3~5代间充质干细胞。
【文档编号】A61P1/16GK106038596SQ201610356758
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司