专利名称：一种超声裂解细胞或剪切大分子装置及其使用方法
技术领域：
本发明涉及裂解细胞或剪切大分子技术领域中的一种装置及其使用方法，特别涉及一种利用超声对液体样品中目标细胞及目标大分子进行裂解和剪切操作的装置及其使用方法。
背景技术：
目前大部分生物学研究和医学检测都是在分子水平上进行的，破碎细胞获取其中的DNA、RNA或蛋白质等生物大分子是这些分析和检测过程所必需的步骤。超声破胞是实验室中一种常规的破胞方法，特别适用于具有坚韧细胞壁的细菌的破胞处理。虽然关于破胞原理还没有特定的理论加以肯定，但是一般都认为超声破胞的机制是利用超声在液体介质中产生的空化效应来实现的。超声空化通常是指液体中存在的微小气泡(空化核)在超声波作用下被激活所表现出的振荡、生长、收缩、崩溃等一系列动力学过程。空化泡崩溃瞬间，在液体中的极小空间内将其高度集中的能量释放出来，形成异乎寻常的高温高压、强冲击波、射流等极端物理条件，这样极端的物理条件可以轻易将细胞破碎。
传统的超声破胞装置是探头式的，通常由变幅杆、夹心式超声换能器和超声电源组成。由于破胞操作时需将超声探头浸入待破碎的细胞悬液中，所以这种装置在进行不同样品的破碎时易引起交叉污染，且对于不同体积的样品需要购买和更换不同的探头，一方面增加了仪器费用和实验操作的复杂性；另一方面由于超声电源须适用于不同的探头，因而也增加了电源制作的复杂性，不易实现微型化。另外由于受探头形状和体积限制，探头式超声破胞装置无法应用于微量样品的破碎和剪切处理，而目前分子生物学研究和医学检测通常操作的样品体积都是微升级的，因而此类装置在实际应用中受到很大限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、不引起样品交叉污染、可处理微量样品的超声裂解细胞或剪切大分子装置。
本发明提供的超声裂解细胞或剪切大分子装置包括形成聚焦声场的超声换能器和带样品容器插入孔的样品容器支架结构；所述超声换能器与所述样品容器支架结构形成一个封闭空腔，超声换能器至少构成封闭空腔底部的一部分。
所述装置还包括超声换能器支撑结构；该支撑结构位于所述超声换能器的下部。
所述超声换能器是具有聚焦功能的球形凹面或椭球形凹面超声换能器、具有聚焦功能的圆管状超声换能器或具有聚焦功能的由Fresnel环状电极构成的圆形平板超声换能器。所述超声换能器支撑结构是管状基座或其他中空结构的基座。所述超声换能器应至少是封闭空腔底部的一部分。在某些情况下，超声换能器构成封闭空腔的整个底部。
任何合适的样品容器支架结构均可用于构建本发明的剪切装置。样品容器支架结构可以是一个样品管支架或者是一个加工有腔体结构的块状体。最好是一种配有多个管座的样品管支架，这些管座是可拆卸和替换的以适应不同样品体积。
任何合适的液体耦合介质均可用于构建本发明的剪切装置。液体耦合介质可以是一种高沸点的液体如水。液体耦合介质的液面应尽量接近聚焦声场的焦平面。最好是液体耦合介质的液面正处于聚焦声场的焦平面。
任何样品容器均可用于构建本发明的剪切装置。比如，样品容器可以是管状容器如试管或离心管。样品可以是任何适合的体积，比如1微升至10毫升范围内的样品体积。
样品容器的底部应尽量接近聚焦声场的焦平面。一般样品容器的底部应位于液体耦合介质液面上0～5毫米的范围内。
任何合适的超声电源均可用于本发明中用以产生超声。最好超声电源在功率和作用时间上是可调的。另外，最好超声电源的工作频率尽可能等于或接近超声换能器的频率。
本发明的剪切装置可以以任何合适的方式工作，如连续式或脉冲式。
本发明的第二个目的是提供一种超声裂解细胞或剪切大分子的方法。
一种超声裂解细胞或剪切大分子的方法，该方法包括1)在超声裂解细胞或剪切大分子装置的封闭空腔中盛装液体耦合介质，并使其液面处于或接近超声换能器形成的聚焦声场的焦平面处；2)将含有待裂解目标细胞或待剪切目标大分子的液体样品盛装于样品容器中，并使样品容器底部位于或接近超声换能器形成的聚焦声场的焦平面处；3)将超声换能器连接于一个超声电源上以产生聚焦超声，产生的聚焦声场指向含有待裂解目标细胞或待剪切目标大分子的液体样品。
本方法的一个具体应用即裂解目标细胞。任何合适的目标细胞均可利用本方法进行裂解。典型的目标细胞包括动物细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞、人工重组细胞或培养细胞。动物细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞可以取自动物界、植物界、真菌界或细菌界的任何种属或亚种。取自纤毛虫、细胞型粘液菌、鞭毛虫和小孢子虫的任何种属或亚种的细胞也可用本方法进行裂解。取自鸟类如鸡，脊椎动物类如鱼，哺乳动物类如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、奶牛、公牛、绵羊、山羊、马、猴和其它非人类的灵长类动物以及人的细胞均可用本方法进行裂解。
对动物细胞而言，取自某一特定组织或器官的细胞均可用本方法进行裂解。如可用于分析结缔组织、上皮组织、肌肉组织或神经组织的细胞。同样，取自以下器官的细胞均可用本方法进行裂解，如眼部附属器官、环旋器官、耳部器官、契维茨器官、室周器官、柯蒂氏器官、紧要器官、造釉器、末端器官、雌性外生殖器官、雄性外生殖器官、浮动器官、罗芬尼花枝状器官、生殖器官、高尔基腱器官、味觉器官、听觉器官、雌性内生殖器官、雄性内生殖器官、(昆虫)阳茎、雅各布逊氏器、神经体液器官、神经腱器官、嗅觉器官、耳石器官、下垂器官、罗森苗勒器官、感觉器官、螺旋器官、副联接器官、小穹窿器官、额外器官、 靶子器官、触觉器官、泌尿器官、终板血管器官、前庭器官、前庭耳蜗器官、退化器官、视觉器官、犁鼻器、游走器官、韦伯氏器官和主动脉旁体器官等。最好待裂解的细胞是取自动物体内部器官如脑、肺、肝脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨骼、软骨、胰腺、肾脏、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、腺体、内部血管等。另外，取自任何植物体、真菌如酵母、细菌如真细菌或古细菌的细胞均可裂解。取自任何真核或原核生物体(如动物、植物、真菌或细菌)的重组细胞也可裂解。存在于体液(如血液、尿液、唾液、骨髓、精液或其它腹水类流体)及其某些分离成分(如血清或血浆)中的细胞也可裂解。
本方法尤其适于裂解具有细胞壁的细胞，如植物细胞、真菌细胞和细菌细胞。
本方法的另一个具体应用即剪切目标生物大分子。任何合适的生物大分子均可利用本方法进行剪切。如本方法可剪切DNA或RNA。任何核酸包括单链、双链、和三链核酸均可用本方法剪切。上述核酸包括DNA(如A-，B-或Z-形DNA)和RNA(如mRNA，tRNA和rRNA)。
本发明的超声裂解细胞或剪切大分子装置及其系统产生的聚焦声场在较低功率条件下亦可在局部区域(焦域)产生足以实现破胞的强烈超声空化效应，可对少量细胞和生物大分子(比如核酸)样品进行破碎和剪切处理。由于此装置所需功率相对较小，且操作中无需更换部件，对超声电源而言声负载为固定的，因此对超声电源要求较低，制作相对简单。而且此装置不受样品管形状和体积限制，可直接用于微量细胞和核酸样品的处理。
本发明的超声裂解细胞或剪切大分子装置及其系统是以产生聚焦声场的特定形状超声换能器取代传统的探头式超声破胞装置，具有结构简单、无交叉污染、操作简便、成本低廉、体积小可集成到微型系统等优点。
图1为裂解细胞或剪切大分子装置的结构示意2为本发明实施例1的电泳结果3为本发明实施例2的电泳结果4为本发明实施例3的电泳结果图具体实施方式
实施例1、超声裂解细胞或剪切大分子装置如图1所示，本发明的超声裂解细胞或剪切大分子装置包括一个球形凹面超声换能器1、超声换能器支撑结构(圆管形底座)2、带样品容器插入孔的样品容器支架结构(样品管支架)3和一个可调超声电源。球形凹面超声换能器1通过一个圆管形底座2支撑，凹面朝上放置，一个用以放置样品管的圆管形样品管支架3通过粘性防水胶固定于底座2上，样品管支架3与球形凹面超声换能器1的凹面构成盛装液体耦合介质4的封闭空腔(容器)，其中液体耦合介质4的液面接近球形凹面超声换能器1的焦平面为宜；为了适用于不同体积样品，一个可拆换的管座5与样品管支架3组合成可放置不同型号小离心管6的支架，其中小离心管6的底部应置于液体耦合介质4液面上下5毫米范围内，以达到较佳破胞效果。待破碎的细胞悬液7盛装于小离心管6中，一个可调超声电源8通过导线9与球形凹面超声换能器1连接，驱动其发射超声。
实施例2、裂解大肠杆菌(1)、400μL过夜培养的大肠杆菌等体积分装到两个0.5mL微型离心管中，离心60秒，弃上清。然后每管分别加50μl去离子水重悬菌体，振荡混匀。
(2)、将上述其中一管置于实施例1中球形凹面聚焦型超声破胞装置的样品管支架上(如图1所示)，调节超声电源输出电压为35Vpp，开通超声发生器电源，进行30秒超声破胞处理；(3)、将经超声破胞处理和未经超声破胞处理的上述各一管菌液均离心2分钟(13,400rpm)，然后分别转移上清至新的离心管，并加入等体积的酚/氯仿充分混匀；(4)、将上述两管混合液离心6分钟(13,400rpm)，并分别转移上层水相至新的离心管；(5)、从上述两离心管中分别取8μl样液进行琼脂糖凝胶电泳检测。
电泳结果如图2所示泳道A-DNA marker(λDNA/Hinder III)；泳道B-未经超声破胞处理的样品；泳道C-经过球形凹面聚焦型超声破胞装置处理的样品。电泳结果显示大肠杆菌经球形凹面聚焦型超声破胞装置处理后，可被检测到核酸释放物。证明球形凹面聚焦型超声破胞装置可裂解大肠杆菌。
实施例3、裂解酵母菌(1)、取过夜培养的酵母菌菌液两管(200μl/管)离心1分钟(10,000rpm)，弃上清；(2)、上述两管分别以50μl破菌液重悬菌体，振荡混匀；(3)、将上述其中一管置于实施例1球形凹面聚焦型超声破胞装置的样品管支架上(如图1所示)，调节超声电源输出电压为35Vpp，开通超声发生器电源，进行30秒超声破胞处理；(4)、将经超声破胞处理和未经超声破胞处理的两管菌液均离心2分钟(13,400rpm)，然后分别转移上清至新的离心管，并加入等体积的酚/氯仿充分混匀；(5)、将上述两管混合液离心6分钟(13,400rpm)，并分别转移上层水相至新的离心管；(6)、从上述两离心管中分别取8μl样液进行琼脂糖凝胶电泳检测。
电泳结果如图3所示泳道a-DNA marker(λDNA/Hinder III)；泳道b-未经超声破胞处理的酵母菌样品；泳道c-经过球形凹面聚焦型超声破胞装置处理的酵母菌样品。电泳结果显示酵母菌经球形凹面聚焦型超声破胞装置处理后，可被检测到核酸释放物。证明球形凹面聚焦型超声破胞装置结合破菌液可迅速裂解具有坚韧细胞壁的酵母菌。
试剂破菌液(1％SDS，50mM EDTA，0.1M Tris；pH8.0)实施例4、剪切λDNA(1)、以0.8ml小离心管取10μl浓度为0.12μg/μl的λDNA样液，并将小离心管置于实施例1球形凹面聚焦型超声破胞装置的支架上(如图1所示)，调节超声电源输出电压为35Vpp，开通超声电源，进行5分钟超声剪切处理；(2)、从上述离心管中取8μl样液与等量未经处理的λDNA样液同时进行琼脂糖凝胶电泳检测。
电泳结果如图4所示泳道A’-DNA marker(λDNA/Hinder III)；泳道B’-未经超声破胞处理的λDNA；泳道C’-经过球形凹面聚焦型超声破胞装置处理的λDNA；泳道D’-DNA marker(DL2000，Takara)。电泳结果显示λDNA经球形凹面聚焦型超声破胞装置处理5分钟后，几乎完全被降解，证明球形凹面聚焦型超声破胞装置可以迅速有效地剪切长链DNA。
权利要求
1.一种超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于该装置包括形成聚焦声场的超声换能器和带样品容器插入孔的样品容器支架结构；所述超声换能器与所述样品容器支架结构形成一个封闭空腔，超声换能器至少构成封闭空腔底部的一部分。
2.根据权利要求1所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述装置还包括超声换能器支撑结构；该支撑结构位于所述超声换能器的下部。
3.根据权利要求2所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述超声换能器支撑结构是管状基座或其它形状的中空结构基座。
4.根据权利要求1所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述超声换能器是具有聚焦功能的球形凹面或椭球形凹面超声换能器、具有聚焦功能的圆管状超声换能器或具有聚焦功能的由Fresnel环状电极构成的圆形平板超声换能器中的一种。
5.根据权利要求1所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述超声换能器构成封闭空腔的整个底部。
6.根据权利要求1所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述样品容器支架结构是一个样品管支架或一个有腔体结构的块状体。
7.根据权利要求6所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述样品管支架配有一套可拆卸和替换的管座。
8.根据权利要求1所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于在所述封闭空腔中装有高沸点的液体耦合介质。
9.根据权利要求8所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述液体耦合介质的液面位于所述超声换能器形成的聚焦声场的焦平面上。
10.据权利要求1所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于在所述样品容器支架结构的样品容器插入孔中插有管状容器。
11.根据权利要求10所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述管状容器是指形试管或离心管。
12.根据权利要求10或11所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述管状容器中装有体积为1微升-10毫升的液体样品。
13.根据权利要求10或11所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述样品容器底部位于所述超声换能器形成的聚焦声场的焦平面上。
14.根据权利要求10或11所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于在所述封闭空腔中装有高沸点的液体耦合介质，所述样品容器底部在液体耦合介质液面上0-5毫米内。
15.根据权利要求1所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述超声换能器连接有功率和作用时间可调的超声电源。
16.根据权利要求15所述超声裂解细胞或剪切大分子装置，其特征在于所述超声电源的工作频率等于或接近超声换能器的谐振频率。
17.一种超声裂解细胞或剪切大分子的方法，该方法包括1)在超声裂解细胞或剪切大分子装置的封闭空腔中盛装液体耦合介质，并使其液面处于或接近超声换能器形成的聚焦声场的焦平面处；2)将含有待裂解目标细胞或待剪切目标大分子的液体样品盛装于样品容器中，并使样品容器底部位于或接近超声换能器形成的聚焦声场的焦平面处；3)将超声换能器连接于一个超声电源上以产生聚焦超声，产生的聚焦声场指向含有待裂解目标细胞或待剪切目标大分子的液体样品。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于所述目标细胞选自动物细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞、人工重组细胞或培养细胞。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于所述目标大分子是DNA或RNA。
全文摘要
本发明公开了一种超声裂解细胞或剪切大分子装置及其使用方法，目的是提供一种操作简便、不引起样品交叉污染、可处理微量样品的超声裂解细胞或剪切大分子装置及其使用方法。本发明所提供的装置包括形成聚焦声场的超声换能器和带样品容器插入孔的样品容器支架结构；所述超声换能器与所述样品容器支架结构形成一个封闭空腔，超声换能器至少构成封闭空腔底部的一部分。超声裂解细胞或剪切大分子的方法，包括1)在装置的封闭空腔中盛装液体耦合介质；2)将含有样品的容器底部位于或接近超声换能器形成的聚焦声场的焦平面处；3)将超声换能器连接于超声电源上产生聚焦超声。本发明的超声裂解细胞或剪切大分子装置可广泛用于处理动物、植物、微生物样品。
文档编号C12M1/00GK1524948SQ03105349
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月25日 优先权日2003年2月25日
发明者李刚, 郭旻, 程京, 李 刚 申请人:清华大学, 北京博奥生物芯片有限责任公司