专利名称：：多亚基多表位流感疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基于多亚基多表位肽的疫苗。特别是，本发明涉及引起对流感的保护性免疫的基于多亚基多表位肽的疫苗的用途。发明背景多表位疫苗已知B细胞表位、T辅助细胞表位和细胞毒性T淋巴细胞表位在这两种免疫应答中都起着重要作用。显然，对于有效接种，应该诱导广谱且持久的体液和细胞应答。对于具有高突变率的病毒如流感病毒和人免疫缺陷病毒仍然没有广谱且有效的疫苗。在抗原剂量和特异性B细胞应答之间具有密切的关系。使用由与不同量的表位肽偶联的相同量的载体蛋白组成的化学偶联的载体蛋白和表位肽系统的研究已经显示，表位密度急剧地影响了T辅助细胞依赖的IgG应答(Jegerlehner等人，EurJImmunol.(欧洲免疫学杂志)2002,32:3305-14)。Liu等人(Vaccine(免疫)200423(3):366-71)观察到表位密度对用谷胱苷肽-s-转移酶融合蛋白免疫的小鼠和兔的体液应答的积极效果，所述融合蛋白携带流感病毒的M2蛋白的不同拷贝数的M2e肽表位(1、2、4、8和16个拷贝)。在相同研究中，致死性攻击测定显示了具有更高表位密度的融合蛋白获得了更高的存活率和更慢的体重减轻。已经开发了多表位疫苗即包括一个以上表位的疫苗用于多种多样的应用。非详尽列举的例子包括例如美国专利第6，063，386号中公开的用于链球菌的重组多价疫苗；美国专利第6，828，416号中公开的用于治疗疟疾的疫苗，所述疫苗包括单一蛋白，所述单一蛋白包括从寄生虫恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)的生活周期的不同阶段得到的肽；在美国专利申请2007/0056315中公开的包括多肽的抗肿瘤免疫原性组合物，所述多肽包括前列腺干细胞抗原表位；以及抗HIV(国际公开WO01/24810)、风疹病毒(参见国际公开WO93/14206)和丙型肝炎病毒(国际公开W001/21189)的多表位抗病毒疫苗。国际公开W02006/069262公开了包括用于在受试者中剌激免疫应答的流感病毒蛋白的病原相关分子模式(PAMP)和表位的组合物、融合蛋白和多肽。PAMP是在微生物中发现的分子基序(例如蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质)，其能够在宿主中触发先天免疫应答，即用作佐剂。在一些实施方案中，融合蛋白包括多个拷贝的M2e流感表位。国际公开W02006/078657公开了包括黄病毒蛋白的一种或多种PAMP和多表位的类似融合蛋白和多肽。流感流感是由三种主要亚型A、B和C型流感病毒引起的疾病，它们根据其抗原决定簇来分类。流感病毒颗粒由单链RNA基因组组成，所述单链RNA基因组与核蛋白(NP)紧密相关且由脂蛋白包膜包封，所述脂蛋白包膜通过基质蛋白(Ml)加衬并且携带两个主要的表面糖蛋白抗原，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA和NA糖蛋白最容易改变；例如具有16种免疫类型的HA和9种不同NA类型，这提供了用于不同流感病毒亚型如H1N1或H3N2的基础。A型流感病毒具有另外的跨膜糖蛋白M2，它在不同HN亚型之间高度保守。M2基因编码在病毒颗粒细胞表面上表达为四聚体的具有96-97个氨基酸的蛋白。它由约24个细胞外氨基酸、约19个跨膜氨基酸和约54个细胞质残基组成(Lamb等人，Cell(细胞)1985;40:627-633)。A和B型流感病毒是人类中最常见的流感病因。流感对公众健康产生巨大的影响，除了包括发病率和甚至死亡率的破坏性的健康问题以外，还具有严重的经济影响。感染可以是轻度、中度或重度，从无症状到轻微上呼吸道感染和气管支气管炎到严重、偶尔致死的病毒性肺炎。流感病毒具有给疫苗制备提供挑战的两个重要的免疫学特征。第一个涉及每几年发生在表面糖蛋白中的基因改变，称为"抗原性漂移"。该抗原改变产生了规避由现有疫苗所引起的抗性的病毒。公众健康主要关注的第二特征是流感病毒，尤其A型流感病毒能够交换基因材料且融合。称为"抗原性漂移"的该过程导致了不同于两种母体病毒的新菌株，它能够是致命流行株。流感病毒抗原和疫苗牛产针对流感病毒的免疫受到了病毒抗原变异以及感染限制在呼吸粘膜的限制。目前可获得的流感疫苗基于整个无活性病毒，呈递在细菌细胞表面上的病毒蛋白，或者携带病毒抗原决定簇的鞭毛蛋白。HA是强的免疫原且是界定不同病毒株的血清学特异性的最重要的抗原。HA分子(75-80D)包括多个抗原决定簇，它们的几种是在不同株中经历序列改变的区域(株特异性决定簇)和其它是在许多HA分子中保守的区域(共同决定簇)。由于这些变化，流感疫苗需要至少每几年被改变。许多流感抗原以及由此制备的疫苗在本领域中是已知的。美国专利第4，474，757号公开了抗流感病毒感染的疫苗，其由对应连接于适合的大分子载体如氨基酸的聚合物或破伤风类毒素的HA的抗原性片段的合成肽组成。本发明的一些发明人的PCT国际公开W093/20846教导了抗多种不同流感病毒株的合成重组疫苗，其包括至少一种重组蛋白，所述重组蛋白包括鞭毛蛋白的氨基酸序列和流感病毒HA或NP的表位的至少一个氨基酸序列，或者所述嵌合蛋白的聚集体。在该方法之后，基于三种表位的合成重组抗流感疫苗被发现在小鼠中是高度有效的。举例的疫苗包括鞭毛蛋白嵌合体，所述鞭毛蛋白嵌合体包括HA91-108表位、在所有H3株中保守且诱发抗流感中和抗体的来自HA的B细胞表位，以及诱导MHC限制性免疫应答的一种或两种T辅助细胞或CTLNP表位(分别是NP55-69和NP147-158)。包括三种以上所述嵌合体的组合的疫苗被认为提供了对病毒感染的最佳保护。本发明的一些发明人的美国专利第6，740，325号教导了基于合成肽的人流感疫苗，其包括流感病毒的至少4种表位，所述流感病毒表位与人细胞反应，所述表位包括(i)—种B细胞血凝素(HA)表位；(ii)能够结合于许多HLA分子的一种T辅助细胞血凝素(HA)或核蛋白(NP)表位；以及(iii)限于不同人群特别是特定民族或种族群中的最普遍的HLA分子的至少两种细胞毒性淋巴细胞(CTL)核蛋白(NP)或基质蛋白(M)表位。流感肽表位能够在重组沙门氏菌鞭毛蛋白内表达。该疫苗要求至少四种嵌合多肽的烦琐制备。本发明的一些发明人的PCT国际公开W02007/066334公开了能引起长期且交叉株保护的疫苗，其包括多种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包括至少两种流感病毒肽表位，其中至少一种表位是A型流感病毒基质蛋白M肽表位，第二表位是血凝素HA肽表位。还有，在该情况下，流感肽表位能够在重组沙门氏菌鞭毛蛋白内表达。哺乳动物常常具有对鞭毛抗原的获得性免疫应答。然而，临床数据已经显示，动物流感中的有效剂量的重组鞭毛蛋白在人受试者中具有不利效果，包括高烧，可能归因于高鞭毛蛋白/抗原比率。还怀疑，高浓度的鞭毛蛋白对心脏具有瞬时效果。因此，对于能够诱导具有宽特异性、持久的体液和细胞应答的基于流感肽表位的疫苗存在着未满足的需求。还对具有简化生产和质量控制过程的疫苗存在着需求。发明概述本发明提供了流感疫苗，其克服了已知的抗流感的疫苗的缺陷，包括高载体与抗原比率和高佐剂与抗原比率的不利效果。本发明的疫苗包括多肽，所述多肽包括多个拷贝的多种流感病毒肽表位，提供了多重多样性、高密度的疫苗。根据本发明，多亚基多表位多肽能够作为分离的多肽或作为融合蛋白来重组产生，或者通过连接多种合成肽来合成产生，或者可以与外部佐剂混合或配制。本发明的多亚基多肽含有流感病毒B细胞表位、T辅助细胞表位和细胞毒性淋巴细胞(CTL)表位的组合。所述表位优选选自血凝素(HA)肽、基质蛋白(M1和M2)肽和核蛋白(NP)肽。所述表位具有对抗几种人流感亚型的可证明的交叉保护活性且因为它们改进的能力被选择来诱导细胞和体液免疫应答。令人惊奇地发现，根据本发明的几种多亚基多肽即使不偶联于载体蛋白或者不是载体蛋白的一部分的情况下在引起免疫应答中是有活性的。此外，由于由该多肽携带的免疫原性表位的高密度和多样化，该疫苗引起了强的免疫应答，甚至不需要佐剂。另外，大量不同免疫原性表位在单一多肽中的包含有利于生产工序和质量控制。在第一方面，本发明提供了合成或重组多肽，其包括多种流感病毒肽表位，各表位在单一多肽中存在至少两次。在本发明的上下文中，"多亚基"多肽是含有多个重复(至少两个，典型地至少三个或更多)的，不必相邻的多肽的氨基酸链的多肽。术语"多亚基多表位"因此涉及含有多个重复的多种表位的多肽。根据该方面，本发明提供了合成或重组的流感多表位多肽，其包括以交替的顺序聚合物结构(W3.)n或者以嵌段共聚物结构(X》n(X2)n(X丄.(Xjn排列的多个拷贝的多种流感病毒肽表位。根据本发明的合成或重组的流感多表位多肽选自由以下组成的组i.B(X^X^.Xm)nB;以及ii.B(Xi)nZ(X2)nZ...(Xm)nB;其中B是1-4个氨基酸残基的任选序列；n在每次出现时独立地是2_50的整数；m是3-50的整数；&，X2...Xm的每一个是由4-24个氨基酸残基组成的流感肽表位；Z在每次出现时是键或1-4个氨基酸残基的间隔子；且其中多肽中的氨基酸残基的最大数是约1000。根据一些实施方案，n在每次出现时独立地是2-50的整数；m是3-15的整数；X「Xm的每一个是选自由4-24个氨基酸残基组成的B细胞型表位、T辅助细胞(Th)型表位和细胞毒性淋巴细胞(CTL)型表位组成的组的流感肽表位；且多肽中的氨基酸残基的最大数是约600。7[OO32]根据其它实施方案，流感肽表位选自由血凝素(HA)肽、M1肽、M2肽和核蛋白(NP)肽组成的组。根据一些具体实施方案，m是9且n是3-5的整数。根据其它实施方案，流感肽表位选自由SEQIDNO:1至SEQIDNO:82组成的组。根据一些具体实施方案，流感肽表位选自根据表1的表位El-E9:表1:流感肽表位El至E9<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根据更多的具体实施方案，流感肽表位由以下组成HA354-372(El，SEQIDNO:82)、HA91-108(E2，SEQIDNO:48)、M12-12(E3，SEQIDNO:25)、HA150-159(E4，SEQIDN0:52)、HA143-149(E5，SEQIDNO:51)、NP206-229(E6，SEQIDNO:64)、HA307-319(E7，SEQIDNO:59)、NP335—350(E8，SEQIDNO:69)，以及NP380—393(E9，SEQIDNO:70)。还根据其它实施方案，多肽序列选自由以下组成的组SEQIDNO:84、SEQIDNO:86和SEQIDNO:88。根据一些实施方案，所述多肽包括以下列交替的顺序聚合物结构[ElE2E3E4E5E6E7E8E9]n排列的九种不同流感病毒肽表位，其中n是3或5;E1是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDN0:52)，E5是HA143-149(SEQIDN0:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SFQIDNO:70)。根据其它实施方案，所述多肽包括以下列嵌段共聚物结构[E1E1E1-E2E2E2-E3E3E3-E4E4E4-E5E5E5-E6E6E6-E7E7E7-E8E8E8-E9E9E9]排列的九种不同流感病毒肽表位的三个重复其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDNO:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。还根据其它实施方案，所述多肽包括以下列交替的顺序聚合物结构[ElE2E3E4E5]e排列的五种不同B细胞型流感病毒肽表位的六个重复，其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDN0:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDN0:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)。根据其它实施方案，所述多肽包括以下列交替的顺序聚合物结构[E7E8E9E6]e排列的四种不同T细胞型流感病毒肽表位的六个重复，其中E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDN0:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。还根据其它实施方案，所述多肽包括以下列交替的顺序聚合物结构[E7E8E9E6]n排列的四种不同T细胞型流感病毒肽表位的四个重复，其中n是6，且其中E6是NP206-229(SEQIDN0:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)，且其中所述多亚基多肽与载体蛋白融合。根据其它实施方案，所述多肽包括以下列嵌段共聚物结构[E2E2E2E2E2E2-E1E1E1E1E1E1-E3E3E3E3E3E3-E4E4E4E4E4E4-E5E5E5E5E5E5-E6E6EE6E6E66-E7E7E7E7E7E7-E8E8E8E8E8E8-E9E9E9E9E9E9]排列的九种不同流感病毒肽表位的六个重复，其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDN0:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDN0:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。在多种实施方案中，所述多肽包括每一表位的至少两个重复，典型地每一表位的至少三个重复，可选择地至少四个重复，可选择地至少五个重复，可选择地每一表位的至少六个重复，最高每一表位的至少50个重复。为了改进表位暴露于免疫系统，所述表位优选通过间隔子分隔，根据某些实施方案，所述间隔子由单个氨基酸组成，根据其它实施方案，所述间隔子包括至少一个氨基酸或者是肽。优选地，所述间隔子由l-4个中性氨基酸残基组成。根据具体实施方案，所述合成或重组流感多表位多肽由以交替的顺序聚合物结构(XA;)n或嵌段共聚物结构(X》n(X丄(X3)n.(Xjn排列的多个拷贝的多种流感病毒肽表位组成。在本发明的该方面的一些实施方案中，所述多亚基多表位多肽包括至少两种流感肽表位，其中至少一种选自由B细胞型表位、T辅助细胞(Th)型表位和细胞毒性淋巴细胞(CTL)型表位组成的组。在一些实施方案中，所述流感肽表位选自由血凝素(HA)肽表位、基质蛋白(M1或M2)肽表位和核蛋白(NP)肽表位组成的组。在某些优选实施方案中，所述肽表位选自由根据表1的表位El至E9组成的组。提供了多个示例性实施方案，包括选自表l中的表位，其中用于各表位的重复的数目是相同或不同的，且其中所述多肽能够以交替顺序聚合物结构或嵌段共聚物结构排列。术语"交替顺序聚合物"结构表示在多肽中含有的所有表位的单个拷贝顺序地排列，且该排列顺序地重复等于重复数的次数。例如，如果多亚基多表位多肽包括交替序列结构的三种表位&、&和&的四个重复，那么所述多肽具有以下聚合物结构XAX3-X^2X3-XJ2X3-XJ2X3，还写为^2^]4。术语"嵌段共聚物"结构表示在所述多肽中含有的单个表位的所有拷贝相邻地排列。例如，包括嵌段共聚物结构的三种表位&、^和^的四个重复的类似的多亚基多表位多肽具有下列聚合物结构XAXA-XJJJ厂X3X3X3X3，还写为[A]4-[B]4-[C]4。根据一些实施方案，所述间隔子的至少一个氨基酸对所述多肽的片段诱导了特殊构象(例如脯氨酸残基)。还根据其它实施方案，所述间隔子包括可切割的序列。根据一个实施方案，所述可切割的间隔子被细胞内酶切割。根据另一个具体实施方案，所述可切割的间隔子包括蛋白酶特异性可切割的序列。根据一些实施方案，多亚基多肽优选不与载体融合蛋白轭合且缺乏载体融合蛋白。在其它实施方案中，本发明的多肽可以进一步包括载体序列，即所述肽表位被插入到载体多肽的序列内或者偶联于载体序列。根据一些实施方案，所述多亚基多肽作为包括载体序列的重组融合蛋白产生。在一些具体实施方案中，所述载体序列是细菌鞭毛蛋白或其一部分。在某些实施方案中，所述多表位多肽被插入在鞭毛蛋白的高可变区，从而形成含有多亚基多表位多肽的重组鞭毛蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，所述多肽融合到所述载体蛋白的氨基端或羧基端部分。根据另一个方面，本发明提供了编码流感多表位多肽的分离的多核苷酸序列。根据一些实施方案，分离的多核苷酸序列编码选自由SEQIDNO:84、SEQIDNO:86和SEQIDNO:88组成的组的多肽序列。根据具体实施方案，分离的多核苷酸序列包括选自由SEQIDNO:83、SEQIDNO:85和SEQIDNO:87组成的组的序列。还根据又一个方面，本发明提供了用于抗流感而免疫受试者的疫苗组合物，其包括至少一种合成或重组的流感多表位多肽，所述多肽包括以交替顺序聚合物结构(XA;)n或嵌段共聚物结构(X》n(X丄(X3)n.(Xjn排列的多个拷贝的多种流感病毒肽表位。根据一些实施方案，所述疫苗组合物包括至少两种此类多肽。根据一些实施方案，所述疫苗包括两种多肽，其中第一多肽包括多种B细胞型流感病毒肽表位，且第二多肽包括多种T细胞型流感病毒肽表位。根据一个具体实施方案，所述第一多肽是多肽权利要求18[E1E2E3E4E5]6，其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA9H08(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDN0:25)，E4是HA150-159(SEQIDNO:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51);且所述第二多肽是多肽[E7E8E9E6]6，其中E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDN0:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)，或者所述第二多肽是包括多肽[E7E8E9E6]n的融合载体蛋白，其10中n是6，且其中E6是NP206-229(SEQIDN0:64)，E7是HA307-319(SEQIDN0:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，且E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。本发明的另一个方面提供了用于免疫受试者的疫苗，所述疫苗包括多亚基多表位多肽，所述多肽包括多种流感病毒肽表位。在一些实施方案中，所述疫苗包括每一表位的至少三个重复，可选择地至少四个重复，可选择地至少五个重复，可选择地每一表位的至少六个重复。在一些实施方案中，所述表位被间隔子分隔，所述间隔子可以是单个氨基酸或至少两个氨基酸的肽。在一些实施方案中，所述疫苗包括至少两种流感肽表位，其中至少一种表位选自由B细胞型表位、T辅助细胞(Th)型表位和CTL型表位组成的组。在一些实施方案中，所述流感肽表位选自由血凝素(HA)肽表位、M1肽表位、M2肽表位和NP肽表位组成的组。在优选实施方案中，所述肽表位选自由以上表1中的表位El至E9组成的组。在一个实施方案中，所述疫苗包括根据交替顺序聚合物结构[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]3排列的九种表位E1-E9的三个重复。在另一个实施方案中，所述疫苗包括根据交替的顺序聚合物结构[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]5排列的九种表位的五个重复。还在又一个实施方案中，所述疫苗包括根据嵌段共聚物结构[El]3-[E2]3-[E3]3-[E4]3-[E5]3_[E6]3-[E7]3-[E8]3-[E9]3排列的九种表位的三个重复。还在又一个实施方案中，所述疫苗包括根据嵌段共聚物结构[El]6-[E2]6-[E3]6-[E4]6-[E5]6-[E6]6-[E7]6-[E8]6-[E9]6排列的九种表位的六个重复。本发明的另一个方面提供了包括多亚基多表位多肽的抗流感的疫苗，其中第一多肽包括多种B细胞型流感病毒肽表位，且第二多肽包括多种T细胞型流感病毒肽表位。所述多表位多肽的每一个可以是具有载体蛋白的融合蛋白的一部分。根据一些实施方案，本发明的疫苗组合物不含有佐剂。根据其它实施方案，该疫苗还包括佐剂。药学上可接受的佐剂包括但不限于油包水乳剂、脂质乳剂和脂质体。根据具体实施方案，所述佐剂选自由以下组成的组Montanide、明矾、胞壁酰二肽、Gelvac、甲壳质微颗粒、脱乙酰壳多糖、霍乱毒素亚基8、111^1^1(1@和1^0&1^11^。根据目前的优选实施方案，佐剂是1401^111(^@。在一些实施方案中，疫苗被配制用于肌内、鼻内、口服、腹膜内、皮下、局部、皮内和透皮递送。在一些实施方案中，所述疫苗鼻内施用。在其它实施方案中，所述疫苗肌内施用。还在其它实施方案中，所述疫苗皮内施用。根据又一个实施方案，本发明提供了在受试者中诱导免疫应答和提供抗流感保护的方法，包括将含有至少一种合成或重组流感多表位多肽的疫苗组合物施用于受试者，所述多肽包括以交替顺序聚合物结构(XAX3…)n或嵌段共聚物结构(X》n(X》n(X3)n...(Xm)n排列的多个拷贝的多种流感病毒肽表位。所述疫苗的施用途经选自肌内、鼻内、口服、腹膜内、皮下、局部、皮内和透皮递送。根据优选的实施方案，所述疫苗鼻内、肌内或皮内施用。根据本发明的多肽用于制备抗流感的用于免疫的疫苗组合物的用途以及根据本发明的分离的多肽用于生产多核苷酸的用途也是在本发明的范畴内。本发明中公开的全部多亚基多肽能够作为重组蛋白、融合蛋白来生产，以及通过化学合成来生产。相应地，本发明的另一个方面提供了重组蛋白，所述蛋白包括多亚基多表位多肽，所述多肽包括多种流感病毒肽表位。在一些实施方案中，所述多肽被插入到细菌鞭毛蛋白的高可变区内。本发明的另一个方面提供了融合蛋白，所述融合蛋白包括至少一种多亚基多表位多肽和至少一种其它多肽。在一些实施方案中，所述多肽与细菌鞭毛蛋白或其一部分融合。在一个具体实施方案中，包括根据嵌段共聚物结构[El]6-[E2]6-[E3]6-[E4]6-[E5]6-[E6]6-[E7]e-[E8]e-[E9]e排列的九种多肽的六个重复的所述多肽与细菌鞭毛蛋白或其一部分融合。本发明的另一个方面提供了包括通过间隔子连接的多种合成肽表位的合成多亚基多肽，所述间隔子选自由键、氨基酸和包含至少两个氨基酸的肽组成的组。本发明还包括用于抗流感免疫的合成多亚基多肽。从以下给出的详细说明可以清楚本发明的其它实施方案和全部应用范围。然而，应该理解的是，该详细说明和具体实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅仅为了举例说明而给出，因为根据本详细说明，在本发明的精神和范围内的许多变化和改动对于本领域技术人员是明显的。附图简述图1A和1B显示了包括以交替顺序聚合物结构(HA354-372—HA91-108—Ml，2-12—HA150-159—HA143-149—NP206-229—HA307-319—NP335-350—NP380_393)5排列的九种流感肽表位的五个重复的多亚基多肽。(A)用于产生多亚基多肽的构建体的核苷酸序列(SEQIDNO:83);(B)由A的核苷酸序列编码的多亚基多肽的氨基酸序列(SEQIDNO:84)。九种表位的第一序列中的表位被下划线。图2A和2B显示了包括以嵌段共聚物结构(HA354-372)3—-(HA91_108)3—-(Ml2-12)3-—(HA150-159)3-—(HA143-149)3-—(NP206-229)3-—(HA307-319)3-—(NP335-350)f一(NP380-393)3排列的九种流感肽表位的三个重复的多亚基多肽。(A)用于生产所述多肽的构建体的核苷酸序列(SEQIDNO:85)。(B)所述多亚基多肽的氨基酸序列(SEQIDNO:86)。第一表位的三个重复被下划线。图3A和3B显示了包括以交替顺序聚合物结构(HA354-372—-HA91-108—-Ml，2-12—HA150-159—HA143-149—NP206-229—HA307-319—NP335-350—NP380_393)3排列的九种流感肽表位的三个重复的多亚基多肽。(A)用于生产所述多肽的构建体的核苷酸序列(SEQIDNO:87)。(B)多亚基多肽的氨基酸序列(SEQIDNO:88)。九种表位的第一序列中的表位被下划线。图4显示了用两种多亚基疫苗#11和#14接种的小鼠的对几种流感病毒株的细胞免疫应答。测定对两种不同浓度的剌激病毒的细胞免疫应答，且以用剌激病毒孵育的淋巴细胞的增殖指数来显示。图5显示了多亚基疫苗#14对抗高致死剂量的小鼠适应的流感病毒H3N2株(A/得克萨斯/1/77)的保护效应。疫苗的保护效应通过与对照小鼠(PBS)相比接种的小鼠肺中病毒滴度显著减小来证实。图6A和6B显示了几种多亚基疫苗在保护小鼠免遭病毒攻击的效力。多亚基疫苗#11、#12和#14的保护效应通过以下被证明在用致死剂量的小鼠适应的流感病毒H3N2株(A/得克萨斯/1/77)感染之后与对照(PBS)小鼠相比接种的小鼠的更高存活率(图6A);以及与对照(50%Gly/PBS)小鼠相比，接种的小鼠肺中显著更低的病毒载量(图6B)。图7比较了用包括在PBS中的50X甘油中的多亚基构建体(#11、#12和#14)或者在具有不完全弗氏佐剂的乳剂中的多亚基构建体(#11_IFA、ftl2-IFA和ftl4-IFA)的几种疫苗免疫小鼠的效力。不同疫苗的保护效应和IFA的效应通过在用小鼠适应的流感病毒H3N2株(A/得克萨斯/1/77)攻击之后与对照小鼠相比接种小鼠的存活率来测量。发明详述本发明提供了包括多种流感病毒肽表位的多亚基多表位多肽和基于这些多肽的疫苗。根据本发明的多肽包括每一表位的至少二个重复。优选地，根据本发明的多肽包括每一表位的至少三个重复。本发明还提供了基于此类多肽的疫苗及其使用方法。由流感蛋白衍生的肽表位可用于制备抗流感的疫苗。然而，单独的每一肽对于免疫系统几乎是不可见的，其被快速降解并且引起了不充分的免疫应答。当多个拷贝的免疫原性肽被作为单一多肽呈递给免疫系统时，表位特异性免疫应答的幅度增强。例如，基于含有单一拷贝的一种流感肽表位的重组鞭毛蛋白融合蛋白的疫苗提供了大约l:28的表位/鞭毛蛋白比率。通过使用在若干拷贝的每一个中含有多种表位的多表位疫苗，可以获得高达2:l的表位/鞭毛蛋白比率。本发明公开了与已知的构建体和构型相比具有增强的免疫原性的多亚基多表位多肽。所述多肽各自含有多种表位，其中每一表位在多个拷贝中重复。每一表位的多个拷贝或重复可以作为每一表位的嵌段是邻接的。可选择地，所述多种表位可以出现在预定序列中，其中该序列在所述多肽内重复多次。这些类型的多种表位的构型现在均显示了在赋予受试者抗流感免疫性中具有出乎意料的优异结果。为了方便起见，在此描述在本说明书、实施例和权利要求中使用的某些术语。术语"抗原呈递"是指抗原在与动物的主要组织相容性复合体I类或II类分子(MHC-I或MHC-II)或人的HLA-I和HLA-II相关的细胞表面上表达。术语"免疫原性"或"免疫原性的"涉及物质剌激或引起免疫应答的能力。例如通过测定该物质特异性的抗体的存在来测定免疫原性。通过本领域已知的方法例如使用ELISA测定来检测抗体的存在。流感表位可以分类为B细胞型、T细胞型或B细胞型和T细胞型两者，取决于它们引起的免疫应答的类型。B细胞或T细胞表位的定义不是明确的；例如，一种肽表位能够诱导抗体产生，但同时该表位能够具有一种序列，该序列能够结合于人HLA分子，使得它容易到达CTL，因此对于该特定表位为双B细胞和T细胞分类。"CTL"、"杀伤T细胞"、"细胞毒性T细胞"是识别和溶解靶细胞的一组分化T细胞，所述靶细胞携带在防御病毒感染和癌细胞中发挥作用的特异性外来抗原。"T辅助细胞"或"Th"是在被特异性抗原剌激时释放促进B细胞和杀伤T细胞的活化和功能的细胞因子的任何T细胞。术语"重组鞭毛蛋白融合蛋白"是指包括嵌合在其序列内的肽表位或多亚基多表位多肽的鞭毛蛋白多肽，或者可选择地是指在其N或C端与肽表位或多亚基多表位多肽融合的鞭毛蛋白多肽的一部分。这里所使用的"氨基酸序列"是指寡肽、肽、多肽或蛋白序列及其片段，以及天然存在的或合成的分子。在说明书和权利要求中，术语"间隔子"表示任何化合物，它可以存在于多肽序列中，在末端之一或者在两个表位之间。优选地，所述间隔子由l-4个氨基酸残基组成。所述间隔子可以包括能够被酶促方法切割的序列，或者可以自发地分解。所述间隔子可以对多肽实施或诱导有益的构象。所述间隔子可任选地包括蛋白酶特异性可切割的序列。肝燃錢隨表份根据本发明的优选实施方案，肽表位由选自由HA、M1、M2和NP组成的组中的流感蛋白衍生。所述表位还可以根据它们的类型B细胞型、Th型和CTL型来选择。应该注意的是，本文所列举的肽表位仅为了举例的目的提供。流感病毒蛋白在分离物之间改变，从而对于每一流感蛋白提供了多种变体序列。相应地，本发明包括了具有一个或多个氨基酸替代、添加或删除的肽表位。基质蛋白M1是流感病毒颗粒的主要结构组分，且形成脂质细胞衍生的包膜的内层。在病毒颗粒内和在感染的细胞中，在病毒复制的后期，Ml蛋白与病毒核糖核蛋白(vRNP)关联，所述病毒核糖核蛋白由病毒RNA分子、多个拷贝的核蛋白和保持病毒RNA末端的病毒聚合酶的三个亚基组成。Ml的N端结构域是指M1蛋白的氨基酸1到大约氨基酸20。基质蛋白M2是导致空泡内基质和核蛋白复合物的解离的氢离子通道。该离子通道释放能够使病毒RNA进入感染细胞的核并且引发病毒复制的基因组。抗流感的治疗物质，如金刚烷胺和金刚乙胺通过阻断M2活性来起作用。B型流感具有称为NB的对应蛋白；虽然在M2和NB之间没有序列相似性，但它们均为跨膜蛋白，且可以共有相似的功能。M2蛋白的细胞外结构域是A型流感病毒的跨膜蛋白，在所有A型流感株中几乎没有变异。M2的N端结构域是指该跨膜结构域的氨基酸序列N端。表2提供了可以用于制备根据本发明的多亚基多肽的Ml和M2肽表位的示例性列表。表2.Ml和M2肽表位<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>核蛋白(NP)是特异性抗原组之一，它在A型、B型和C型流感病毒之间有区分。与HA相反，NP是高度保守的，在所有A型流感病毒中94%保守。A型流感病毒NP特异性抗体不具有病毒中和活性，但NP是与所有A型病毒交叉反应的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的重要耙(Townsend，JExpMed1984160(2):552-63)。CTL识别对应流感NP分子的线性区域的短合成肽。血凝素(HA)是嵌合到流感包膜中的糖蛋白三聚体。它负责病毒连接和穿透到宿主细胞。HA的抗体中和病毒感染性。该分子的抗原变异造成流感的频繁爆发和通过免疫对感染的弱控制(Ada禾口Jones，CurrTopMicrobialImmunol1986;128:1-54)。流感病毒RNA聚合酶是由以1:1:1比率存在的三种聚合酶(P)蛋白PB1、PB2和PA组成的杂合物。它们在流感毒力中的作用还没有完全被阐明。HA、NP、PBl和PB2肽表位的非限制性例子在表3中列举。表3:HA、NP和PB肽表位<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>嵌合或重纟目分子"嵌合蛋白"、"嵌合多肽"或"重组蛋白"可互换地使用，且是指流感多亚基多肽，其可操作地连接于除了由其衍生肽表位的多肽以外的多肽。本发明的多亚基多表位多肽可以通过在表达载体本身中表达或者作为嵌合蛋白来制备。产生包括一种或多种流感肽表位的嵌合或重组蛋白的方法是本领域技术人员所已知的。编码一种或多种流感肽表位的核酸序列能够被插入到表达载体中，用于制备在宿主细胞中增殖和表达的多聚核苷酸构建体。编码包括几种表位的多个重复的多肽例如多亚基多表位多肽的核酸构建体，可以通过连接在其3'和5'端携带适当的限制性位点的更小的多聚核苷酸构建体来制备。在一个非限制性例子中，本发明的嵌合多肽包括具有下列多肽之一的流感肽表位的嵌合体鞭毛蛋白、霍乱毒素、破伤风毒素、卵清蛋白、结核热休克蛋白、白喉类毒素、来自呼吸道合胞病毒的G蛋白、来自脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)的外膜蛋白、水泡性口膜炎病毒的核蛋白、水泡性口膜炎病毒的糖蛋白、恶性疟原虫抗原谷氨酸富集蛋白、裂殖子表面蛋白3或病毒包膜蛋白。这里所使用的术语"表达载体"和"重组表达载体"是指DNA分子，例如质粒、鞭毛蛋白或病毒，其含有用于表达重组肽表位所需要的期望的适当核酸序列，以便在特定宿主细胞中表达。这里使用的"可操作地连接"是指至少两个序列的功能性连接。可操作地连接包括在启动子和第二序列例如本发明的核酸之间的连接，其中启动子序列引发和介导对应所述第二序列的DNA序列的转录。可以通过表达载体来提供肽表位转录所需要的调节区。基因表达所需要的调节区的精确性质可以在载体和宿主细胞之间改变。通常，需要能够结合RNA聚合酶且启动可操作地关联的核酸序列的转录的启动子。调节区可以包括涉及起始转录和翻译的那些5'非编码序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。所述编码序列的3'非编码区域可以含有转录终止调节序列，例如终止子和多腺苷酸化位点。还可以提供翻译起始密码子(ATG)。为了将所述核酸序列克隆到载体的克隆位点，在核酸合成过程中添加提供适当的相容性限制性位点的连接体或接合体。例如，可以通过使用含有需要的限制性酶切位点的引物的PCR扩增DNA将期望的限制性酶切位点引入DNA片段中。包括可操作地与调节区关联的肽表位序列的表达构建体可以直接引入到适当的宿主细胞中用于表达和产生多亚基多表位多肽本身或作为重组融合蛋白。可以使用的表达载体包括但不限于质粒、黏粘、噬菌体、噬菌粒、鞭毛蛋白或修饰的病毒。通常，此类表达载体包括用于载体在适当宿主细胞中增殖的功能复制起点、用于插入所期望的基因序列的一个或多个限制性核酸内切酶位点和一个或多个选择标志物。包括表达载体和多亚基多肽的重组多聚核苷酸构建体然后应该转移到在其中它能够复制和被表达的细菌宿主细胞中。这能够通过本领域已知的方法来实现。所述表达载体与相容性原核或真核宿主细胞一起使用，所述宿主细胞能够由细菌、酵母、昆虫、哺乳动物和人衍生。根据一个非限制性例子，所述表达载体是如US6，130,082中公开的鞭毛蛋白载体。根据其它具体实施方案，质粒载体含有具有独特的限制性位点的fliC鞭毛蛋白基因，其中所述多亚基多肽被插入到鞭毛蛋白的高可变区，且含有所述多表位多肽的重组鞭毛蛋白融合蛋白在缺乏鞭毛的突变沙门氏菌或大肠杆菌中表达。表达所述重组鞭毛蛋白融合蛋白的宿主细胞可以被制成活疫苗。多亚某多肽的牛产—旦被宿主细胞表达，多亚基多肽能够通过许多蛋白纯化方法从不希望的组分中分离。一种此类方法使用在重组蛋白上的多聚组氨酸标签。多聚组氨酸标签由添加到重组蛋白中通常在N端或C端的至少六个组氨酸(His)残基组成。多聚组氨酸标签常常用于在大肠杆菌或其它原核表达系统中表达的加多聚组氨酸标签的重组蛋白的亲和纯化。通过离心来收获所述细菌细胞，且获得的细胞沉淀能够通过物理方式溶解或者用洗涤剂或酶如溶菌酶来溶解。粗溶菌产物在此阶段含有所述重组蛋白以及由细菌衍生的几种其它蛋白，并且用亲和介质如NTA-琼脂糖、HisPur树脂或Talon树脂孵育粗溶菌产物。这些亲和介质含有结合金属离子，镍或钴，所述多聚组氨酸标签以微摩尔亲和力结合于所述金属离子。该树脂然后用磷酸缓冲液洗涤以除去不与钴或镍离子特异相互作用的蛋白。可以通过添加20mM咪唑来改进洗涤效率，且然后通常用150-300mM咪唑来洗脱蛋白。随后可以使用限制性内切酶、内切蛋白酶或外切蛋白酶(exoprotease)来除去多聚组氨酸标签。用于纯化加组氨酸标签的蛋白的试剂盒可以例如从Qiagen购买。另一种方法是通过生产包涵体，所述包涵体是无活性的蛋白聚集体，它可以在重组多肽在原核生物中表达时形成。虽然cDNA可以适当地编码用于可翻译的mRNA，所产生的蛋白可以不适当地折叠，或者所添加的肽表位的疏水性可以引起重组多肽变得不溶。容易通过本领域公知的方法来提纯包涵体。用于提纯包涵体的各种工序在本领域中是已知的。在一些实施方案中，通过离心从细菌溶菌产物中回收包涵体，并且用洗涤剂和螯合剂洗涤，以便从聚集的重组蛋白中除去尽可能多的细菌蛋白。为了获得可溶性蛋白，洗涤的包涵体溶于变性剂中，释出的蛋白然后通过稀释或渗析逐渐除去变性剂来再折叠(例如在Molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆实验室手册)，第三片反，Sambrook，J.和Russell，D.W.，2001;CSHLPress中所描述的)。可选择地，所述重组鞭毛蛋白融合蛋白保持形成完整鞭毛的能力。用于纯化完整鞭毛的各种工序在本领域中是已知的。在一个实施方案中，由细菌的亲代的鞭毛蛋白缺失的非运动性菌株表达的重组鞭毛蛋白分子产生了功能鞭毛。疫苗制剂本发明的疫苗包括多表位多肽或包含多表位多肽的重组融合蛋白和任选的佐剂。所述疫苗可以被配制用于以多种不同方式之一施用。根据本发明的一个实施方案，所述疫苗鼻内施用。所述疫苗制剂可以任何便利的方式应用到淋巴组织。然而，优选将它作为液流或液滴应用到鼻通道的壁上。鼻内组合物能够例如以液体形式配制为滴鼻剂、喷雾剂，或者适合于吸入，配制为粉剂、霜剂或乳剂。该组合物能够含有多种添加剂，例如佐齐U、赋形齐U、稳定剂、缓冲剂或防腐剂。20为了简单应用，所述疫苗组合物优选在适于以滴鼻剂或气溶胶的形式分布所述多肽或重组融合蛋白的容器中供应。在某些优选实施方案中，所述疫苗被配制用于粘膜递送，尤其鼻部递送(Arnon等人，Biologicals(生物制品)2001;29(3-4):237-42;Ben-Yedidia等人，IntImmunol.(国际免疫学)1999;11(7):1043-51)。在本发明的另一个实施方案中，施用为口服，且所述疫苗可以例如以片剂的形式提供，或者在明胶胶囊或微胶囊内包裹。还在又一个实施方案中，所述疫苗被配制用于胃肠外施用。在一些实施方案中，所述疫苗被配制用于大规模接种，例如与喷射注射器或一次性用药筒一起使用。还根据又一个实施方案，所述施用是肌内。还根据又一个实施方案，所述施用是皮内。专门设计用于皮内投入疫苗的针在本领域中是已知的，例如特别是公开在6，843，781和7，250，036中。根据其它实施方案，所述施用用无针注射器进行。这些形式的制剂对于本领域技术人员来说是常识。脂质体提供了用于抗原递送和呈递的另一递送系统。脂质体是由包围一个通常含水中心的磷脂和其它甾醇组成的双层囊泡，在所述含水中心中抗原或其它产物能够被包封。脂质体结构是高度多样的，许多类型是在从约25nm到约500ym的纳米级到微米级的范围内。已经发现，脂质体可有效递送治疗剂到皮肤和粘膜表面。脂质体能够进一步被修饰，用于例如通过将特异性抗体并入到表面膜来靶向递送，或者被改变成包封细菌、病毒或寄生虫。完整的脂质体结构的平均生存时间或半衰期可以在包括某些聚合物例如聚乙二醇时延长，允许在体内延长释放。脂质体可以是单层的或多层的。疫苗组合物可以通过以下方式配制将抗原或抗原/佐剂复合物包封在脂质体中，以形成脂质体包封的抗原，并且将脂质体包封的抗原与包含疏水性物质的连续相的载体混合。如果在第一步中不使用抗原/佐剂复合物，可以将适合的佐剂添加到脂质体包封的抗原、脂质体包封的抗原和载体的混合物、或者在载体与脂质体包封的抗原混合之前的载体中。该方法的顺序可以取决于使用的佐剂的类型。典型地，当使用佐剂如明矾时，首先将佐剂和抗原混合，以形成抗原/佐剂复合物，随后用脂质体包封抗原/佐剂复合物。得到的脂质体包封的抗原然后与所述载体混合。术语"脂质体包封的抗原"可以是指单独的抗原的包封或者抗原/佐剂复合物的包封，取决于上下文。这促进了佐剂和抗原之间的密切接触，且在使用明矾作为佐剂时，至少部分可以是免疫应答的原因。当使用其它佐剂时，所述抗原可以首选在脂质体中被包封，得到的脂质体包封的抗原然后混合到疏水性物质中的佐剂中。在配制基本上不含水的疫苗组合物中，抗原或抗原/佐剂复合物用脂质体包封，并与疏水性物质混合。在疏水性物质包水的乳剂中配制疫苗时，所述抗原或抗原/佐剂复合物在水性介质中用脂质体包封，然后将该水性介质与疏水性物质混合。在乳剂的情况下，为了保持疏水性物质在连续相中，含有脂质体的水性介质可以在混合下按等份添加到疏水性物质中。在所有配制方法中，脂质体包封的抗原可以根据情况在与疏水性物质或水性介质混合之前冷冻干燥。在一些情况下，抗原/佐剂复合物可以用脂质体包封，随后冷冻干燥。在其它情况下，所述抗原可以用脂质体包封，随后添加佐剂，然后冷冻干燥，以形成具有外21部佐剂的冷冻干燥的脂质体包封的抗原。还在另外的例子中，抗原可以用脂质体包封，随后在添加佐剂之前冷冻干燥。冷冻干燥可以促进在佐剂和抗原之间的良好相互作用，获得了更有效力的疫苗。将脂质体包封的抗原配制成疏水性物质还可以牵涉到使用乳化剂来促进脂质体在疏水性物质中的更均匀的分布。典型的乳化剂在本领域中是公知的，且包括二縮甘露醇油酸酯(ArlacelA)、卵磷脂、Tween80、Spans20、80、83和85。所述乳化剂以有效促进脂质体的均匀分布的量使用。通常，疏水性物质与乳化剂的体积比(v/v)是在约5:1到约15:1的范围内。微颗粒和纳米颗粒使用小的可生物降解的球体，它用作疫苗递送的贮库。聚合物微球具有的超过其它贮库效应的佐剂的主要优点是，它们是极其安全的，且已经被美国食品和药品管理局批准作为适合的缝合线用于人类医药以及用作可生物降解的药物递送系统(LangerR.Science(科学).1990;249(4976):1527-33)。共聚物水解的速率被很好表征，进而允许制造在延长时间内具有持续抗原释放的微颗粒(0'Hagen等人，Vaccine(疫苗).1993;11(9):965-9)。微颗粒的胃肠外施用引起了持久的免疫，特别是如果它们引入了延长的释放特性。能够通过将在不同时间内水解的聚合物的混合物和它们的相对分子量来调节释放速率。不希望受理论约束，不同粒度的颗粒(lym至200iim)的配制还可以有助于持久的免疫应答，因为在可供用于巨噬细胞摄取之前，大的颗粒必须被破碎为更小的颗粒。以这种方式，单注射疫苗能够通过结合各种粒度来开发，从而延长抗原呈递和很大地有益于畜牧业生产者。在一些应用中，佐剂或赋形剂可以包括在疫苗制剂中。MontanideTM(不完全弗氏佐剂)和明矾例如是优选用于人用途的佐剂。所述佐剂的选择将部分通过疫苗的施用方式来决定。例如，非注射接种将导致更好的总体顺从性和更低的总体成本。优选的施用方式是肌内施用。另一优选的施用方式是鼻内施用。鼻内佐剂的非限制性例子包括脱乙酰壳多糖粉剂、PLA和PLG微球、QS-21、磷酸f丐纳米颗粒(CAP)和mCTA/LTB(具有热不稳定的肠毒素的五聚体B亚基的突变霍乱毒素E112K)。使用的佐剂还可以理论上是已知用于基于肽或蛋白的疫苗的任何佐剂。例如凝胶形式的无机佐剂(氢氧化铝/磷酸铝，Warren等人，1986;磷酸钙，Relyvelt，1986);细菌佐齐U，例如单磷酰脂质A(Ribi，1984;Baker等人，1988)和胞壁酰肽(Ellouz等人，1974;Allison和Byars，1991;Waters等人，1986);颗粒佐剂例如所谓的ISCOMS("immunosti咖latorycomplexes(免疫剌激复合物)"，Mowat禾口Donachie，1991;Takahashi等人，1990;Thapar等人，1991)，脂质体(Mbawuike等人，1990;Abraham，1992;Phillips和Emili，1992;Gregoriadis，1990)和可生物降解的微球(Marx等人，1993);基于油乳剂和乳化剂如IFA的佐剂("不完全弗氏佐剂"(Stuart-Harris，1969;Warren等人，1986)，SAF(Allison和Byars，1991)，皂苷类(例如QS-21;Newman等人，1992，角鳖烯/角鳖烷(Allison和Byars，1991);合成佐剂如非离子嵌段共聚物(Hunter等人，1991)，胞壁酰肽类似物(A薩a，1992)，合成脂质A(Warren等人，1986;Azuma，1992)，合成多聚核苷酸(Harrington等人，1978)和聚阳离子佐剂(W097/30721)。与本发明的免疫原一起使用的佐剂包括铝或钙盐(例如氢氧化物或磷酸盐)。特别优选在这里使用的佐剂是氢氧化铝凝胶例如AlhydrogelTM。磷酸钙纳米颗粒(CAP)是由Biosante，Inc.(Lincolnshire,111.)开发的佐剂。感兴趣的免疫原可以涂布到颗粒的外部，或者在内部包封[He等人(2000年11月)Clin.Diagn.Lab.Immunol.，7(6):899-903]。与本发明的免疫原一起使用的另一佐剂是乳剂。涉及的乳剂可以是水包油乳剂或油包水乳剂。除了免疫原性嵌合蛋白颗粒以外，这种乳剂包括角鲨烯、角鲨烷、花生油或本领域公知的类似物的油相和分散剂。非离子分散剂是优选的，且这种材料包括脱水山梨醇单-c12-c24-脂肪酸酯、脱水山梨醇二-c12-c24-脂肪酸酯、二縮甘露醇单-c12-c24-脂肪酸酯和二縮甘露醇二-c12-c24-脂肪酸酯，例如脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯和二縮甘露醇单油酸酯。这种乳剂例如是包括角鲨烯、甘油和表面活性剂例如二縮甘露醇单油酸酯(ArlacelA)的，任选地具有角鲨烷的油包水乳剂，用在水相中的嵌合蛋白颗粒乳化。油相的可选择的组分包括a-生育酚、混合链甘油二酯和三酯和脱水山梨醇酯。这种乳剂的公知例子包括MontanideTMISA-720和MontanideISA703(S印pic，法国卡斯特尔)。其它水包油乳剂佐剂包括在WO95/17210和EP0399843中公开的那些佐剂。小分子佐剂的使用也在这里被考虑。可在这里使用的一类小分子佐剂是美国专利第4，539，205号、美国专利第4，643,992号、美国专利第5，011，828号和美国专利第5，093，318号中所述的7-取代-8-氧代-鸟苷衍生物或者8-磺基-鸟苷衍生物。7-烯丙基_8-氧代鸟苷(洛索立宾)已经显示在诱导抗原_(免疫原_)特异性应答中特别有效。有用的佐剂包括单磷酰脂质A(MPL)、3-去乙酰单磷酰脂质A(3D-MPL)，一种公知的由西雅图的CorixaCorp.，以前的Ribilmmunochem，Hamilton,Mont.制造的佐剂。该佐剂含有从细菌中提取的三种组分在2X角鲨烯/TweenTM80乳剂中的单磷酰脂质(MPL)A、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)(MPL+TDM+CWS)。该佐剂可以通过GB2122204B中教导的方法来制备。其它化合物与称为氨基烷基葡萄糖酰胺磷酸酯(AGP)的MPL⑧佐剂是结构相关的，所述佐剂例如从CorixaCorp获得的名称为RC-529TM佐剂{2_[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]-乙基-2-脱氧-4-0-膦酰基-3-0-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基_氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙铵盐}。RC-529佐剂可在作为RC-529SE销售的角鲨烯乳剂以及作为RC-529AF的水性制剂中从CorixaCorp.获得(参见美国专利第6，355，257号和美国专利第6，303，347号；美国专利第6，113，918号；以及美国公开第03-0092643号)。其它被考虑的佐剂包括含有一次或多次CpG核苷酸基序(附加侧翼序列)的合成寡核苷酸佐剂，其可从ColeyPharmaceuticalGroup获得。可从AquilaBiopharmaceuticals,Inc.获得的命名为QS21的佐剂，是具有佐剂活性的免疫活性皂苷部分，其衍生自南美州树木QuillajaS即onariaMolina的树皮(例如QuilA)，并且它的生产方法在美国专利第5，057，540号中被公开。QuilA的衍生物，例如QS21(QuilA的HPLC纯化部分衍生物，也叫做QA21)和其它部分例如QA17也被公开。QuillajaS即onariaMolina皂苷的半合成和合成衍生物也是有用的，例如在美国专利第5，977，081号和美国专利第6，080，725号中描述的那些。可从ChironCorp.获得的命名为MF59的佐剂描述在美国专利第5，709，879号和美国专利第6，086，901号。胞壁酰二肽佐剂也被考虑，且包括N-乙酰基_胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺(thur-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰基-L-丙氨酰基_D_异谷酰胺[CGP11637，称之为nor-MDP]和N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺基-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰基-s-n-甘油-3-羟基磷酰氧基)乙胺[(CGP)1983A，称之为MTP-PE]。所谓的胞壁酰二肽类似物描述在美国专利第4，767，842号中。其它佐剂混合物包括3D-MPL和QS21的组合(EP0671948Bl)、含有3D-MPL和QS21的水包油乳剂(WO95/17210，PCT/EP98/05714)、用其它载体配制的3D-MPL(EP0689454B1)、在含有胆固醇的脂质体中配制的QS21(W096/33739)或者免疫剌激性寡核苷酸(WO96/02555)。购自SKB(现在为Glaxo-SmithKline)的佐剂SBAS2(现在AS02)含有在水包油乳剂中的QS21和MPL，也是有用的。可选择的佐剂包括在WO99/52549中所述的那些以及聚氧乙烯醚的非颗粒状悬浮剂(英国专利申请第9807805.8号)。使用单独的含有一种或多种Toll样受体-4(TLR-4)的激动剂的佐剂如MPL⑧佐剂或结构上相关的化合物例如RC-529⑧'佐剂或脂质A模拟物或与TLR-9的激动剂如含非甲基化寡脱氧核苷酸的CpG基序一起也是任选的。另一类佐剂混合物包括如在美国专利第6，113，918中所述的进一步含有氨基烷基葡萄糖胺磷酸酯的稳定油包水乳剂。在氨基烷基葡萄糖胺磷酸酯中，称为RC-529的分子{(2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]_乙基_2-脱氧-4-0-膦酰基-3-0-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-2-[(R)_3-十四酰基氧基十四酰基氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙铵盐)}是最优选的。优选的油包水乳剂在W09956776中被描述。佐剂以辅佐量使用，该量能够随佐剂、宿主动物和免疫原而改变。典型的量可以从每免疫大约lmcg到大约lmg改变。本领域技术人员知道，适当的浓度或量可以容易确定。包括基于水包油乳剂的佐剂的疫苗组合物也包括在本发明的范围内。油包水乳剂可以包括例如在美国7，323，182中所述的可代谢的油和皂苷。所述油和皂苷例如以在1:1和200:l之间的比率存在。根据几个实施方案，根据本发明的疫苗组合物可以含有一种或多种佐剂，特征在于它作为基本上无无机盐离子的溶液或乳剂存在，其中所述溶液或乳剂含有一种或多种水溶性或水可乳化的物质，所述物质能够使疫苗等渗或低渗。所述水溶性或水可乳化的物质例如可以选自由麦芽糖、果糖、半乳糖、蔗糖、糖醇、脂质和它们的组合组成的组。本发明的制剂可任选地包括粘膜递送增强剂诸如例如US2004/007540中所述的通过调节上皮连接结构和/或生理学来可逆地增强粘膜上皮细胞旁转运的渗透肽。根据本发明的几个具体实施方案，本发明的多亚基多表位多肽包括蛋白体佐剂。蛋白体佐剂包括脑膜炎球菌的外膜蛋白的纯化制剂和来自其它细菌的类似制剂。这些蛋白是高度疏水的，反映了它们作为跨膜蛋白和膜孔蛋白的作用。由于它们的疏水性蛋白_蛋白相互作用，当适当分离时，所述蛋白形成了由约60-100nm直径整体或碎片膜囊泡组成的多分子结构。所述脂质体样物理状态允许所述蛋白体佐剂作为蛋白载体起作用以及作为佐剂起作用。蛋白体佐剂的使用已经在现有技术中有描述，并且由LowellGH在"NewGenerationVaccines(新一代疫苗)"，第二版，MarcelDekkerInc，纽约，巴塞尔，香港(1997)第193-206页中综述。蛋白体佐剂囊泡被描述为在尺寸上比得上疏水且对于人类使24用安全的某些病毒。该综述描述了当使用完全透析技术可选择地除去溶解的洗涤剂时形成的包括在各种抗原和蛋白体佐剂囊泡之间的非共价复合物的组合物的配制。本发明的多肽任选地通过疏水部分复合到蛋白体抗原囊泡上。例如将抗原轭合于脂质部分如脂肪酰基基团。这种疏水部分可以直接连接于多亚基多肽，或者可选择地例如一个、两个、三个或四个、多达六个或十个氨基酸的短间隔子可以用于将多亚基多肽连接于脂肪基团。这种疏水锚状物与蛋白体佐剂囊泡的疏水膜相互作用，同时提供了一般亲水性的抗原肽。尤其，疏水性锚状物可以包括连接于多亚基多肽的氨基端或者羧基端附近的脂肪酰基基团。一个例子是十二碳链月桂酰基(CH"CH、。CO)，虽然包括但不限于八碳、十碳、十四碳、十六碳、十八碳或二十碳链长度的酰基基团的任何类似作用的脂肪酰基基团也能够用作疏水锚状物。所述锚状物可以使用免疫增强间隔子连接于肽抗原。这种连接体可以由i-io个氨基酸组成，它们可以有助于保持肽的构象结构。可以通过混合在选择的洗涤剂的溶液中组分，然后通过渗滤/超滤方法除去洗涤剂来配制该两种组分，即多亚基多肽和蛋白体佐剂。一般，该组合物中含有的蛋白体佐剂与多亚基多肽的比率优选大于(按重量计)i:i，并且例如可以是i:2、i:3、i:4高达i:5、i:io或i:20。所述两种组分的基于洗涤剂的溶液可以含有相同的洗涤剂或不同的洗涤剂，且一种以上的洗涤剂可以存在于经历超滤/渗滤的混合物中。适合的洗涤剂包括Triton、Empigen和Mega-lO。还能够使用其它适合的洗涤剂。所述洗涤剂用于将所述组分溶解，以用来制备所述组合物。可以通过将许多不同的抗原肽与蛋白体佐剂混合来生产包括不同多亚基多肽的疫苗。可选择地，可以生产两种或多种蛋白体佐剂/抗原肽组合物，随后混合。虽然在鸡蛋中生产的商业流感疫苗在对鸡蛋敏感的个体中诱导了过敏反应，但多亚基疫苗不会引起这种应答，如由免疫之前和免疫之后的IgE滴度所表现的。抗原含量最佳地通过它引起的生物效果来界定。自然，应该提供足够的抗原来引起可测定量的保护性抗体的产生。用于病毒的生物活性的便利试验涉及到进行试验的抗原材料耗尽已知的它的保护性抗体的阳性抗血清的能力。对于用毒力生物体处理的小鼠，该结果以LDs。的负对数(致死剂量，50%)被报道，所述毒力生物体用已知抗血清预处理，所述已知抗血清本身用各种稀释度的评价的抗原材料预处理。高值因此反映了高含量的已经缚牢已知抗血清中的抗体的抗原材料，因此减少或消除了抗血清对毒力生物体的效果，使得小剂量致死。优选地，与由用未处理的抗血清处理的毒力生物体获得的结果相比，存在于最终制剂中的抗原材料是在足以将LD5。的负对数增加至少1的，优选1.4的水平。对于抗血清对照和适合的疫苗材料获得的绝对值当然依赖于选择的毒力生物体和抗血清标准。还可以使用以下方法来获得理想的疫苗制剂从预期引起希望的免疫应答的规定的抗原起始，在第一步中，发现与抗原配合的佐剂，如在专门文献，尤其WO97/30721中所描述的。在第二步中，所述疫苗通过以下步骤优化以等渗或稍微低渗的浓度将本发明中定义的各种实现等渗的物质，优选糖和/或糖醇，添加抗原和佐剂的混合物中，使得所述组合物在其他方面相同，并且调节该溶液到pH4.0-10.0范围内的，尤其7.4的生理pH。然后，在第一步中确定与通常的盐水缓冲的溶液相比将改善抗原/佐剂组合物的溶解性的物质或其浓度。通过候选物质的溶解度特性的改善是该物质能够导致疫苗的免疫原性活性的增加的第一指示。因为细胞免疫应答增加的可能前提条件之一是抗原与APC(抗原呈递细胞)的增加的结合，在第二步中可以研究来发现该物质是否导致这种的增加。使用的方法可以类似于在佐剂的定义中描述的方法，例如用荧光标记的肽或蛋白、佐剂和实现等渗的物质孵育APC。能够通过使用通流细胞术(throughflowcytometry)与已经与单独的肽和佐剂混合的或者与存在于普通盐水缓冲溶液的肽/佐剂组合物混合的细胞比较来确定由所述物质带来的增加的肽摄取或与APC的结合。在第二步中，可以体外研究候选物质以发现它们的存在是否能够增加肽至APC的呈递和它们存在的什么程度能够增加肽至APC的呈递；细胞上的MHC浓度可以使用W097/30721中所述的用于试验肽的方法来测定。试验制剂的效率的另一可能方式是通过使用体外模型系统。在该方式中，APC与佐剂、肽和候选物质一起孵育，并测定特异性识别使用的肽的T细胞克隆的相对活化(Coligan等人，1991;Lopez等人，1993)。制剂的效率还可任选地通过检测免疫动物中的"迟发型超敏"(DTH)反应由细胞免疫应答来证实。最后，该制剂的免疫调节活性在动物试验中测定。可以使用本领域已知的用于合成肽、肽多聚体和多肽的方法来化学合成本发明的多亚基肽和多肽。这些方法一般依赖已知的肽合成原理；最便利地，该方法可以根据已知的固相肽合成原理来进行。这里所使用的"肽"表示由肽键连接的氨基酸的序列。根据本发明的肽包括4-24个氨基酸残基的序列。多亚基多肽包括肽表位的至少二个重复和最多50个重复。肽类似物和肽模拟物(p印tidomimetic)也包括在本发明的范围内，以及本发明的肽的盐和酯也被包括。根据本发明的肽类似物可任选地包括至少一个非天然氨基酸和/或在C端或N端的至少一个封闭基团。本发明的肽的盐是生理学上可接受的有机盐和无机盐。适当的"类似物"的设计可以用计算机辅助。术语"肽模拟物"是指根据本发明的肽以包括至少一个非肽键例如脲键、氨基甲酸酯键、磺酰胺键、肼键或任何其它共价键的这种方式来修饰。适当的"肽模拟物"的设计可以用计算机来辅助。本发明的肽的盐和酯包括在本发明的范围内。本发明的肽的盐是生理学上可接受的有机盐和无机盐。本发明的肽的功能衍生物包括可以通过本领域已知的方式由作为残基上的侧链或N或C端基团存在的官能团制备的衍生物，并且包括在本发明中，只要它们保持药学上可接受，即它们不破坏肽的活性且不赋予含有它的组合物以毒性。这些衍生物例如包括羧基的脂肪族的酯、通过与氨或伯胺或仲胺反应所产生的羧基的酰胺、通过与酰基部分(例如烷酰基或碳环芳酰基)反应形成的氨基酸残基的游离氨基的N-酰基衍生物或通过与酰基部分反应形成的游离羟基(例如丝氨酰基或苏氨酰基残基)的o-酰基衍生物。术语"氨基酸"是指化合物，其具有氨基基团和羧酸基团，优选是在碳骨架上的1，2_取代、1，3-取代或1，4-取代模式。a_氨基酸是最优选的，且包括在蛋白中发现的20种天然氨基酸(它们是L-氨基酸，除了甘氨酸)，相应的D-氨基酸、相应的N-甲基氨基酸、侧链修饰的氨基酸、没有在蛋白中发现的生物合成获得的氨基酸(例如4-羟基-脯氨酸、5_羟基_赖氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、13_氰基丙氨酸，以及合成衍生的a-氨基酸，例如氨基异丁酸、正亮氨酸、正缬氨酸、同型半胱氨酸和同型丝氨酸。e-丙氨酸和Y-氨基丁酸分别是1，3-氨基酸和1，4-氨基酸的例子，且许多其它氨基酸在本领域是公知的。抑胃酶氨酸样等构物(包括两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CHOH置换)、羟基亚乙基等构物(包括两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CHOHCH2置换)、还原的酰胺等构物(包括两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CH2NH键置换)和硫代酰胺等构物(包括两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CSNH键置换)也是本发明有用的残基。用于本发明的氨基酸是可商业获得或者可通过常规合成方法获得的氨基酸。某些残基可以需要特殊方法来引入到肽中，肽序列的顺序、发散或汇集合成方法可用于本发明。自然编码的氨基酸及其衍生物根据IUPAC协议用三字母代码来表示。当没有指示时，使用L异构体。本领域技术人员已知的氨基酸的保守替代是在本发明的范围内。保守氨基酸替代包括一个氨基酸用另一个具有相同类型官能团或侧链例如脂肪族、芳族、带正电、带负电的氨基酸替换。这些替代可以增强口服生物利用度、渗透到中枢神经系统、耙向特异性细胞群体等。技术人员会认识到，在编码序列中改变、增加或删除单个氨基酸或小百分率的氨基酸的对肽、多肽或蛋白序列的个别替代、删除或增加是"保守修饰变体"，其中改变导致了氨基酸用化学类似的氨基酸替代。提供功能上类似的氨基酸的保守替代表格在本领域中是公知的。以下六组各自含有用于彼此保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷胺酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(1)、亮氨酸(U、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。提供以下实施例，以便更充分说明本发明的一些实施方案。然而，这些实施例决不被认为限制本发明的宽范围。本领域技术人员能够在不偏离本发明范围的情况下容易设计此处公开的原理的许多变化和修饰。实施例材料和方法多亚某多表位多肽:提供包括表1中列举的流感病毒肽表位El-E9的若干重复的多亚基多表位多肽的例子。所述多肽包括氨基酸和作为间隔子的短肽。所述多肽以交替的顺序聚合物结构或嵌段共聚物结构排列。通过由包括多个限制性位点以便进一步控制多肽的多聚核苷酸构建体在表达载体中表达来制备所述多肽。所述多聚核苷酸构建体由商业来源供应。皿在实施例1-3中提供的由多亚基多表位多肽制备的疫苗用于各种小鼠株的免疫研究。生产和试验的特定疫苗的例子是多亚基#11由多亚基多肽制备，所述多亚基多肽包括在实施例1中提供的以交替顺序聚合物结构[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]5排列的九种流感肽表位的五个重复。多亚基#12由多亚基多肽制备，所述多亚基多肽包括在实施例3中提供的以交替顺序聚合物结构[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]3排列的九种流感肽表位的三个重复。多亚基#14由多亚基多肽制备，所述多亚基多肽包括在实施例2中提供的以嵌段共聚物结构[E1]3_[E2]3-[E3]3-[E4]3-[E5]3-[E6]3-[E7]3-[E8]3-[E9]3排列的九种流感肽表位的三个重复。免疫研究:三种品系的小鼠远交品系(ICR)、近交品系(BALB/c)和人HLAA*0201分子转基因品系(HLAA*0201)用于免疫研究以及在一些实验中使用兔子。使用的病毒包括以下A/得克萨斯/1/77、A/威斯康星/67/05(WISC)、A/WSN/33(WSN)、B/马来西亚/2506/04(MAL)、A/加利福尼亚/07-2007、A/新喀里多尼亚20/99(NC)以及其它。所有研究用肌内施用在100微升中的150mcg多亚基多表位多肽来进行，同样地施用于两个后肢。棚列1:11柳，糊幅雜,歹謹,亓息树缝这是包含以交替顺序聚合物结构[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]5排列的九种流感肽表位的五个重复的多亚基多肽的实施例。估计的分子量是80kD。该多亚基多肽的氨基酸序列，包括组氨酸标签，在图1B中显示。用于制备该多亚基肽的多聚核苷酸构建体的DNA序列在图1A中显示。棚列2:JI都乂鹏錢雄細,力,禾中砌表橘fe—麵H树飾《缝在本实施例中，用于制备包括以嵌段共聚物结构[E1]3-[E2]3-[E3]3-[E4]3_[E5]f[E6]f[E7]f[E8]f[E9]3排列的九种流感肽表位的三个重复的多亚基肽的多聚核苷酸构建体的DNA序列在图2A中显示，且相应的氨基酸序列在图2B中显示。估计的分子量是48kD。实施例3:具有包含以交替顺序结构排列的九种表位的单元的三个重复的多亚基鍾这是包括以交替顺序聚合物结构[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]3排列的九种流感肽表位的三个重复的多亚基多肽的实施例。估计的分子量为48kD。该多亚基多肽的氨基酸序列在图3B中显示。用于制备该多亚基肽的多聚核苷酸构建体的DNA序列在图3A中显示。实施例4:细胞免疫应答评价对两种不同浓度的A/得克萨斯/1/77、A/WisxWisc/67/05、A/加利福尼亚/07-2007和B/马来西亚/2506/04株的剌激流感病毒的细胞免疫应答。转基因小鼠(对于HLAA*0201的转基因)用在IFA(不完全弗氏佐剂)内乳化的两种多亚基疫苗#11和#14接种一次。在免疫后7-10天，取下它们的脾和淋巴结(LN)，进一步用上述病毒孵育。增殖通过胸腺嘧啶摄取来测定，并于图4中以用剌激病毒孵育的淋巴细胞的增殖指数显示。该增殖与在300-1300pg/ml的范围内的IFN-y分泌关联。该应答指示对该疫苗的Thl细胞介导的免疫应答，所述疫苗能够提供对攻击病毒感染的更牢固的免疫。实施例5:免疫抗原和病毒被免疫血清识别用悬浮于在PBS中的50%甘油中的或悬浮于作为佐剂的IFA中的包括以交替的顺序聚合物结构[E1E2E3E4E5E6E7E8E9]5排列的九种表位的五个重复的多亚基多表位多肽(多亚基#11)、或者包括以嵌段共聚物结构[E1]3-[E2]3-[E3]3-[E4]3-[E5]3-[E6]3-[E7]3-[F8]f[E9]3排列的九种表位的三个重复的多亚基多表位多肽(多亚基#14)、或者用作为载体对照的在PBS中的50X甘油来免疫ICR小鼠。已知保护性流感表位HA91-108和M22-12以及几种流感疫苗(WISC、WSN、NC和MAL)被用抗原多肽免疫的小鼠血清(分别为#11和#14)识别，通过ELISA测定，结果在表4a和4b中总结。有意义的识别被定义为在免疫前血清和在2-3周间隔三次IM免疫之后的血清中的滴度有至少4倍升高。:免疫前血清和用PBS中的50X甘油中的多亚基多表位多肽三次免疫之后的血清的对各种抗原的滴度的升高倍数<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>:免疫前血清和用作为佐剂的IFA中的多亚基多表位多肽三次免疫后血清的对各种抗原的滴度的升高倍数<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>两个组显示免疫抗原的高度识别，肽HA91-108和M22_18仅仅被用#14免疫的小鼠的血清识别，但不被用#11免疫的小鼠的血清识别。正常人血清能够识别多亚基疫苗候选物，指示在用该疫苗免疫人受试者之后引起的潜在记忆应答。对#11和#14的四个人血清的平均滴度分别为6000和6400。实施例6.杭对用H3N2A/得克萨斯/1/77的高致死攻击的保护按3周间隔用多亚基#14疫苗或PBS肌内三次免疫八只转基因小鼠的组。在最后一次剌激之后三周给予用高致死剂量(300LD5。)的H3N2A/得克萨斯/1/77的攻击感染。感染后5天处死小鼠。如图5中所述，发现了小鼠肺中的病毒滴度的显著减少，尽管使用了大量的病毒用于感染。实施例7:体内效力研究体内评价两种疫苗型悬浮于PBS中的50%甘油中或悬浮于不完全弗氏佐剂中的多亚基多肽。在几个小鼠模型中使用纯化疫苗来确立其效力、作用机制和重复剂量毒理学之前的初步毒理学数据。在几个品系的小鼠中进行体液应答以及药效动力学研究。用于评价疫苗的一个动物模型是HLAA*0201的转基因小鼠。该模型用于确定最佳剂量以及免疫应答的细胞参数，以揭示其作用机制。实施例8:使用ICR和转基因(HLAA*0201)小鼠在两个初步研究中证明疫苗的效力。按三周间隔用具有和不具有佐剂(IFA)的150mcg/小鼠的剂量的疫苗ftll、ftl2和ftl4肌内三次接种小鼠。在最后一次免疫之前3-4周，用300LD50的小鼠适应的流感病毒H3N2株(A/得克萨斯/1/77)感染小鼠。感染后5天，监视存活率。用具有和不具有IFA的PBS中50X甘油免疫的处理组和对照组进行比较。在ICR小鼠中在300LD50感染之后的存活率(图6A)是100%，而在对照组(PBS中50%甘油)中存活率证明为20%。图6B中仅仅详细给出了对于疫苗#11和#14的其肺中的病毒载量。其中发现了100%存活率的组中的病毒载量明显低于对照组中的病毒载量(p<0.05)。由于每组的小鼠数量少(5只小鼠)，使用双侧Fisher's确切检验(Two-sidedFisher'sExactTest)进行统计学分析。5X或更低的P值被认为具有统计学意义。使用SAS⑧9.l版(北卡罗来纳州卡瑞(Cary)的SAS研究所)分析数据。关于用在PBS/50X甘油中的疫苗免疫的转基因小鼠的存活率(图7)，使用上述相同的接种和感染方法，相比于对照组的20%，用#11和#14接种的存活率分别是80%和60%。在该小鼠模型中疫苗#12以及测试的佐剂(IFA)疫苗是非保护的。在本动物模型中或者至少在本研究中，看来添加佐剂是不必要的，甚至减低了疫苗的保护性潜力。实施例9:重复剂暈毒理学用疫苗#14(悬浮于PBS中的50%甘油或不完全弗氏佐剂中的三个嵌段重复的多亚基疫苗)，根据基于http://www3.niaid.nih.gov/daids/vaccine/Science/VRTT/06_SafetyTest.htm的操作规程来进行重复剂量毒理学试验。在ICR远交系小鼠中进行初步剂量相关的毒理学研究。使用用于每一处死时间点每剂量每性别的三只动物来试验在肌内施用一次、两次和三次疫苗之后的它们的主要器官的组织病理学。在包含三个每两周一次接种的6周重复剂量中使用预期用于临床的最高剂量，该6周重复剂量很可能足以评价产品的毒性且能够重复两次。研究包括监视生存阶段，随后整套的毒理学参数，包括在免疫后2天和2周的尸体剖检和所有主要器官的完全组织病理学检查，以便说明在处理期间见到的任何毒理学效应是可逆的。实施例10:l/IIa期临床试验本临床试验的主要目的是检查在单次或双次肌内施用之后预防性抗流感疫苗的安全性。该研究在控制临床环境下在年龄18岁到49岁的健康志愿者中进行。第二个目的是估计通过施用多亚基疫苗引起的免疫原性。该I/II期研究评价了最普通的急性不良效应并检查了患者能够安全施用、没有副作用高发生率的剂量大小。輔你l11:膨lk謹錢德，,脏W棘純制勺/l、隨青巾,驢磁HLAA*0201的转基因小鼠用商业灭活流感疫苗(分裂病毒颗粒)BPVaxignp⑧在0天、第60天、第81天免疫三次，或者用Vaxigrip⑧在o天免疫一次，以及用多亚基疫苗#11、#12和#14免疫另外两次(在第60天和第81天)。在免疫之前(免疫前)和在最后一次免疫后收集血液。在以下混合血清中测定几种流感株的抗体H3N2:A/威斯康星/67/05、A/得克萨斯/1/77、A/加利福尼亚/07/2007、A/福建/411/2002、A/莫斯科/10/99和A/巴拿马/2007/99;H1N1:A/新喀里多尼亚/20/99、A/WSN/33、A/PR8/34B:B/马来西亚/2506/04、B/Lee/40。在用预期在人类中单次免疫的Vaxigrip⑧第一次免疫之后，对于所有病毒滴度没有明显升高(除了对A/加利福尼亚的滴度升高4倍以外)。结果在表5A和5B中显示。用多亚基制剂，与来自其中证明了相似体液应答的免疫研究的其它数据相比，用Vaxigrip⑧的在前免疫没有显著升高对病毒的应答。在用多亚基疫苗两次免疫之后观察到了免疫后/免疫前的滴度的最高8倍升高。施用PBS的对照组对于所有病毒均为阴性。在不同多亚基变体的比较中，在对病毒的体液应答方面，#14是最佳的候选物。表5A.H3N2<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>t=滴度，f=倍数表5B.H1N1和B型流感<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>t=滴度，f=倍数实施例12.肽合成使用典型的固相肽合成用以下材料来合成肽和多亚基肽保护的氨基酸、9-芴基甲氧基羰基-N-羟基琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)、溴-三-吡咯烷酮-磷六氟磷酸盐(PyBrop)、林克酰胺-甲基二苯甲胺(MBHA)聚苯乙烯树脂，且用于固相肽合成(SPPS)的许多有机物和载体从NovaBiochemicals(瑞士Laufelftngen)购买。双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)从Lancaster(英国Lancashire)购买，用于高效液相色谱法(HPLC)的三氟乙酸(TFA)和溶剂从Bio-Lab(以色列Jerusalem)购买。有机化学溶剂从Frutarom(以色列的海法)购买。核磁共振(NMR)谱用BrukerAMX-300MHz波谱仪记录。质谱用FinniganLCQDUO离子阱质谱仪进行。薄层色谱法(TLC)用MerckF24560硅凝胶板(德国Darmstadt)进行。HPLC分析使用Vydac分析RP柱(C18，4.6X250mm，分类号201TP54)进行，并且用Merck-HitachiL-7100泵和在215nm下操作的Merck-HitachiL-7400可变波长检测器进行。流动相由梯度系统组成，溶剂A对应具有0.1%TFA的水，溶剂B对应具有0.1%TFA的乙腈(ACN)。流动相从0-5分钟用95%A开始，随后从5-55分钟是从5%B-95%B的线性梯度。梯度在95%B保持另外5分钟，然后从60-65分钟下降至95%A和5%B。梯度在95%A保持另外5分钟，以获得柱平衡。流动相的流速是lmL/min。通过逆相HPLC(L-6200A泵，日本Merck-Hitachi)使用Vydac制备RP柱(C8，22x250mm，分类号218TP1022)进行肽纯化。使用溶剂A对应具有0.1%TFA的水和溶剂B对应具有0.1%TFA的ACN的梯度系统进行所有制备HPLC。虽然已经具体描述了本发明，但本领域技术人员将领会到可以作出许多改变和修饰。因此，本发明不应被认为受限于具体描述的实施方案，且本发明的范围和构思将更容易参考以下权利要求来理解。权利要求一种合成或重组的流感多表位多肽，其包括以选自交替的顺序聚合物结构(X1X2X3...Xm)n和嵌段共聚物结构(X1)n(X2)n(X3)n...(Xm)n的构型排列的多个拷贝的多种流感病毒肽表位。2.根据权利要求1所述的多肽，其选自由以下组成的组<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>以及<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中B是1-4个氨基酸残基的任选的序列；n在每次出现时独立地是2-50的整数；m是3-50的整数；&，X2...Xm的每一个是由4-24个氨基酸残基组成的流感肽表位；Z在每次出现时是键或1-4个氨基酸残基的间隔子；且其中多肽中的氨基酸残基的最大数是约1000。3.根据权利要求2所述的多肽，其中n在每次出现时独立地是2-50的整数；m是3-15的整数A-Xm的每一个是选自由4-24个氨基酸残基组成的B细胞型表位、T辅助细胞(Th)型表位和细胞毒性淋巴细胞(CTL)型表位组成的组的流感肽表位；且所述多肽中的氨基酸残基的最大数是约600。4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述流感肽表位选自由血凝素(HA)肽、M1肽、M2肽和核蛋白(NP)肽组成的组。5.根据权利要求4所述的多肽，其中m是9且n是3-5的整数。6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述流感肽表位选自由SEQIDNO:l至SEQIDNO:82组成的组。7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述流感肽表位选自由以下组成的组HA354-372(El，SEQIDNO:82)、HA91-108(E2，SEQIDNO:48)、Ml2-12(E3，SEQIDNO:25)、HA150-159(E4，SEQIDNO:52)、HA143-149(E5，SEQIDNO:51)、NP206-229(E6，SEQIDNO:64)、HA307-319(E7，SEQIDNO:59)、NP335-350(E8，SEQIDNO:69)，以及NP380-393(E9，SEQIDNO:70)。8.根据权利要求6所述的多肽，其中所述流感肽表位由HA354-372(El，SEQIDNO:82)、HA91-108(E2，SEQIDNO:48)、M12-12(E3，SEQIDNO:25)、HA150-159(E4，SEQIDNO:52)、HA143-149(E5，SEQIDNO:51)、NP206-229(E6，SEQIDNO:64)、HA307-319(E7，SEQIDNO:59)、NP335-350(E8，SEQIDNO:69)，以及NP380-393(E9，SEQIDNO:70)组成。9.根据权利要求8所述的多肽，其如SEQIDNO:84所示。10.根据权利要求8所述的多肽，其如SEQIDNO:86所示。11.根据权利要求8所述的多肽，其如SEQIDNO:88所示。12.根据权利要求1所述的多肽，其包括以下列交替顺序聚合物结构[ElE2E3E4E5E6E7E8E9]n排列的九种不同流感病毒肽表位，其中n是3或5;E1是HA354-372(SEQIDNO:82)，E2是HA91-108(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDNO:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。13.根据权利要求l所述的多肽，其包括以下列嵌段共聚物结构[E1E1E1-E2E2E2-E3E3E3-E4E4E4-E5E5E5-E6E6E6-E7E7E7-E8E8E8-E9E9E9]排列的九种不同流感病毒肽表位的三个重复，其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDNO:25)，E4是HA150-159(SEQIDNO:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。14.根据权利要求l所述的多肽，其包括以下列交替顺序聚合物结构[E1E2E3E4E5]6排列的五种不同B细胞型流感病毒肽表位的六个重复，其中E1是HA354-372(SEQIDNO:82)，E2是HA91-108(SEQIDN0:48)，E3是M12-12(SEQIDN0:25)，E4是HA150-159(SEQIDN0:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)。15.根据权利要求l所述的多肽，其包括以下列交替顺序聚合物结构[E7E8E9E6]e排列的四种不同T细胞型流感病毒肽表位的六个重复，其中E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDN0:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。16.根据权利要求l所述的多肽，其包括以下列交替顺序聚合物结构[E7E8E9E6]n排列的四种不同T细胞型流感病毒肽表位的四个重复，其中n是6，且其中E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)，且其中所述多亚基多肽与载体蛋白融合。17.根据权利要求l所述的多肽，其包括以下列嵌段共聚物结构[E2E2E2E2E2E2-E1E1E1E1E1E1-E3E3E3E3E3E3-E4E4E4E4E4E4-E5E5E5E5E5E5-E6E6EE6E6E66-E7E7E7E7E7E7-E8E8E8E8E8E8-E9E9E9E9E9E9]排列的九种不同流感病毒肽表位的六个重复，其中El是HA354-372(SEQIDN0:82)，E2是HA91-108(SEQIDNO:48)，E3是M12-12(SEQIDN0:25)，E4是HA150-159(SEQIDN0:52)，E5是HA143-149(SEQIDNO:51)，E6是NP206-229(SEQIDNO:64)，E7是HA307-319(SEQIDNO:59)，E8是NP335-350(SEQIDNO:69)，以及E9是NP380-393(SEQIDNO:70)。18.根据权利要求1所述的多肽，其还包括载体序列。19.根据权利要求24所述的多肽，其中所述肽表位插入在载体多肽的序列内。20.分离的多聚核苷酸，其编码根据权利要求1-19的任一项所述的流感多表位多肽。21.根据权利要求20所述的分离的多聚核苷酸，其编码选自以下组成的组中的多肽序列:SEQIDNO:84、SEQIDNO:86和SEQIDNO:88。22.根据权利要求20所述的分离的多聚核苷酸，其包括选自以下组成的组中的序列SEQIDNO:83、SEQIDNO:85和SEQIDNO:87。23.—种用于免疫受试者抗流感的疫苗，其包括至少一种根据权利要求1所述的多肽。24.根据权利要求23所述的疫苗，其中第一多肽包括多种B细胞型流感病毒肽表位，且第二多肽包括多种T细胞型流感病毒肽表位。25.根据权利要求37所述的疫苗，其中所述第一多肽是根据权利要求17所述的多肽，且所述第二多肽是根据权利要求18所述的多肽。26.根据权利要求37所述的疫苗，其中所述第一多肽是根据权利要求17所述的多肽，且所述第二多肽是根据权利要求19所述的多肽。27.根据权利要求23-30所述的疫苗，其还包括佐剂。28.根据权利要求24所述的疫苗，其中所述佐剂选自由油包水乳剂、脂质乳剂和脂质体组成的组。29.根据权利要求25所述的疫苗，其中所述佐剂选自由以下组成的组Montanide、明矾、胞壁酰二肽、061\^*、甲壳质微颗粒、脱乙酰壳多糖、霍乱毒素亚基8、111^^14@和Lipofimdin。30.根据权利要求26所述的疫苗，其中所述佐剂是Montanide。31.—种在受试者中诱导免疫应答和提供抗流感保护的方法，其中所述方法包括将根据权利要求23-30的任一项所述的疫苗施用于受试者。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述疫苗的施用途经选自肌内、鼻内、口服、腹膜内、皮下、局部、皮内和透皮递送。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述疫苗鼻内施用。34.根据权利要求32所述的方法，其中所述疫苗肌内施用。35.根据权利要求32所述的方法，其中所述疫苗皮内施用。36.用于免疫抗流感的根据权利要求1-19的任一项所述的多肽。37.根据权利要求1-19的任一项所述的多肽在制备用于免疫抗流感的疫苗组合物中的用途。38.根据权利要求20-22的任一项所述的分离的多聚核苷酸在生产多肽中的用途。全文摘要本发明涉及基于多亚基多表位肽的疫苗。特别是，本发明涉及引起对流感的保护性免疫的基于多亚基多表位肽的疫苗的用途。文档编号A61K39/145GK101795709SQ200880101581公开日2010年8月4日申请日期2008年8月3日优先权日2007年8月2日发明者塔玛·本-叶迪狄亚,尤西·辛格申请人:彼昂德瓦克斯医药有限公司