专利名称：一种超级cik杀伤细胞的制备方法
技术领域：
本发明属于医疗技术领域，特别是肿瘤生物技术中用于治疗的杀伤细胞的制备方法。
背景技术：
肿瘤生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗方法。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)治疗是目前最有效的肿瘤生物治疗手段。CIK细胞是一种体外增殖能力强、杀瘤活性高及对多重耐药肿瘤细胞较敏感的广谱抗瘤免疫活性细胞。
目前国内外制备的用于肿瘤免疫治疗的CIK细胞是体外扩增出的以⑶3+⑶56+、CD3+ CD8+为主的异质性细胞群。该细胞群是在多种细胞因子如IL2、IFN-y及单克隆抗体(CD3McAb)的刺激下，由从外周血、骨髓或脐血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有广泛的抗肿瘤活性(Schmidt-Wolf , Negrin, Kiem, et al. : J Exp Med, 1991,174:139-149)。近年来大量关于CIK细胞的动物实验和临床研究证实了 CIK细胞用于肿瘤治疗的前景广阔。到目前为止，CIK细胞用于治疗肝癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、肾细胞癌、肺癌以及各种类型白血病等取得初步成效。但是，CIK细胞治疗的临床数据也显示出了它明显的局限性，如它治疗早期小型肿瘤效果好于晚期巨型肿瘤；它的中短期效果(无癌存活期，cancer-free survival)好于对照组,但长期效果(最终存活期，ultimate survival)却与对照组区别不明显。究其原因，肿瘤组织的免疫逃逸性对CIK细胞活力的削弱是其中主要原因之一。肿瘤组织的免疫逃逸性就是生物体为避免免疫细胞攻击的一种机制。免疫T细胞包括CIK细胞，在其细胞表面表达着一类受体，它们的作用是一但与其相应的配体结合，就能产生一系列信号来抑制或削弱T细胞的活力。生物体通过这一机制来控制T细胞的活力，甚至减少其数量以避免它们攻击自身细胞，防止产生自身免疫反应。众所周知的细胞表面CTLA4分子就是这类受体。在免疫T细胞被激活、扩增的各个步骤中，一旦遭遇到表达着辅助激活配体(B7-1，⑶80，⑶86)的树突细胞或肿瘤细胞时，激活的T细胞通过提高CTLA4分子的表达，使之替代⑶28与B7-1结合，从而降低T细胞的活性。CTLA4的拮抗型抗体能阻挡CLTLA4分子与B7配体的结合，从而导致了增强的T细胞活力和更强力的抗肿瘤活力。CTLA4的拮抗型抗体因而也能够损伤正常组织对自体抗原的免疫耐受,刺激病人体内对皮肤，下垂体及小肠的免疫攻击，造成炎症和毒性。肿瘤组织逃避杀伤细胞攻击的方式之一就是升高其细胞表面CTLA4配体，B7-1的表达量。在肿瘤的微环境内，一旦杀伤细胞上的CTLA4与肿瘤细胞上的B7-1结合，就会使杀伤细胞产生一种能量耗尽的表象，其特征为活力因子
(IFX；)减少，细胞数量减少，肿瘤细胞因而得到了保护。
利用拮抗型抗体来防止或破坏CTLA4与其配体B7的结合，在理论上和实验中都已被证明能增强杀伤型T细胞的活力，也在动物和临床试验中证明能有效地提高免疫系统对肿瘤生长的抑制作用，甚至能引起肿瘤的坏死。但是直接静脉注射CTLA4抗体，在达到抗肿瘤的剂量水平上也引起了非常严重的自身免疫反应(Hodi，O’Day et al. :N Engl J Med,2010，363:711-723)。虽然有些副反应可以用大剂量的激素药物来控制，但有些副反应却是致命的。而所有这些自身免疫反应是由这类抗体药的根本药理决定的。系统给药，不仅激活了肿瘤组织里的T细胞，也大大激活了全身血液循环中和各器官内T细胞，其毒副作用也非常严重。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备超级杀伤细胞的方法，在体外加载CTLA4抗体以覆盖所有细胞表面的CTLA4分子，提高杀伤细胞的杀瘤活性，降低CTLA4抗体的毒副作用。
本发明技术方案是先在体外扩增肿瘤杀伤细胞,并加载CTLA4抗体，然后清洗掉多余的CTLA4抗体，即形成超级CIK杀伤细胞。本发明采用在体外扩增肿瘤杀伤细胞达到所需数量后，体外加载CTLA4抗体以覆盖所有细胞表面的CTLA4分子，加载完毕后清洗掉所有多余的CTLA4抗体。这样制备的高活性肿瘤杀伤细胞，经过静脉回输后CTLA4抗体既发挥抗体药物的疗效，又避免大剂量静脉注射CTLA4抗体导致严重的毒副作用。本发明方法制成的超级杀伤CIK细胞，一次静脉回输的细胞所需CTLA4抗体数量仅是直接静脉注射用CTLA4抗体剂量的1%，而且静脉回输时的杀伤细胞将没有自由抗体去激活体内T细胞，由此大大减低了 CTLA4抗体可能引起的自身免疫反应的副作用；同时被CTLA4抗体覆盖的杀伤细胞将不会与B7-1结合，不会被肿瘤微环境灭活，避免肿瘤组织的免疫逃逸性，从而能够持续对肿瘤细胞造成杀伤，最终能够达到对肿瘤组织长效性的抑制甚至清除的目的。本发明具体包括以下步骤
1)在PBMC细胞中加入IFX-,,’在37。。,5% CO2孵箱中培养；
2)24小时后加入CD3McAb和IL-2，继续在37。。，5% CO2孵箱中培养；
3)随后每三天更换新培养液，并添加IL-2；
4)第九天更换液后,加入载有肿瘤抗原的树突细胞,并加入CTLA4抗体；
5)在第12天收集超级CIK杀伤细胞时，加入CTLA4抗体，在室温下静置30分钟，随后用PBS洗涤去除游离的CTLA4抗体，最后悬浮于生理盐水中。在所述步骤4)中，所述加入的CTLA4抗体使CTLA4抗体的终浓度到达lug/ml。本发明的有益效果是本发明方法制成超级杀伤细胞的杀伤活力可以随着CTLA4抗体加载而提高，而且加载量只需直接静脉注射用CTLA4抗体剂量的1%，而且回输时的杀伤细胞将没有游离的CTLA4抗体去激活体内T细胞，由此大大减低了 CTLA4抗体使用时引起的自身免疫反应的副作用。
图I为超级CIK杀伤细胞制备方法的流程图。图2为超级CIK细胞生长活力检测结果图。图3为超级CIK细胞杀伤活力检测结果图。
具体实施例方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、CIK细胞的制备
I、本发明的超级CIK细胞的制备，如图I所示
(I)外周血单个核细胞(PBMC)的采集制备·
用血细胞分离机在无菌条件下采集肿瘤患者抗凝血，比重为I. 077的淋巴细胞分离液Ficoll-Paque Plus与血按1:2加入离心管中，离心1500rpm/30min,取界面层细胞，PBS洗涤2次，悬浮于无血清GT-T561培养基中，调整细胞浓度IX IO6细胞/mL。(2)制备超级CIK杀伤细胞
在当日制备的PBMC细胞中，加入IFX-·/ (1000 u ..EilL在37V ,5% CO2孵箱中培养。24 小时后加入 CD3McAb(50 ng / ml), IL-2 (300 u / ml)，继续在 37°C，5% CO2孵箱中培养。随后每三天更换新培养液，加IL-2 (300 u / ml)。第九天更换液后，加入10%的载有肿瘤抗原的树突细胞，并加入CTLA4抗体(ipiIimumab,百时美施贵宝Bristol-Myers Squibb生产)使CTLA4抗体的终浓度到达Iug/ml ο在第12天收集超级CIK杀伤细胞时，加入CTLA4抗体(lug/ml)，在室温下静置30分钟，随后用PBS洗涤2次以去除游离的CTLA4抗体，最后悬浮CIK于生理盐水中，以备静脉回输。2、对照组CIK杀伤细胞的制备
对照组制备CIK杀伤细胞时，除不加CTLA4抗体外，其他处理方法同上。二、超级CIK杀伤细胞和对照组CIK杀伤细胞各指标的检测 I、无菌试验和热源检测
超级CIK杀伤细胞和对照组CIK细胞的无菌试验和热源检测均为阴性。2、表型检测
用流式细胞仪检测细胞表型，表型检测结果，采用以上方法制备的超级CIK杀伤细胞和对照组CIK细胞中，T淋巴细胞的数量和各亚群的比例无明显差异。T淋巴细胞(⑶3+细胞)占细胞总数的90%以上，其中T淋巴细胞中各亚群的比例因血液来源差异有一定变化范围CD3+CD56+细胞的比例为40% 55%，CD8+细胞的比例为65 80%，CD3-CD56+细胞的比例为25 40%。3、活细胞技术检测
检测方法为常规台盼兰(Trypan Blue)染色，显微镜观察活细胞数量。
活细胞技术检测结果超级CIK杀伤细胞和对照组CIK细胞中活细胞百分比都大于90%,无明显差异。4、超级CIK细胞生长活力和杀伤活力检测 采用MTT方法检测细胞生长活力。采用IFXy ELISA方法检测超级ClK细胞杀伤活力。I)取第12天生长的超级CIK杀伤细胞，以细胞浓度为5 X IO4 /mL，O. I mL铺于96孔平底板中，所有样品设3个复孔。PMA (植物血凝素)500ng/ml用于激活CIK细胞中T细胞，B7-1重组蛋白lug/ml用于模拟体内肿瘤微环境内的抑制机制来抑制T细胞活力。CTLA4抗体(ipilimumab)按终浓度l，10，100，1000，10000ng/ml加入实验孔，用于中和B7-1对T细胞的抑制作用。96孔板放置在37°C,5% CO2培养中培养24小时后，将培
养吸出50ul用于ELISA方法检测IPC/浓度；96孔板继续培养48小时后，每孔加入浓度
为5mg/ml的噻唑蓝(MTT) O. 02ml，继续培养4小时，每孔加入O. Iml 二甲亚砜(DMSO)后，在570nm处测定吸光率。2)超级CIK细胞生长活力和杀伤活力检测结果在模拟体内肿瘤微环境下，被激活的CIK细胞在接触到B7-1时，其生长活力和杀伤活力分别被抑制到最高活力水平的30%(如图2所示)和20% (如图3所示)；而加入拮抗型CTLA4抗体后，阻断了 B7-1和CIK细胞表面的CTLA4的结合，因而解除了 CTLA4信号系统引起的抑制作用，CIK细胞的生长活力(如图2所示)和杀伤活力(如图3所示)都得到恢复，且活力恢复程度与CTLA4抗体的剂量成正比。CIK生长活力在CTLA4抗体中高剂量(l-10ug/ml)下得以完全恢复(如图2所示);其杀伤活力则在CTLA4抗体同等剂量下恢复了 80%的活力(如图3所示)。由此结果可以得出以下结论常规CIK细胞(无CTLA4抗体阻断其抑制信号系统)在进入肿瘤微环境后，其活力将受到极大地抑制；相反，本发明方法制成的超级CIK细胞(被CTLA4抗体覆盖并阻断其抑制信号系统)在进入肿瘤微环境后，其活力将被完好地保持，使之能够有效而长效地杀伤肿瘤组织。
权利要求
1.一种超级CIK杀伤细胞的制备方法，其特征在于先在体外扩增肿瘤杀伤细胞，并加载CTLA4抗体，然后清洗掉多余的CTLA4抗体，即形成超级CIK杀伤细胞。
2.根据权利要求I所述超级CIK杀伤细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤 1)在PBMC细胞中加入IFX-γ,在37°C,5% CO2孵箱中培养； 2)24小时后加入CD3McAb和IL-2，继续在37°C>5% CO2孵箱中培养； 3)随后每三天更换新培养液，并添加IL-2； 4)第九天更换液后,加入载有肿瘤抗原的树突细胞,并加入CTLA4抗体； 5)在第12天收集超级CIK杀伤细胞时，加入CTLA4抗体，在室温下静置30分钟，随后用PBS洗涤去除游离的CTLA4抗体，最后悬浮于生理盐水中。
3.根据权利要求I所述超级CIK杀伤细胞的制备方法，其特征在于在所述步骤4)中，所述加入的CTLA4抗体使CTLA4抗体的终浓度到达lug/ml。
全文摘要
一种超级CIK杀伤细胞的制备方法，属于医疗技术领域，本发明采用在体外扩增肿瘤杀伤细胞达到所需数量后，体外加载CTLA4抗体以覆盖所有细胞表面的CTLA4分子，加载完毕后清洗掉所有多余的CTLA4抗体。这样制备的高活性肿瘤杀伤细胞，经过静脉回输后CTLA4抗体既发挥抗体药物的疗效，又避免大剂量静脉注射CTLA4抗体导致严重的毒副作用，能够持续对肿瘤细胞造成杀伤，最终能够达到对肿瘤组织长效性的抑制甚至清除的目的。
文档编号C12N5/078GK102899289SQ20121040796
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者胡伟明 申请人:扬州维克斯生物科技有限公司