专利名称：Hla-b*1301等位基因的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及HLA-B*1301等位基因的用途，特别涉及HLA_B*1301等位基因作为氨苯砜综合征风险遗传标记中的应用。
背景技术：
MHC(主要组织相容性复合体，major histocompatibility complex)是与移植物排斥反应有关的基因复合体，人类的MHC命名为HLA (Human Leukocyte A system)。丰富的多态性(polymorphism)是HLA基因系统的一个最重要特点。HLA复合体中很多基因座位的DNA序列在人群中存在许多变异体，称为等位基因(allele)。HLA等位基因系统位于第6号染色体上。由于人类是随机婚配的杂合群体，因此对每一个个体而言，HLA等位基因完全相同的概率极小，这不仅使HLA成为人体中多态性最丰富的系统，也使每一个个体 所具有的HLA等位基因及其产物可以成为显示该个体独特性的生物学“身份证”，即个体性(individuality)的标志。HLA系统的多态性保证了种群能显示对各种病原体合适的免疫应答，以保证群体的延续及维持其稳定性。多个HLA分子已经被发现与不同种群的药物反应相关。例如HLA-B*1502等位基因在中国和泰国种群中或者HLA-A*3101等位基因在高加索和日本种群与卡马西平所致的药物超敏反应相关；HLA-B*5701等位基因在高加索人群中与阿巴卡韦所致的药物反应相关；HLA-B*5801等位基因在中国种群中与别嘌呤醇所致的药物反应相关；迄今为止，尚没有哪种药物反应与HLA-B*1301等位基因相关，但是既往曾报道该位点与三氯乙烯(一种工业溶剂)所致的过敏性皮炎相关(Li H, Dai Y，HuangH，et al. HLA_B*1301asa biomarker for genetic susceptibility to hypersensitivitydermatitis induced bytrichloroethyIene among workers in China. Environ HealthPerspect 2007;115:1553-6)。氨苯砜(4，4’ -二氨基二苯砜，DDS)于1908年合成，具有抗感染及抗炎作用。该药单用或与其他药物联合可广泛应用于治疗感染性疾病(如麻风病、疟疾、放线菌感染引起的疾病及HIV感染后所致的卡氏肺囊虫肺炎)或用于以中性粒细胞或嗜酸细胞异常浸润为特点的慢性炎症性疾病(如自身免疫性大疱病、持久性隆起性红斑、脓疱型银屑病、坏疽性脓皮病、痤疮)。此外，该药还可以用于风湿性关节炎的治疗，同时对急性缺血性中风患者的神经具有一定的保护作用。既往的流行病学研究资料显示，约有0. 5-3%的接受DDS治疗的患者可发生药物高敏综合症，死亡率约为11-13%。早在1949年，学者Lowe就注意到了这种现象，1951年该病正式定名为“氨苯砜高敏综合征”(DHS)。DHS是一种严重的个体对药物的异质性反应，多于接受DDS治疗后4-6周内出现，在临床上表现为高热，皮疹，并可累及内脏(多累及肝脏和血液系统)，严重者可出现器官功能衰竭。随着DDS在世界范围内应用于麻风病联合化疗及HIV感染后所致的卡氏肺囊虫肺炎化学预防，DHS的发生率明显升高。最近的一篇对已发表的流行病学文章的系统性回顾总结DHS的患病率大约在I. 4%。但迄今为止，尚没有一个可靠的检测方法可以预测DHS的风险性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供HLA_B*1301等位基因在作为氨苯砜综合征风险遗传标记中的新用途。本发明所提供的新用途是下述I) -7)中的至少一种I)检测人是否具有HLA_B*1301等位基因的物质在制备检测或评价人发生应答于氨苯砜的药物不良反应风险的产品中的应用；2)检测人是否具有HLA_B*1301等位基因的物质在制备检测或评价人发生氨苯砜闻敏综合征风险的广品中的应用；3)检测人是否具有HLA_B*1301等位基因的物质在制备氨苯砜高敏综合症筛查产品中的应用； 4)检测或评价人发生应答于氨苯砜的药物不良反应风险的方法，所述方法包括检测人是否具有HLA-B*1301等位基因，其中，具有HLA-B*1301等位基因的人使用氨苯砜后发生药物不良反应风险高于不具有HLA-B*1301等位基因的人，一对同源染色体的两个染色体均具有HLA-B*1301等位基因的人使用氨苯砜后发生药物不良反应风险高于一对同源染色体中只有一个染色体具有HLA-B*1301等位基因的人；5)检测或评价人发生氨苯砜高敏综合征风险的方法，所述方法包括检测人是否具有HLA-B*1301等位基因，其中，具有HLA-B*1301等位基因的人使用氨苯砜后发生氨苯砜高敏综合征的风险高于不具有HLA-B*1301等位基因的人，一对同源染色体的两个染色体均携带HLA-B*1301等位基因的人使用氨苯砜后发生氨苯砜高敏综合征的风险高于一对同源染色体中只有一个染色体携带HLA-B*1301等位基因的人；6) 一种开发治疗应答于氨苯砜的药物不良反应的方法，其包括使用HLA_B*1301等位基因作为靶点的测定法来鉴别和/或筛选候选药物；7) 一种开发治疗氨苯砜高敏综合症的方法，其包括使用HLA_B*1301等位基因作为靶点的测定法来鉴别和/或筛选候选药物；8)检测或评价人发生应答于氨苯砜的药物不良反应风险的产品，所述产品含有检测人是否具有HLA-B*1301等位基因的物质。其中，上述1)、2)、3)和8)中检测人是否具有HLA_B*1301等位基因的物质可为本领域已知的任一种检测等位基因存在的方法所用的试剂、试剂盒和/或仪器，如通过下述至少一种方法确定HLA-B*1301等位基因存在所用的试剂、试剂盒和/或仪器DNA特异性杂交法、以PCR为基础的HLA测序分型法以及HLA血清学分型法。其中，以PCR为基础的HLA测序分型法中采用的PCR弓丨物具体可为弓I物对I和/或引物对2。所述弓I物对I由SEQID No. I和SEQ ID No. 2所示的单链DNA组成；引物对2由SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的单链DNA组成。在本发明的一个实施例中，上述1)、2)、3)和8)中检测人是否具有HLA-B^l301等位基因的物质为所述引物对I和/或引物对2，或含有所述引物对I和/或引物对2的试剂盒。上述I)、2 )、3 )和8 )中检测人是否具有HLA-B* 1301等位基因的物质还可为检测人是否具有HLA-B*1301等位基因的等价遗传标记物的方法中所采用的试剂、试剂盒和/或仪器，HLA-B*1301等位基因的等价遗传标记物的存在指示HLA-B*1301等位基因的存在。上述4 )和5 )中检测人是否具有HLA-B* 1301等位基因还可通过检测HLA-B* 1301等位基因的等价遗传标记物而测定，HLA-B^l301等位基因的等价遗传标记物的存在指示HLA-B*1301等位基因的存在。该等价遗传标记物是连接于HLA_B*1301等位基因的遗传标记物。所述等价遗传标记物可以是单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,缩写SNP)、简单重复序(SSR)标记等，如 rsll4740545、rsll6111301、rsll5901473、rsll5087954、rsll5675600、rsl87280524、 rsll4242707、 rsll7901686、 rsl44295468、 rsll6670002、 rsll4025781、rsl50578601、rsl84663538、rsl47436789、rsll6727474、rsl81134814、rsll4738037、rsll6559955、 rsl40019442、 rsll5099160、 rsll4269118、 rsll6702376、 rsll4044189、rs75031011、 rsll4703573、 rsll6990865、 rsll6352528、 rsll5467821、 rsll4557543、rsll5169469、rsll4174160、rsl48933000、rsl39232749、rsl91781678、rsll6299045、rsll5919658、rsl84804684、rsll5314010、rsll4560740、rsll6664449、rsll6590236、rsll4042808、rsll5282162、rsl91351745、rsl42449668、rsl38476012、rsll6791918、rsll4619879、 rsl45574701、 rsl86013251、 rsll6394756、 rsl44957773、 rsl49868923、rsll7015327、 rsl46938564、 rsl44519211、 rsll6800609、 rsll5438047、 rsll6238756、rsll5579895、 rsll4934557、 rsll5644116、 rsl84278614、 rsll5512397、 rsll7674267、 rsll7357765、rsl87285424、rsll5938217、rsl44112558、rsl43310386、rsll7948233、rsll6143597、 rsll5618393、 rsll8069711、 rsll4558979、 rsll4430391、 rsll6545227、rsll4871120、 rsl86776456、 rsll5144194、 rsll4466888、 rsll6050364、 rsll7554535、rsl38890419、 rsll7416412、 rsl87053286、 rsl38585202、 rsll4790460、 rsl82307981、rsll6799594、 rsll7177835、 rsll5493428、 rsl47420529、 rsl43510919、 rsll5271465、rsl48814200、 rsl46667604、 rsl45848766、 rsll6182888、 rsl39753005、 rsl51055597、rsl42876154、rsll4596560、rsl47187739、rsll7882759、rsl5031214U rsl38525703、rsl50009117、rsll4955269、rsl41690290、rsll4673459、rsll5461077、rsl90715652、rsll6270078、rsl89405064、rsll5840422、rsl41629269、rsl45194724、rsl49956121、rsl39220743、 rsl93127702、 rsll6309554、 rsll4342076、 rsl39930000、 rsl45959074、rsl42459425、 rsl82634314、 rsl37882198、 rsll5709299、 rsl49636715、 rsl50064319、rsl90220726、 rsll4486436、 rsl39261704、 rsl42035154、 rsl46509511、 rsl88267792、rsl83291469、 rsll4495987、 rsll6690463、 rsl42716612、 rsll5326349、 rsll4215172、rsll530511U rsl50528380、 rsll4842164、 rsll5766057、 rsll6766359、 rsll4463114、rsl50105195、 rsl42447081、 rsll4212906、 rsll4475434、 rsll5827739、 rsl89111115、rsll5681000、 rsll6255593、 rsll5130140、 rsll6619302、 rsll5660274、 rsll5068492、rsll5683494、 rsll6193620、 rsll4233831、 rsll5655546、 rsll6812555、 rsll5586038、rsll5967895、rsll5837294、rsl85848342、rsll7652729、rsl92118756、rsl89253569、rsll6429420、 rsll5212249、 rsll6599568、 rsll5588141、 rsll7168997、 rsll6208261、rsll5372244、 rsll8005849、 rsll7246836、 rsll7200577、 rsll4618162、 rslll841098、rsll4370548、 rsll5788187、 rsl37884196、 rsll4251983、 rsll5690605、 rsll6815392、rsll4999980、rsll6234368、rsll7604452、rsll5646358。 在实际应用中，可采用罗氏454公司开发的Genome Sequencer FLX system等二代测序仪和PCR-SSOP-Luminex (主要仪器是美国Luminex公司的Luminexl00、200、3D流式点阵仪)，PCR-SSP，Sanger测序(AB公司的一代测序仪，3130，3130XL, 3730，3730XL)等检测人是否具有HLA-B*1301等位基因。上述1)、2)、3)和8)中的产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂盒和仪器的
组合产品。上述4)和5)中检测人是否具有HLA_B*1301等位基因可采用本领域已知的任一种检测等位基因存在的方法，如DNA特异性杂交法、以PCR为基础的HLA测序分型法和/或HLA血清学分型法。上述用途中，可以通过使用待测人的外周血制备的DNA、RNA、蛋白质、细胞或血清来检测人是否具有HLA-B*1301等位基因。上述6)和7)中，具体可将表达HLA_B*1301等位基因的离体细胞与待测药物接触，结合于HLA-B*1301等位基因的待测药物易于抑制HLA-B*1301等位基因的表达和/或功能，将结合于HLA-B*1301等位基因的待测药物作为候选药物进一步测试其治疗应答于氨苯砜的药物不良反应如氨苯砜高敏综合症的效力。所述药物不良反应是不希望的且非故意的药物作用，如在用于预防、诊断或治疗的剂量下发生的不良反应。如果一名患者发生药物不良反应的几率高于普通人群发生药物不良反应的几率，那么该患者具有发生药物不良反应的风险。在本申请的一个实施例中，对由76名DHS患者和1034名非DHS临床对照者组成的群体的研究结果表明，具有一个HLA-B*1301等位基因(一对同源染色体中只有一个染色体携带HLA-B*1301等位基因)的人，其使用DDS后发生DHS的风险是不具有HLA_B*1301等位基因的人的37. 53倍(置信水平O. 95上的置信区间是(18. 80，74. 94));具有两个·HLA-B^l301风险等位基因(一对同源染色体的两个染色体均携带HLA-B*1301等位基因)的人，其使用DDS后发生DHS的风险是不具有HLA-B*1301等位基因的人的110. 8倍(置信水平O. 95上的置信区间是(25. 85，474. 54))。在实际应用中，可通过检测是否具有HLA-B*1301等位基因来预测需用DDS治疗的患者是否会发生DHS。基于检测结果可以做风险预测，具有HLA-B*1301的个体，如用DDS治疗可能发生药物超敏反应，对于该类个体则建议使用其它药物替代治疗。不具有HLA-B*1301的个体，DDS治疗后发生药物超敏反应的可能性很低，因而可安全使用。
图I为HLA区域的关联信号。A显示HLA_B*1301(箭头所示)是MHC区域最显著关联的等位基因。重组率用浅蓝色的峰型图表示。导入的SNPs，等位基因和氨基酸用圆形标注，而菱形代表着分型的SNPs。不同的颜色代表了这些SNPs、等位基因和氨基酸和HLA-B*1301位点关联的程度。红色，关联系数>0. 8 ;橙色，关联系数=0. 5-0. 8 ;黄色，关联系数=0. 2-0. 5 ;灰色，关联系数〈O. 2 ;白色，关联系数=0。B显示通过控制HLA_B*1301位点进行条件分析后MHC区域的关联信号图，没有剩余的关联信号被观察到，显示该区域仅有HLA-B*1301这一个独立的信号。图2为采用HLA_B*1301作为预测标记对DHS进行风险预测的接受者操作特性曲线。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、HLA_B*1301等位基因是氨苯砜高敏综合征的风险遗传标记一、样本样本为人的外周血，包括病例样本、临床对照样本和健康对照样本。I、病例样本在研究中包含了 76名中国的DHS患者(39名用于研究的发现阶段，37名用于研究的验证阶段)。该76名患者因患麻风病接受联合化疗时应用了 DDS。患者中男女比例为I. 6:1，平均年龄为38岁。从开始服用DDS到出现DHS临床症状的时间为2_8个周(平均32. 79天)。最常见的皮损为斑丘疹(57. 7%)，其次为剥脱性皮炎(38. 5%)，猩红热样红斑(7. 7%)，口腔糜烂(I. 3%)。系统受累症状为发热(83. 1%)，肝功能异常(74. 4%)，淋巴结肿大(34. 6%)。实验室检查结果示血清肝酶异常升高58名患者谷丙转氨酶明显升高，49名患者天冬氨酸转氨酶明显升高，37名患者血红蛋白降低，35名患者血清胆红素异常升高。DHS的诊断依据于患者的病史，临床表现及实验室检查。2、临床对照样本研究中临床对照样本包括1034名非DHS患者(833名用于发现阶段，201名用于验证阶段)，该1034名非DHS患者均曾经是麻风病患者，均全部采用DDS作为联合化疗方案的一部分用于麻风病的治疗，这些临床对照样本均未出现过DHS的临床症状或异常的生物学指标。这些临床对照样本和病例样本在地域和民族上基本匹配。3、健康对照样本研究中健康对照样本包括1944名健康对照用于评估HLA_B*1301在中国人群中的频率。其中951名来自广东，523名来自山东，470名来自云南。其中，麻风病患者的诊断标准是符合下述4条中的2条或2条以上，或符合第3条者确立诊断1、皮损伴有感觉障碍及闭汗，或有麻木区；2、周围神经受累，表现为神经干粗大伴相应功能障碍；3、皮损组织切片或组织液涂片查到麻风杆菌；4、病理可见特征性改变。健康对照者的诊断标准无麻风病史及其他传染病病史，无其他自身免疫性疾病病史及家族史。二、方法I、发现阶段米用Illumina-660 芯片(Illumina Human 660ff-Quad beadchip)对病例样本中的39名DHS患者和临床对照样本中的833名非DHS患者进行了基因分型，将39名DHS患者和833名非DHS患者共430，276个SNPs用于全基因组扫描发现阶段的数据分析。利用亚洲人HAPMAP (国际人类单体型图计划)参考序列(包括北京汉族中国人，东京的中国人和日本人共178个个体)对病例样本中的39名DHS患者和临床对照样本中833名非DHS患者的每个个体进行HLA等位基因(二分和四分)及氨基酸的导入分析，总共66个经典的HLA 二分等位基因，118个经典的四分HLA等位基因，497个多态性氨基酸位置和4206个SNPs被导入，并同4636个分型获得的SNPs共同进行关联分析。关联分析结果(图I中A)显示位于6号染色体MHC区域(物理距离在26，000, 000-34, 000, 000) (NCBI bulid37)的单核苷酸多态性位点与氨苯砜临床应用后所产生的氨苯砜高敏综合征相关。通过对该区域采用logistic回归分析将阳性相关信号界定与HLA-B*1301和HLA_C*0304位点。这两个位点的关联系数是O. 74。另外对HLA-B*13 二分等位基因和497个多态性氨基酸位置进行关联分析显示，虽然其也具备关联信号，但均弱于HLA-B*1301。如果控制HLA-B*1301则MHC区域未见其他独立的信号(图I中B)。综上显示HLA-B*1301是DHS最主要的风险等位基因，HLA-B^l301 (P=2. 04X 1(T16 ；0R为21. 67，置信水平O. 95上的置信区间是(10. 41，45. 12))。2、验证阶段
为了进一步验证HLA_B*1301等位基因的关联性，采用454测序平台(罗氏454公司开发的Genome Sequencer FLX system)对病例样本中另外37名DHS患者和临床对照样本中另外201名非DHS患者(从全部1089名验证对照中随机选取)进行了 HLA分型。其中，分别采用引物对I和引物对2对样本的外周血基因组DNA进行PCR扩增HLA-B*1301等位基因。弓丨物对I由SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示的单链DNA组成；引物对2由SEQID No. 3和SEQ ID No. 4所示的单链DNA组成。HLA等位基因的召回采用HLA Caller软件在GATK执行，随后的关联分析采用logistic回归方法，结果显示HLA-B*1301(0R=23. 54，置信水平O. 95上的置信区间是(8. 71,63. 62) ；P=4. 74X10-10)。3、联合分析将发现和验证两个阶段的数据合并分析后发现HLA_B*1301等位基因与DHS具有很强的相关性(0R=22. 32，置信水平O. 95上的置信区间是(12. 40,40. 28)；P=6. 32X10_25)。采用454测序平台(罗氏454公司开发的Genome Sequencer FLX system)对病例样本中76名DHS患者和临床对照样本中1034名非DHS患者进行了 HLA分型，分型结果如表I所示。表I. HLA分型结果
不携带HLA-B*1301杂合携 HLA-B*1301纯合
样本
HLA-B=M 301者带者携带者
DHS 1
…10(13.2%)61 (80.3%)5 (6.6%)
(N=76)
对照886(85.5%)144(13.9%)4(0.4%)
权利要求
1.检测人是否具有HLA-B*1301等位基因的物质在制备检测或评价人发生应答于氨苯砜的药物不良反应风险的产品中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述应答于氨苯砜的药物不良反应为氨苯讽闻敏综合征。
3.检测人是否具有HLA-B*1301等位基因的物质在制备氨苯砜高敏综合征筛查产品中的应用。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于所述检测人是否具有HLA-B^l301等位基因的物质为a)和/或b): a)通过下述至少一种方法确定HLA-B*1301等位基因存在所用的试剂、试剂盒和/或仪器DNA特异性杂交法、以PCR为基础的HLA测序分型法以及HLA血清学分型法； b)检测人是否具有HLA-B*1301等位基因的等价遗传标记物的方法中所采用的试剂、试剂盒和/或仪器，所述HLA-B*1301等位基因的等价遗传标记物的存在指示HLA-B*1301等位基因的存在。
5.检测或评价人发生应答于氨苯砜的药物不良反应风险的产品，所述产品含有检测人是否具有HLA-B*1301等位基因的物质。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述检测人是否具有HLA-B*1301等位基因的物质为a)和/或b) a)通过下述至少一种方法确定HLA-B*1301等位基因存在所用的试剂、试剂盒和/或仪器DNA特异性杂交法、以PCR为基础的HLA测序分型法以及HLA血清学分型法； b)检测人是否具有HLA-B*1301等位基因的等价遗传标记物的方法中所采用的试剂、试剂盒和/或仪器，所述HLA-B*1301等位基因的等价遗传标记物的存在指示HLA-B*1301等位基因的存在。
7.检测或评价人发生应答于氨苯砜的药物不良反应风险的方法，其特征在于所述方法包括检测人是否具有HLA-B*1301等位基因，其中，具有HLA-B*1301等位基因的人使用氨苯砜后发生应答于氨苯砜的药物不良反应风险高于不具有HLA-B*1301等位基因的人，一对同源染色体的两个染色体均携带HLA-B*1301等位基因的人使用氨苯砜后发生应答于氨苯砜的药物不良反应风险高于一对同源染色体中只有一个染色体携带HLA-B*1301等位基因的人。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述应答于氨苯砜的药物不良反应为氨苯讽闻敏综合征。
9.一种开发治疗应答于氨苯砜的药物不良反应的方法，其包括使用HLA-B*1301等位基因作为靶点的测定法来鉴别和/或筛选候选药物。
10.一种开发治疗氨苯砜高敏综合症的方法，其包括使用HLA-B*1301等位基因作为靶点的测定法来鉴别和/或筛选候选药物。
全文摘要
本发明公开了HLA-B*1301等位基因的用途。本发明所公开的HLA-B*1301等位基因的用途包括1)检测人是否具有HLA-B*1301等位基因的物质在制备评价人)发生应答于氨苯砜的药物不良反应风险的产品中的应用；2)检测人是否具有HLA-B*1301等位基因的物质在制备氨苯砜高敏综合症筛查产品中的应用；3)检测或评价人发生应答于氨苯砜的药物不良反应风险的方法，所述方法包括检测人是否具有HLA-B*1301等位基因，其中，具有HLA-B*1301等位基因的人使用氨苯砜后发生药物不良反应风险高于不具有HLA-B*1301等位基因的人，一对同源染色体的两个染色体均具有HLA-B*1301等位基因的人使用氨苯砜后发生药物不良反应风险高于一对同源染色体中只有一个染色体具有HLA-B*1301等位基因的人。
文档编号C12Q1/68GK102925567SQ201210407149
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者张福仁, 陈树民, 刘红 申请人:山东省皮肤病性病防治研究所