对应于玉米d9基因的突变等位基因和野生型等位基因的分离的多核苷酸分子和使用方法

专利名称：：对应于玉米d9基因的突变等位基因和野生型等位基因的分离的多核苷酸分子和使用方法
技术领域：
：本发明涉及用控制生长和发育的基因对生物体尤其是植物进行遗传操作。本发明进一步涉及控制生长的基因，包括同源物和突变体形式，由其编码的蛋白和用这些基因转化的植物。
背景技术：
：矮化植物对农业已产生重大影响。小麦的矮化变种由于倒伏可能性下降和高产而在北美广泛使用。可以由使用矮化作物实现的其它利益包括减少所需的杀虫剂和肥料的量、种植密度较高和劳动力成本降低。鉴于目前人口增加且适于耕作的土地面积减少的趋势，提高农业生产率一直是一项极为重要的挑战。矮化作物一直是我们农业生产体系的重要组成部分。增加矮化作物的使用可有助于满足未来的农业生产要求。然而，所有作物都没有可利用的商品化可接受的矮化变种。除了使用矮化植物控制林高以外，常规地将合成化学品应用于某些经济上重要的植物物种，以降低生长。被称为生长抑制剂的植物生长调节剂用于在多种作物中降低茎伸长，包括棉花、葡萄藤、果树、花生、小麦和观赏植物(诸如杜鹃花、菊花、绣球花、一品红和许多花坛植物)。所有常用的生长抑制剂都是赤霉素生物合成的抑制剂，通过降低伸长限制茎或枝条生长。在美国，最广泛使用的生长抑制剂为甲哌，其注册用于棉花。对棉花使用甲哌获得的益处包括产量增加、落叶改善、应激耐受改善、作物成熟度更均一和更早收获的能力。以前，生长抑制剂丁酰肼在美国以商标ALAR和KYLAR注册用9于苹果、葡萄和花生，但出于对人类健康的考虑其已经禁用于食用作物。尽管农业生产者需要替代丁酰肼的产品，但在美国还没有注册用于葡萄、果树和花生的生长抑制剂。然而，丁酰肼仍广泛用于某些非食用植物物种。揭示控制植物生长过程如细胞分裂和细胞伸长的分子机制有可能帮助开发高度降低的新植物变种和减l曼植物生长的新方法。这些新植物变种和方法可为农民和园艺家提供对使用合成的生长抑制化学品环境上有利的选择对象。植物细胞和器官的伸长是植物生长和发育的最关键参数之一。然而，该性状在植物中的调节是一个相当复杂的过程，因为外部因素和内部因素均影响它。最重要的外部刺激是光，其一般对细胞伸长具有抑制性或负面作用(Quail,P.H.(1995)5We"ce268:675-680;Kende等，(1997)尸/朋fCe〃9:1197-1210)。细胞伸长的内控由众多化学品介导，这些化学品一般^支称为植物生长调节剂或激素(Kende等，(1997)尸/a"fCe//9:1197-1210)。在经典的植物激素中，植物生长素和赤霉素(GA)均促进细胞伸长，而细胞分裂素和脱落酸各自对细胞伸长均表现出负面作用(Kende等，(1997)P/朋fCe//9:1197-1210)。最近，已鉴定出另一类被称为油菜素内酯的植物生长调节剂，其也显著促进植物生长(Yokota,T.(1997)7Ve"血尸/a"f2:137-143;Azpiroz等，(1998)尸/朋fCe〃10:219-230;Choe等，(1998)尸/"WCW/10:231-243)。然而，仍不清楚植物激素单独地或协同地作用以控制细胞伸长的机制。增进了解介导细胞伸长机制的一种方式是研究其中植物生长这方面被损害的突变体(Klee等，(1991)iev.尸/a"fP/j;as/o/.尸/朋fMo/.Ao/.42:529-551)。已在大多数植物物种(包括玉米)之间鉴定了众多这样的突变体，其中已表征了25种以上影响植物高度的单基因突变(Coe等，(1988),载于Corn&Cor"/wpravewe加，G.F.Sprague(编辑)Madison,WI;Sheridan,W.F.(1988)爿朋w.化v.22:353-385)。这些矮化突变体被认为是GA相关的，这主要是因为GA是唯一的植物生长素，其调节玉米高度的作用已被令人信服地证实(Phinney等，(1985)C醇.rop.尸/a"f飾c/z縱尸一'o/.4:67陽74;Fujioka等，(1988)尸roc.A^/.爿cad(7&485:9031-9035)。已在该类玉米突变体中发现了GA反应性和非GA反应性的两类突变体。尽管已克隆了众多GA反应性突变体的基因，并发现涉及GA生物合成(Bensen等，(1995)尸teCe//7:75-84;Winkler等，(1995)P/虚C"/7:1307-1317)，但关于非GA反应性玉米突变体中缺陷的性质知之甚少。DELLA蛋白是赤霉素(GA)信号转导级联的要旨，用作在提升的GA浓度存在下降解的GA反应的负调节剂(Silverstone等，(2001)CW/10:155-169)。DELLA域蛋白特別令人感兴趣，原因在于它们的功能获得突变体的赤霉素不敏感性矮化表型，这些突变体通过它们的小麦收获指数的增加而部分地引起"绿色革命"(Peng等，(1999)400:256-261)。N-末端DELLA结构域中的突变经常通过极大地增加GA信号转导的该负调节剂的稳定性而引起显性GA-不敏感性表型(Silverstone等,(2001)尸toCe//10:155-169;Gubler等,(2002)户/朋fP/^Zo/.129:191-200;Itoh等，(2002)尸/朋fCe//14:57-70)。最近，Griff他s等人((2006)尸/a加Ce//18:3399-3414)表明，N-末端I区和II区是DELLA蛋白与拟南芥(力raZncto/^力GIDla相互作用所必需的。在保守的GRAS结构域中的C-末端突变通常导致功能丧失(Dill等，(2004)尸/朋fCe/n6:1392-1405)，组成型GA生长反应表型值得注意的是，最近鉴定的芜青(份a抓carapa)突变体^rga7-d(Muangprom等，(200》尸/aW尸/yw'o/.137:931-938)和大麦j/"/c突变体(G油ler等，(2002)尸/朋fP/yAy/o/.129:191-200)除外。为跟上农业生产增加的需求，对于遗传工程的农业植物，需要改善农艺学特征的新目标。涉及在植物中控制细胞分裂和伸长的蛋白的编码基因的分离和分子表征将为农业科学家提供操作的新目标。发明概迷提供用于在植物中表达编码野生型和变体形式的DELLA蛋白的基因的组合物和方法，所述DELLA蛋白由玉米(Zeawa;^)(Zm-D9)基因编码。该组合物含有编码野生型和变体形式的Zm-D9蛋白的分离的多核苦酸分子。该组合物还包含玉米D9基因的分离的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸分子例如可在转化植物中用于野生型和变体形式的Zm-D9蛋白的组织优选表达或组成型表达、用于反义抑制Zm-D9基因和用于分离编码DELLA蛋白的同源多核普酸分子。这些多核苷酸分子用于改变植物生长(尤其是植物的茎和根生长)的方法中，更具体地说，用于降低或增加植物高度的方法中。在本发明的一个实施方案中，所述多核苷酸分子用于生产矮化才直物。提供含有本发明的多核苷酸分子的表达盒。另外提供转化植物、其植物组织、植物细胞和种子。提供由本发明的多核苷酸分子编码的分离的蛋白。附图筒述图1图示了Zm-D9MUT1等位基因分离的非GA3反应型植物(左侧)和反应型植物(右側)。图2图示了玉米矮化8和矮化9基因的染色体定位。燕麦附加系的分析PCR表明，和由遗传作图所预测的一样，推定的Zm-D9基因实际上位于玉米染色体5上。该基因被发现处于与阳性对照Zm-D8PCR产物(已知其位于染色体1上)不同的位置。图3A-3F图示了与AC-GFP1(青色多管水母04e^oreacoenz/^cms0GFP)融合的玉米DELLA蛋白的亚细胞定位。图3A是DSRED(珊瑚属(Z)^cosoma^.)红色荧光蛋白)表达对照。图3B是Zm-D8:ACGFP1。图3C是A和的B合并。图3D是DSRED表达对照。图3E是Zm-D9:ACGFP1。图3F是D和E的合并。绿色条棒在图中指示10,图4图示了发芽后56天的拟南芥(^4ra6^fop^Columbia12生态型T2才直物，其含有由MS-S2a启动子驱动的玉米DELLAcDNA。由左至右MS-S2APRO::GUS;MS-S2APRO::ZM-D8;MS-S2APRO::ZM-D9;MS-S2APRO::固TlZM-D9;MS誦S2APRO::ZM-D8MPL;和MS-S2APRO::ZM-D8固T。图5图示了拟南芥Tl植物的代表性裂花，其含有由MS-S2a启动子驱动的玉米DELLAcDNA。由以上花中除去两个花瓣和两个萼片。图6为Zm國D9(SEQIDNO:2)和固T1Zm-D9(SEQIDNO:4)蛋白的氨基酸序列的M酸序列比对。图7为玉米(ZM)、拟南芥(AT)、芜菁(BR)、大麦(HoWewmvw/gare)(HV)、稻(O7zara"va)(OS)和小麦(rht-Dla/b)的DELLA蛋白的多重氨基酸序列比对。图8为Zm-D9(SEQEDNO:l)和MUT1Zm-D9(SEQIDNO:3)的核苷酸序列的核苷酸序列比对。图9为编码玉米(ZM)、拟南芥(AT)、芜菁(BR)、大麦(/ZorafeiW2vw/gare)(HV)、稻(Oo^as加/va)(OS)和小麦(rht-D1a/b)的DELLA蛋白的核苷酸序列的多重核苷酸序列比对。图10提供了d8和d9基因在经LynxMPSS系统获得的32个不同组织和发育阶段的玉米中的相对表达水平(以ppm表示)(Brenner等,(2000)/WAS97:1665-1670和Brenner等，(2000)iV加B/ofec/mo/18:630-634)。垂直线依据获得样品的器官划分图表。图11提供了部分必和D9入门克隆(entryclone)图谱，该图谱显示了所生产的结构域交换嵌合体。A-显示了必和D9入门克隆的部分图谱以及每个指示区域中编码的氨基酸差异。必INDEL的氨基酸序列为SGSGSGQPTDASPPA(SEQIDNO:7)。M777Z)iINDEL氨基酸序列为QPTDASSPAAG(SEQIDNO:8)。B-显示了基于必等位基因(白色区域)的嵌合体的部分图谱，MUT1D9区段为灰色。C-显示了基于A^/77D9等位基因(灰色区域)的嵌合体的部分图谱，必区段为白色。图12详述了T2拟南芥植物在生长期8.00的形态数据(Boyes等，(2001)尸/朋fCe〃13:1499-1510),该植物由MS-S2A启动子表达天然必和必等位基因的cDNA。上标字母表示依据LSD分析于95%置信水平彼此不是显著不同的组别。数据为4个独立转化事件的8个平行测定(replicates)的平均值。图13提供了在拟南芥T2和GS3xGaspeFlint玉米TO植物中有关开花过渡的数据。上标字母表示依据LSD分析于95%置信水平彼此不是显著不同的组别。这些数据为4个独立事件的8个平行测定的平均值。玉米数据由每个构建体的25个独立转化事件的1个平行测定获得。图14详述了必/D9结构域交换Tl拟南芥的形态学和开花时间数据。注意，上标字母表示依据LSD分析于95%置信水平彼此不是显著不同的组别。ALT-改变；等位基因的表型关系被交换的多态性改变，使得差异性不再显著。REV-逆转；多态性使等位基因的表型关系产生统计学显著的逆转。MS-S2A启动子用于驱动所有以上的编码序列(CDS)。数据为每个构建体的16.3个独立转化事件的平均值。在主要生长期8.00时检测莲座直径、高度、长角果长度和长角果宽度(Boyes等，(2001)P/朋fCe〃13:1499-1510)。在主要生长期5.10时检测至开花的天数和开花时的莲座叶数。序列表列于附随序列表中的核苷酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氛基酸的3字母编码显示。核苦酸序列遵循常规标准，从序列的5'末端开始并向前(即排列从左至右)前进至3'末端。只显示了每个核酸序列的一条链，但要理解，任何提到显示链之处均包括互补链。氨基酸序列遵循常规标准，从序列的氨基末端开始并向前(即每行由左至右)前进至氣基末端。列于附随序列表中的核香酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氛基酸的3字母编码显示。核苦酸序列遵循常规标准，从序列的5'末端开始并向前(即每行由左至右)前进至3'末端。只显示了每个核酸序列的一条链，但要玻解，任何提到显示链之处均包括互补链。氨基酸序列遵循遵循常规标准，从序列的氨基末端开始并向前(即每行由左至右)前进至羧基末端。SEQIDNO:1显示了Zw-D9基因的野生型等位基因的全长编码序列。SEQIDNO:2显示了由SEQIDNO:1编码的Zm-D9氨基酸序列。SEQIDNO:3显示了没有终止密码子的Zm-D9基因的野生型等位基因的全长编码序列。SEQIDNO:3的核苷酸1-1875对应于SEQIDNO:1的核苷酸1-1875。如有需要，可以将终止密码子加入SEQIDNO:3的核苷酸序列或任何其它没有终止密码子的编码序列的3'末端。这样的终止密码子包括例如TAA、TAG和TGA。SEQE)NO:4显示了Zw-D9基因的突变等位基因(MUTl)的全长编码序列。SEQIDNO:5显示了由SEQIDNO:4编码的Zm-D9氨基酸序列。SEQIDNO:6显示了没有终止密码子的Zw-D9基因的突变等位基因(MUTl)的全长编码序列。SEQIDNO:6的核苷酸1-1866对应于SEQIDNO:4的核苷酸1-1866。必INDEL的氨基酸序列为SEQIDNO:7。INDEL的氨基酸序列为SEQIDNO:8。发明详迷本发明涉及改变植物生长的组合物和方法。所述组合物包括含有玉米D9基因(其在本文被称为Zm-D9基因)的野生型和突变等位基因的全长编码序列的分离的多核苷酸分子。尽管已在遗传学上描述了Zm-D9(Winkler和Freeling(1994)尸/朋to193:341-348)，但以前还没有在分子水平上表征该基因。本发明还提供由Zm-D9的野生型和突变等位基因编码的DELLA蛋白的M酸序列。本发明的方法涉及用编码野生型和变体形式的、由Zm-D9编码的玉米DELLA蛋白的多核苷酸分子转化植物。本发明的多核苷酸分子可用于在^f直物中改变茎或杆(stalk)的生长，以便产生茎或杆改变的转化植物。更具体地说，所述多核苷酸分子可用于降低或增加茎或杆的高度，以便产生林高或林型降低或提高的植物。多核苷酸分子以需要的方式还用于在转化植物中改变根的结构和其它农业性状。这样的农业性状包括但不限于结軒(seedset)、种子数、可收获的产量、穗长度、干旱耐受性、水利用效率、氮利用效率、倒伏抗性、叶面积、氮累积、光合能力以及碳和氮分配。因此，本发明提供转化植物、植物细胞、植物组织和种子。所述多核苷酸分子还用于构建随后转化入目标植物和植物细胞中的表达盒、用作分离其它D9样基因的探针、用作分子标记等。本发明的组合物包括天然野生型和MUT1Zm-D9多核苷酸分子及其变体和片段。该组合物还包括天然野生型和MUT1Zm-D9多核苷酸分子的对应氣基酸序列，以及这些氨基酸序列的片段和变体。Zm-D9序列示于SEQIDNO:1-6。核苷酸序列或对应的反义序列用于调节植物或植物细胞中的Zm-D9蛋白的表达。也就是说，所述编码序列可用于增加表达，而反义序列可用于降低表达。已知DELLA蛋白调节植物细胞伸长，可用于改变例如植物细胞伸长、林高和根伸长。参见Itoh等，(2002)P/awCe〃14:57刁0;Achard等，(2003)尸/朋fCd/15:2816-2825;以及Fu和Harberd(2003)A^w^421:740-743;所有这些文献都在此引入作为参考。因此，本发明的多核苷酸分子用于改变植物生长的方法。在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸分子用于改变^t物生长的方法中。为此，本发明的多核普酸分子可用于与众多植物启动子中的4壬一种有效连接的表达盒或多核苷酸构建体。可^皮本发明方法影响的柏物生长方面包括f旦不限于以下的一项或多项4朱高；茎或杆高度；档:物茎或杆代谢活性、根结构的一个或多个方面(例如根深度、根角度、根分枝、根尖数量、节位根直径、节位根体积、根代谢活性)；细胞和器官的大小、形状和数量；细胞分裂速率；细胞伸长速率；植物、其器官、组织和细胞的生长速率；器官生长(organinitiation)的时间和位置；寿命等等。本发明的方法包括用本发明的多核苷酸分子转化植物，以降低植物生长。在本发明的一个实施方案中，用与在^i物中驱动表达的启动子有效连接的MUT1Zm-D9多核苷酸分子转化植物。该多核苷酸分子含有示于SEQIDNO:4或6的核苷酸序列、编码示于SEQIDNO:5的多肽的核香酸序列，或者任何这些多核苷酸分子的片段或变体，所述片段或变体编码的多肽保留与天然MUT1Zm-D9多肽基本相同的生物活性。通过在^i物中表达该MUTlZm-D9多核苷酸分子，可以产生抹型降低的植物一矮化植物。因此，本发明的方法用于生产作物的矮化变种。通过这些方法获得具有改良的农业性状的矮化作物，所述改良的农业性状例如为倒伏可能性下降、水利用效率增加、生命周期下降、收获效率增加和每单位面积的产量增加。所述"矮化"意指非典型地小。所述"矮化植物"意指非典型地小的植物。一般而言，这样的"矮化植物"的抹型或高度由典型植物的林型或高度降低约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%以上。一般而言，但非独有地，这样的矮化植物的特征在于与典型植物相比时茎、杆或干的长度下降。本发明包括分离的或基本纯化的多核苷酸分子或蛋白质组合物。"分离"或"纯化"的多核苷酸分子或蛋白或其生物活性部分，基本上或实质上不含通常与在其天然环境中存在的多核苷酸分子或蛋白伴随或相互作用的组分。因此，当通过重组技术生产时，分离或纯化的多核苷酸分子或蛋白基本上不含其它细胞材料或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。"分离"的多核苷酸分子最好不含在该多核苷酸分子所来自的生物基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的序列(即位于该多核苷酸的5'和3'末端的序列)(最好为蛋白编码序列)。例如，在不同的实施方案中，分离的多核苷酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的以下核苦酸序列其在该多核苷酸所来源的细胞基因组DNA中天然側接该多核苷酸。基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有少于约30%、20%、10%、5%或1%(以干重计)污染蛋白的蛋白制品。当本发明的蛋白或其生物活性部分为重组产生时，培养基中最好提供少于约30%、20%、10%、5%或1%(以干重计)的化学前体或非目标蛋白化学品。本发明也包括所公开的多核苷酸分子和由此编码的蛋白的片段和变体。所述"片^:"是指部分多核苷酸分子或部分氨基酸序列及由此编码的蛋白。多核苷酸分子片段可编码保留本文公开的野生型和MUT1Zm-D9蛋白的生物活性并因此保留赤霉素反应型抑制活性的蛋白片段。或者，用作杂交探针的多核苷酸分子片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列片段的范围可为至少约20个核苦酸、约50个核苷酸、约100个核普酸，直至编码本发明蛋白的全长多核苷酸分子。除非另有说明或由文中显而易见，否则术语"Zm-D9"意在包括含有Zm-D9基因的野生型和MUT1等位基因及其片段和变体的多核普酸分子。优选地，Zm-D9基因的野生型和MUT1等位基因的这些片段和变体编码的Zm-D9蛋白保留如本文公开的全长野生型或MUT1Zm-D9蛋白的生物活性。术语"Zm-D9"在本文还可以用于指由本发明的Zm-D9多核苷酸分子编码的蛋白。编码本发明的Zm-D9蛋白的生物活性部分的Zm-D9多核苷酸分子片段编码至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、350、18400、450、500、550或600个连续氨基酸，或直到本发明的全长野生型或MUT1Zm-D9蛋白中存在的氨基酸总数(例如SEQIDNO:2和5分别为625和622个氨基酸)。用作杂交探针或PCR引物的Zm-D9多核普酸分子片段通常不需要编码Zm-D9蛋白的生物活性部分。因此，Zm-D9多核苷酸分子片段可以编码野生型或MUT1Zm-D9蛋白的生物活性部分，或者其可以为使用以下公开的方法可用作杂交探针或PCR引物的片段。Zm-D9蛋白的生物活性部分可如下制备分离本发明的其中一个Zm-D9多核苷酸分子、Zm-D9蛋白的一部分(例如通过体外重组表达)，并评价Zm-D9蛋白的Zm-D9部分的活性。为Zm-D9核普酸序列片段的多核苷酸分子包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、I，IOO、1,200、1,300、1,4001,500、1,600、1,700、1,800或1,850个连续核苷酸，或直至本文所公开的全长Zm-D9多核苷酸中存在的核苷酸数(例如对于SEQIDNO:1、3、4和6分别为1878、1875、1869和1866个核普酸)。"变体"是指基本上相似的序列。对多核苷酸分子而言，变体是在天然多核苦酸分子中的一个或多个内部位点包含一个或多个核苷酸的缺失和/或添加的变体，和/或在天然多核苦酸中的一个或多个位点包含一个或多个核苷酸的取代的变体。本文所用的"天然"多核苷酸分子或多肽分别含有天然的核苷酸序列或氨基酸序列。对多核苷酸分子而言，保守变体包括那些由于遗传密码兼并性而编码本发明的其中一个Zm-D9多肽的氨基酸序列的序列。诸如这些的天然等位基因变体可使用众所周知的分子生物学技术进行鉴定，例如采用以下概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸分子还包括合成的衍生多核苷酸，例如通过例如使用定点诱变产生的但仍编码本发明的Zm-D9蛋白的那些多核普酸。一般来说，通过本文它处描述的序列比对程序和参数测定，本发明的特定多核苦酸分子的变体与特定多核苷酸分子具有至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、19%%、97%、98%、99%以上的序列同一性。本发明的特定多核苷酸分子的变体(即参比多核苷酸)还可以通过比较变体多核苷酸分子编码的多肽与参比多核香酸编码的多肽之间的序列同一性百分率来评价。因此，例如，公开了编码与SEQIDNO:2和/或5的多肽具有给定序列同一性百分率的多肽的分离多核苦酸分子。可利用本文它处描迷的序列比对程序和参数来计算任何两个多肽之间的序列同一性百分率。对于任意给定的本发明多核苷酸分子对，在通过比较它们编码的两个多肽所共有的序列同一性百分率来评价它们时，两个编码多肽之间的序列同一性百分率至少为约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性。"变体"蛋白是指通过在天然蛋白中的一个或多个内部位点缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白中的一个或多个位点具有一个或多个M酸取代而从天然蛋白衍生而来的蛋白。本发明包括的某些变体蛋白是有生物活性的，也就是说它们仍具有所需的天然蛋白生物活性，即如本文所述的野生型或MUT1Zm-D9蛋白活性。这些变体可由例如遗传多态性或人工操作获得。通过本文它处所述的序列比对程序和参数测定，本发明的天然Zm-D9蛋白的生物活性变体与天然蛋白的M酸序列具有至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性。本发明蛋白的生物活性变体与该蛋白的差异可少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个、例如6-10个氛基酸残基，少至5个氨基酸残基，少至4个、3个、2个乃至1个氨基酸残基。本发明的蛋白可通过包括氨基酸取代、缺失、截短和插入在内的多种方法改变。用于这些操作的方法一般是本领域已知的。例如，Zm-D9蛋白的M酸序列变体和片段可通过DNA突变来制备。用于寸秀变和多核苷酸改变的方法在本领域众所周知。参见例如Kunkel(1985)Prac.Wa".JcadScZ.82:488-492;Kunkel等，(1987)M"/zo必i"五wz3^0/.154:367-382;美国专利第4,873,192号；Walker和Gaastra编辑，(1983)rec/m/拜sMo/ecw/ar肠/ogy(MacMillanPublishingCompany,NewYork),以及其中援引的参考文献。关于不影响目标蛋白生物活性的适宜氨基酸取代的指导可见于Dayhoff等，(1978)/4Waso/iVofe/wSe《MewceSfrwcfwre(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的才莫型，该文献通过引用结合到本文中。保守取代可能最佳，例如一个氨基酸#:另一个具有类似特性的氨基酸替换。因此，本发明的基因和多核苷酸分子既包括天然序列，也包括突变形式。同样，本发明的蛋白包括天然蛋白及其变体和修饰形式。这些变体仍具有所需的野生型或MUT1Zm-D9活性。显然，在编码变体的DNA中产生的突变一定不能使序列处于读框之外，且最好不能形成可产生二级mRNA结构的互补区。参见EP专利申请公开号75,444。预期本文所包括的蛋白序列的缺失、插入和取代不会产生蛋白特征的彻底改变。不过，在难以提前预测取代、缺失或插入的确切作用时，本领域技术人员会认识到，可通过常规筛选测定来评价这些作用。也就是说，可通过转基因植物的植物或根形态改变，例如监测用本发明的Zm-D9多核苷酸分子转化的植物的茎和/或根伸长的改变，评价该活性。参见例如以下的实施例1和图4。变异的多核苷酸分子和蛋白还包括来源于诸如DNA改组的突变和重组方法的序列和蛋白。采用该方法，可对一个或多个不同的Zm-D9编码序列进行操作，以得到具有需要特性的新Zm-D9。以此方式可从相关序列多核苷酸群产生重组多核苷酸文库，所述多核苷酸群^^有的序列区具有显著的序列同一性，并可在体外或体内同源重组。例如，使用该方法，编码目标结构域的序列基序可在本发明的Zm-D9基因和其它已知的Zm-D9基因之间改组，以获得编码具有改良的目标特性(例如就酶而言增加的Km)的蛋白的新基因。这种DNA改组的策略在本领域是已知的。参见例如Stemmer(1994)尸rac.7《加/.爿cadt/&491:10747-10751;Stemmer(1994)M^re370:389-391;Crameri等，(1997)A^we所oto:/2.15:436-438;Moore等，(1997),Mo/.说o/.272:336-347;Zhang等，(7^7,Ato/.爿o^.t7&494:4504-4509;Crameri等，(1998)逾訓391:288-291;和美国专利第5,605,793和5,837,458号。本发明的多核苷酸分子可用于从其它生物、特别是其它植物、更特别地是其它单子叶植物分离相应序列。以此方式，可使用诸如PCR、杂交等方法，基于其与本文所列出序列的序列同源性对这些序列进行鉴定。本发明包括基于其与本文列出的完整Zm-D9序列或其变体和片段的序列同一性而分离出来的序列。这些序列包括为所公开序列的直系同源物的序列。"直系同源物"是指来源于共同祖先基因的基因，其作为物种形成的结果而存在于不同物种中。当存在于不同物种中的基因的核苷酸序列和/或其编码的蛋白序列共享至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性时，这些基因被认为是直系同源物。直系同源物的功能在种间通常是高度保守的。因此，本发明包括编码Zm-D9蛋白并在严格条件下与本文公开的Zm-D9序列或其变体或片段杂交的分离多核苷酸分子。在PCR方法中，可设计寡核苦酸引物用于PCR反应，以由提取自任何目标植物的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法一般是本领域已知的，公开于Sambrook等,(1989)M/ecw/"rC7ow'"gv爿丄aZoratoyM"w"/(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)。另参见Innis等编辑，(1990)尸C7frofocoAs:爿Gw/cfeto她Us朋d^p/Zca".o似(AcademicPress,NewYork);Innis和Gelfand编辑，(1995)PCiSfra吻.es(AcademicPress,NewYork);.以及Innis和Gelfand编辑,(1999)PCiA/"/20AMa"wa/(AcademicPress,NewYork)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引22物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。在杂交技术中，使用全部或部分的已知多核苷酸分子作为探针，其与存在于所选生物的克隆基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组或cDNA文库)群中的其它相应的多核苷酸选择性杂交。杂交探针可以为基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可用诸如32P的可检测基团或任何其它可检测标记物标记。因此，例如，可通过标记基于本发明的Zm-D9多核苷酸的合成寡核苷酸来制备杂交探针。制备杂交探针以及构建cDNA和基因组文库的方法是本领域公知的，公幵于Sambrook等,(1989)M/ecw/orC7om'"g:爿Z^oraf"Mwwa/(第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)。例如，本文^^开的完整Zm-D9多核苷酸分子或其一个或多个部分可以用作能够与相应Zm-D9多核苷酸分子和信使RNA特异性杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这些探针包括在Zm-D9多核苦酸序列中的独特序列，其优选为至少约10个核苷酸长，最优选为至少约20个核苷酸长。这些探针可用于通过PCR扩增选定植物的相应Zm-D9多核苦酸分子。该技术可用于从需要的植物中分离另外的编码序列，或作为诊断测定来确定植物中编码序列的存在情况。杂交技术包括平板DNA文库(或者为噬菌斑或者为菌落；参见例如Sambrook等,(1989)Mo/ecw/arC7om."g:爿丄a6oratoyMawwa/(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork))的杂交筛选。这些序列的杂交可以在严格条件下进行。所述"严格条件"或"严格杂交条件，，是指探针与其靶标序列的杂交程度在检测上高于与其它序列的杂交程度的条件(例如至少为背景的2倍)。严格条件是序列依赖性的，在不同环境下将有差异。通过控制杂交严格性和/或洗涤条件，可鉴定出与探针100%互补的靶序列(同源探测)。或者，可调整严格条件，以允许在序列中存在某些错配，以便检测较低程度的相似性(异源探测)。一般来说，探针长度少于约iooo个核普酸，长度最好少于约500个核苷酸。典型地，严格条件是指这样的条件其中盐浓度小于约1.5MNa离子，典型地为约0.01-1.0MNa离子浓度(或其它盐)，pH7.0至8.3,温度对短探针(例如10-50个核苷酸)为至少约30。C，而对长探针(例如大于50个核香酸)为至少约60。C。严格条件还可以通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括用含30-35%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸钠)的緩冲液于37。C杂交，并用1X陽2XSSC(20XSSC-3.0MNaC1/0.3M柠檬酸三钠)于50画55。C洗涤。示例性的中等严格条件包括用40-45%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS于37。C杂交，并用0.5X-1XSSC于55-60°C洗涤。示例性的高严才各条件包括用50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS于37。C杂交，并用O.IXSSC于60-65°C洗涤。任选地，洗涤緩冲液可包含约0.1%至约1%SDS。杂交持续时间一般低于约24小时，通常约4小时至约12小时。洗涤持续时间至少为足以达到平衡的时间长度。特异性通常随杂交后洗涤而变，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对DNA-DNA杂和体而言，Tm可运用Meinkoth和Wahl(1984)v4加/.说oc/ew.138:267-284的等式Tm=81.5。C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(。/o曱酰胺)-500/L来估算；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，。/。GC为DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核普酸的百分比，％甲酰胺为杂交溶液中的曱酰胺百分比，L为杂和体的碱基对长度。Tm是指50%互补耙标序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。每有1%错配，Tm就降低约l。C;因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件，以与所需同一性的序列杂交。例如，如果要寻找>90%同一性的序列，则可将Tm降低10。C。通常，在确定的离子强度和pH下，选择比特定序列与其互补物的热解链温度(Tm)低约5°C的严格条件。但是，非常严格的条件可使用比热解链温度(Tm)低l、2、3或4°C的杂交和/或洗涤；中等严格条件可使用比热解链温度(Tm)低246、7、8、9或10。C的杂交和/或洗涤；低严格条件可使用在比热解链温度CIm)低ll、12、13、14、15或20。C的杂交和/或洗涤。一般技术人员会理解，使用该等式、杂交和洗涤组成及所需Tm，固有地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性变化。如果所需错配程度使Tm低于45°C(水溶液)或32。C(曱酰胺溶液)，则最好增加SSC浓度，以便可使用丰支高的温度。核酸杂交的广泛指引见于Tijssen(1993)丄Worato7他c/e/ciVo6es，第I部，笫2章,(Elsevier,NewYork)和Ausubel等编辑，(1995)C群eW尸rafoco/sM/ecw/ar第2章,(GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork)。参见Sambrook等，(1989)M/ecw/crrC7om'"g:」丄cr6orato^yM"wa/(第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。以下术语用于描述两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列关系(a)"参考序列",(b)"比较窗",(c)"序列同一性"，和(d)"序列同一性百分率"。(a)本文所用的"参比序列"是用作序列比4史基础的确定序列。参比序列可以是特定序列的一部分或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或者完整的cDNA或基因序列。(b)本文所用的"比较窗"是指多核苷酸序列的连续和特定区段，其中比较窗中的多核苷酸序列与参比序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以对两个多核苷酸进行最优比对。通常，比较窗长度为至少20个连续核苷酸，任选地可为.30个、40个、50个、100个或更长。本领域技术人员应理解，为避免由于在多核苷酸序列中《、有空位而与参比序列具有高相似性，通常引入空位罚分，并由匹配数中扣除。用于比较的序列比对方法在本领域众所周知。因此，可使用数学算法完成任何两个序列之间的序列同一性百分率测定。这些数学算法的非限制性实例为Myers和Miller,(1988)4:11-17的算法；25Smith等，(1981)A/v.^;p/.Ma仇2:482的局部比对算法；Needleman和Wunsch，(1970)丄A/o/.5zo/.48:443-453的全局比对算法Pearson和Lipman,(1988)尸raciVa".jcad85:2444-2448的局部检索比对算法Karlin和Altschul，(1990)Prac.爿cadScz'.[/&4872264的算法，由Karlin和Altschul，(1993)尸roc.A^f/.爿o^.Sc,'.[/&490:5873-5877修改。这些数学算法的计算机实现可用于序列比较，以确定序列同一性。这些实现包括但不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics,MountainView,California获得)；ALIGN程序(版本2,0)及GCGWisconsinGenetics软件包第10版中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(可从AccelrysInc.,9685ScmntonRoad,SanDiego,California,USA获得)。使用这些程序的比对可使用默认参数进行。CLUSTAL程序充分描述于Higgins等(1988)Gewe73:237-244(1988);Higgins等，(1989)5:151-153;Corpet等，(1988)M/c/e/c爿cZAi饥16:10881-90;Huang等，(1992)8:155-65和Pearson等，(1994)A^A.Mo/.24:307-331。ALIGN程序基于上述Myers和Miller，(1988)的算法。当用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul等，(1990)7.Afo/.Ao/.215:403的BLAST程序基于上述Karlin和Altschul,(1990)的算法。BLAST核苷酸检索可用BLASTN程序进行，记分=100,字长-12,以获得与编码本发明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可用BLASTX程序进行，记分=50,字长=3，以获得与本发明的蛋白或多肽同源的氛基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位比对，可如Altschul等，(1997)Wwc/eZc4c/&i^s.25:3389所述使用GappedBLAST(在BLAST2.0中)。或者，可使用PSI-BLAST(在BLAST2.0中)进行迭代检索来检测分子间远缘关系。参见上述Altschul等，(1997)。当使用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST时，可使用各自程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。也可通过目测人工进行比对。除非另有陈述，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用笫10版GAP使用以下参数获得的值核苷酸序列的°/。同一性和％相似性使用空位加权50、长度加权3和nwsgapdna.cmp打分矩阵酸序列的％同一性和％相似性使用空位加权8、长度加权2和BLOSUM62打分矩阵；或其任何等价程序。所述"等价程序"意指，当与GAP第10版生成的对应比对相比较时，对于任意2个正被讨论的序列，产生具有相同核苷酸或氛基酸残基匹配和相同百分比序列同一性的比对的任意序列比对程序。GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)J.Mo/.Ao/.48:443-453的算法来寻找使匹配数最大并使空位数最小的两个全序列的比对。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并建立具有最大匹配碱基数和最少空位的比对。它允许在匹配碱基单元中提供空位《1入罚分和空位延伸罚分。GAP必须使匹配空位引入罚分数对其插入的每个空位有利。如果选择的空位延伸罚分大于O，则GAP必须还使空位长度乘以空位延伸罚分对插入的每个空位有利。在GCGWisconsinGenetics软件包第IO版中，默认的空位引入罚分值和空位延伸罚分值对蛋白序列分别为8和2。对于核苷酸序列，默认的空位引入罚分为50,而默认的空位延伸罚分为3。空位引入和空位延伸罚分可以选自0-200的整数表示。因此，例如，空位引入和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65以上。GAP代表了最好的序列比对家族的一员。该家族可能有很多成员，但其它成员都不具有更好的质量。GAP表现出四个方面的序列比对优势质量、比值、同一性和相似性。质量是为了比对序列而最大化的量度。比值是质量除以更短区段的碱基数。同一性百分率是实际匹配的符号的百分率。相似性百分率是相似符号的百分率。与空位相对的符号被忽略。当某对符号的打分矩阵值大于等于相似性阔值0.50时，记录相似性。在第10版GCGWisconsinGenetics软件包中所用的打分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)尸rac.A^/.ZcW.Sc/.OS^89:10915)。(c)本文使用的在两个多核苷酸或多肽序列背景下的"序列同一性，，或"同一性"是指在特定比较窗内比对获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分率用于指蛋白时，则认为不一致的残基位置通常差异在于保守氨基酸取代，在保守氨基酸取代中，氨基酸残基被其它具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的絲酸残基取代，从而不改变分子的功能特性。当序列差异在于保守取代时，可上调序列同一性百分率，以校正取代的保守性质。因这些保守取代而不同的序列^f皮称为具有"序列相似性，，或"相似性"。进行这种调整的方法是本领域技术人员众所周知的。典型地，其包括将保守取代记录为部分而不是完全错配，从而提高了序列同一性百分率。因此，例如，在相同氨基酸被给予记分1而非保守取代被给予记分0的情况下，保守取代被给予介于0和1之间的记分。保守取代的记分可通过例如用PC/GENE程序(Intelligenetics,MountainView,California)执行来计算。(d)本文所用的"序列同一性百分率"是指通过在比较窗内比较两个最优比对序列而确定的值，其中比较窗中的多核苷酸序列部分与参比序列(不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以优化两个序列的比对。如下计算百分率测定两个序列中存在相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数，获得匹配位置数，用该匹配位置数除以比较窗中的总位置数，并将结果乘以100,获得序列同一性百分率。术语"多核香酸"的应用并不限定于本发明为含DNA的多核苷酸。本领域一般技术人员会认识到，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。这些脱氧核糖核苷酸与核糖核苦酸包括天然分子和合成类似物这二者。本发明的多核苷酸还包括所有序列形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。本发明的Zm-D9多核苷酸分子可在用于目标植物Zm-D9中表达的表达盒中提供。该表达盒包括与本发明的Zm-D9多核苷酸分子有效连接的5'和3'调控序列。"有效连接的"是指两个或多个元件的功能性连接。例如，目标多核苷酸分子与调控序列(即启动子)之间的有效连接是一种功能性连接，其可使目标多核普酸分子表达。有效连接的元件可以是连续的或不连续的。当用于指两个蛋白编码区的连接时，所述有效连接是指编码区处于相同读框中。表达盒可另外包含至少一个要共转化到生物中的其它基因。或者，其它基因可在多个表达盒上提供。这样的表达盒可提供多个限制性位点和/或重组位点，用以插入Zm-D9多核香酸分子，使其处在调控区的转录调控之下。表达盒可另外含有选择性的标记基因。表达盒按转录的5'-3'方向包括在植物中起作用的转录和翻译起始区(即启动子)、本发明的Zm-D9多核苷酸分子及转录和翻译终止区(即终止区)。调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或本发明的Zm-D9多核苷酸分子对宿主细胞或彼此之间可以是天然的/类似的。或者，调控区和/或本发明的Zm-D9多核苷酸分子对宿主细胞或彼此之间可以是异源的。本文用于指示序列的"异源的"是指来源于外来物种的序列，或者，如果来自相同物种，则通过有意的人为干涉而在组成和/或基因组基因座方面由其天然形式发生显著改变。例如，与异源多核苷酸分子有效连接的启动子来自不同于多核苷酸分子来源物种的物种，或者，如果来自相同/类似物种，则其中一个或二者由其初始形式和/或基因组基因座发生显著改变，或者启动子不是有效连接的多核苷酸的天然启动子。本文所用的嵌合基因包含与转录起始区有效连接的编码序列，所述转录起始区对于编码序列来说是异源的。尽管使用异源启动子表达所述序列可能最佳，但还可使用天然启动子序列。这些构建体可改变植物或植物细胞中的Zm-D9表达水平。因此，可改变植物或才直物细胞的表型。29终止区对转录起始区可以是天然的，对有效连接的目标Zm-D9多核苷酸分子可以是天然的，对植物宿主可以是天然的，或者可以相对于启动子、目标Zm-D9多核苷酸分子、植物宿主或其任何组合得自另一个来源(即外源的或异源的)。便利的终止区可从根瘤土壤杆菌04.fwme/ac/ew力的Ti质粒获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另参见Guerineau等，(1991)Afo/.G饥262:141-144;Proudfoot(1991)Ce〃64:671-674;Sanfacon等，(1991)Ge"^Dev.5:141-149;Mogen等，(1990)尸/a"fCW/2:1261画1272;Munroe等，(1990)91:151-158;Ballas等，(1989)A^c/ezc爿aAi^s.17:7891-7903和Joshi等，(1987)M/d"c爿c/ds^仏15:9627-9639。在合适情况下，为了在转化植物中增加表达，可优化多核苷酸。也就是说，可用植物优选的密码子来合成多核苷酸，以提高表达。参见例如Campbell和Gowri(1990)尸/朋f尸/2;;w0/.92:1-11关于宿主优选的密码子选择的论述。这些方法可从合成植物优选基因的领域获得。参见例如美国专利第5,380,831和5,436,391号，以及Murray等，(1989)M/c/dcZc/Ai^&17:477-498，所述文献通过引用结合到本文中。已知在细胞宿主中增强基因表达的其它序列修饰。这些修饰包括除去编码-假多聚腺苷化信号的序列、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列以及可能对基因表达不利的其它这类已充分表征的序列。通过参比在宿主细胞中表达的已知基因进行计算，可将序列的G-C含量调整至给定细胞宿主的平均水平。在有可能时，对序列进行修饰，以避免预测的发夹二级mRNA结构。表达盒可另外含有5'前导序列。这类前导序列可用于增强翻译。翻译前导序列是本领域已知的，包括小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序歹'K脑心肌炎S'非编码区)(Ekoy-Stein等，(1989)尸rac.iV加/.^4c"dt/&486:6126-6130);马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀紋病毒)(Gallie等，(1995)G聰165(2):233-238),MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(7^o/ogy154:9-20)，以及人免疫3泉蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等，(1991)7\^wre353:90-94);苜蓿花叶病毒壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMVRNA4)(Jobling等，(1987)M^we325:622-625);烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等，(1989)载于Mo/ecw/"rA'o/o^Cech编辑，(Liss,NewYork),237-256页)；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等，(1991)F/ra/ogy81:382-385)。另参见Della-Cioppa等，(1987)户/a"f尸/戸'o/.84:965-968。在制备表达盒时，可操作多种DNA片段，从而提供方向正确并在适宜时读框适合的DNA序列。为此，可使用适配体或连接物来连接DNA片段，或者可包括其它操作，以提供便利的限制性位点、除去冗余的DNA、除去限制性位点等。为此目的，可包括体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代(例如转换和颠换)。在本发明实践中可使用多种启动子，包括目标多核苷酸序列的天然启动子。可基于所需结果选择启动子。可将本发明的核酸与组成型启动子、组织优选启动子或其它启动子组合，用于在植物中表达。这样的组成型启动子包括例如在WO99/43838和美国专利第6,072,050号中7>开的Rsyn7启动子的核心启动子和其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等，(1985)胸訓313:810-812);水稻肌动蛋白(McElroy等，(1990)P/a加Ce〃2:163-171);泛素(Christensen等，(1989)尸/朋fMo/.12:619-632和Christensen等，(1992)尸teMo/.所o/.18:675-689);pEMU(Last等，(1991)77eor.^;/.81:581-588);MAS(Velten等,(1984)3:2723-2730);ALS启动子(美国专利第5,659,026号)等。其它组成型启动子包括例如美国专利第5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268，463、5，608,142和6,177,611号。的基因表达。基于此目的，启动子可以是化学诱导型启动子，在此情况下使用化学物质诱导基因表达，或者是化学阻抑型启动子，在此情31况下通过使用化学物质抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于可^皮恭璜酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子、可被用作前应急除草剂的疏水亲电化合物激活的玉米GST启动子，以及^^皮水杨酸激活的烟草PR-la启动子。其它值得关注的化学调节启动子包括类固醇响应型启动子(参见例如Schena等，(1991)尸roc.爿cad"&488:10421-10425和MeNellis等，(1998)P/朋f/.14(2):247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见例如Gatz等，(l991)Mo/.227:229-237和美国专利第5,814,618和5,789,156号)，所述文献通过引用结合到本文中。可使用组织优选启动子将增强的Zm-D9表达定向于特定植物组织。組织优选启动子包括Yamamoto等，(1997)尸/a"f12(2):255-265;Kawamata等，(1997)CW/户/ywo/.38(7):792-803;Hansen等，(1997)Mo/.254(3):337画343;Russell等，(1997)6(2):157-168;Rinehart等,(1996)P/a"fP/j>^o/.112(3):1331-1341;VanCamp等，(1996)P/朋f尸/2;^0/.112(2):525誦535;Canevascini等，(1996)P/aWP/j^y/o/.112(2):513-524;Yamamoto等，(1994)尸/朋fCe//尸/2;wo/.35(5):773-778;Lam(1994)Ke油/VoW,Ce〃20:181-196;Orozco等，(1993)尸/朋《Mo/所o/.23(6):1129-1138;Matsuoka等，(1993)A^/.爿o^.Sc/.U&490(20):9586-9590和Guevara-Garcia等，(1993)尸/a加,4(3):495-505。如有需要，可修饰这样的启动子，以减弱表达。本发明的某些实施方案利用以组织优选启动子转化的植物，尤其是茎优选启动子，其与编码Zm-D9蛋白的核苷酸序列有效连接。在本发明的一个实施方案中，MS-S2A启动子(Abrahams等，(1995)P/amMo/说o/27:513-28)与编码野生型或MUT1Zm-D9蛋白的多核苷酸序列有效连接。启动子的选择，以及固有的组织特异性，应有可能影响表达本发明的野生型或MUT1Zm-D9蛋白的转基因植物的形态改变的程度或强度。就MS-S2A启动子而言，茎优选的意^^木着已有文件记录到与维管元件相关的表达(未显示数据)。MS-S2A启动子似乎对MUT1Zm-D9的表达最佳，而肌动蛋白一一种在叶组织中具有较高表达的组成型表达启动子，在用于MUT1ZM-D9蛋白表达时，形态改变非常适度或轻微。叶优选启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等，(1997)尸/朋f,12(2):255-265;Kwon等，(1994)尸/a"f尸/ywo/.105:357-67;Yamamoto等，(1994)尸/朋fCe〃尸/^wo/.35(5):773-778;Gotor等，(1993)尸/朋"3:509-18;Orozco等，(1993)P/a"fAfo/.肠/.23(6):1129-1138;和Matsuoka等，(1993)Prac.Ato/.爿cadSc/."&490(20):9586-9590。(参见上文)。根优选启动子是已知的，可选自众多可由文献获得的启动子，或从多种相适物种中从头分离。参见例如Hire等，(1992)P/a"fMo/.5/o/.20(2):207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)尸/"mC"/3(10):1051-1061(法国菜豆GRP1.8基因的根特异性控制元件)；Sanger等，(1990)P/aWMo/.Ao/.14(3):433-443(根瘤土壤杆菌甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao等，(1991)Ce〃3(l):ll-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其可在大豆根和根瘤中表达)。另参见Bogusz等，(1990)户/"WCe〃2(7):633-641，其中描述了从固氮非豆科榆科山黄麻(尸araspow/a朋oferaow'0和相关的非固氮非豆科山黄麻(7>ematom朋tosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子与p-葡萄糖醛酸苷酶报告基因连接，并导入到非豆科烟草(Wco"a"atoZ)Gfcw附)和豆科百脉根(丄o^sco/w'cw/aft^)这二者中，在这二种情况下根特异性启动子活性都得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对发冲艮土i裏杆菌04gra6arfenwwr/2/zoge"e力中高表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见尸/"W(Limerick)79(1):69-76)。他们推断增强子和组织优选的DNA决定子在这些启动子中^Jf离的。Teeri等，(1989)用与lacZ融合的基因表明，编码章鱼33碱合酶的土壤杆菌(jgrak7"m"w)T-DNA基因在根尖表皮中尤其有活性，TR2'基因在完整植物中是根特异性的，并被叶组织中的伤口刺激，与杀虫剂或杀幼虫剂基因一起使用是尤其合乎需要的特征组合(参见5"MBOJ.8(2):343_350)。与"/^//(新霉素磷酸转移酶11)融合的TR1'基因表现出类似的特征。其它的根优选启动子包括VffiNOD-GRP3基因启动子(Kuster等，(1995)尸/朋fMo/.说o/.29(4):759-772)和roffi启动子(Capana等，(1994)Pte編.舰25(4):681腸691)。另参见美国专利第5,837,876、5,750,386、5，633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和5,023,179号。在需要低水平表达的情况下，将使用弱启动子。一般而言，所述"弱启动子"意指以低水平驱动编码序列表达的启动子。所述低水平意指约1/1000转录物的水平至约1/100,000转录物的水平至约1/500,000转录物的水平。或者，要认识到，弱启动子还包括仅在某些细胞而不在其它细胞中表达的启动子，以产生总体低水平表达。在启动子以不可4^受的高水平表达的情况下，可以缺失或修饰部分启动子序列，以降低表达水平。这样的弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO99/43838和美国专利第6,072,050号)、核心CaMV35S启动子等。其它组成型启动子包括例如美国专利第5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268，463和5,608，142号。另参见美国专利第6,177,611号，该专利在此引入作为参考。表达盒还可以包括用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于转化细胞或组织的选择。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些，以及赋予对除草剂化合物(例如草铵磷、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-D))抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记，例如P-半乳糖苷酶和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等，(2004)说o&c/mo/85.610-9和Fetter等，(2004)尸/a"fCe〃/6.'215画28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等，(2004)Ce〃117:943-54和Kato等，(2002)P/aW尸/2)w'o/129:913國42)和黄色焚光蛋白(来源于Evrogen的PhiYFP,参见Bolte等，(2004)/.Ce〃117:943-54)。关于其它选择性标记，通常参见Yarmnton(1992)CWr.0//".5zo&cA.3:506-511;Christopherson等，(1992)尸rac.Sc/.(7&489:6314-6318;Yao等，(1992)Ce〃71:63-72;Reznikoff(1992)A/o/.M/cra6/o/.6:2419-2422;Barkley等，(1980)载于772eOpera",177-220页；Hu等，(1987)Ce〃48:555-566;Brown等，(1987)Ce〃49:603-612;Figge等，(1988)Ce〃52:713-722;Deuschle等，(1989)Prac.Ato/.爿c/.(7&486:5400-5404;Fuerst等，(1989)Prac.A^/.爿cad"&486:2549-2553;Deuschle等，(1990)Sc/e"ce248:480-483;Gossen(1993)博士论文，海德堡大学；Reines等，(1993)P厂oc.Ato/.爿cadW&490:1917-1921;Labow等，(1990)Mo/.Ce〃.说o/.10:3343-3356;Zambretti等，(1992)尸rac,Ato/.LS489:3952-3956;Baim等，(1991)A^/.A^,5W.88:5072-5076;Wyborski等，(1991)M/c/e/c爿d必19:4647-4653;Hillenand-Wissman(1989)7bp/aMo/.Sfrwc.说o/.10:143-162;Degenkolb等，(1991)爿w"附/cn)6.爿ge^yOzewoAer.35:1591-1595;Kleinschnidt等，(1988)说ocAem,'对^27:1094-1104;Bonin(1993)博士论文，海德堡大学；Gossen等，(1992)Ato/.爿a^U&489:5547-5551;Oliva等，(1992)爿油'm/cra6.4gentoC/jemo^er.36:913-919;Hlavka等，(1985)7fo"必ooA:o/Ex/enimewto/尸/wrmaco/ogy,第78巻(Springer画Verlag,Berlin);Gill等,(1988)A^we334:721-724。这些公开内容通过引用结合到本文中。以上列出的选择标记基因没有限制性。在本发明中可使用任何选择性标记基因。在一个实施方案中，将目标多核普酸分子靶向用于表达的叶绿体。以此方式，在目标多核香酸没有直接插入叶绿体的情况下，表达盒将另外包含编码转运肽的核酸，以将目标基因产物导入叶缘体中。35这样的转运肽是本领域已知的。参见例如VonHeijne等，(1991)尸/a"fMo/.5/o/.Aep.9:104-126;Clark等，(1989)J.说o/.CTzem.264:17544-17550;Della-Cioppa等，(1987)尸/a"fP/2"Zo/.84:965-968;Romer等，(1993)万/oc/z柳..脑.Co麵w".196:1414-1421;和Shah等，(1986)233:478-481。叶绿体耙向序列是本领域已知的，包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(deCastroSilvaFilho等，(1996)Mo/,说o/.30:769-780;Schnell等，(1991)/.Ao/.C/ze肌266(5):3335-3342);5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等，(l990)J.5/o/we/w/>.22(6):789-810);色氨酸合酶(Zhao等，(1995)>7.5/o/.CTzem.270(11):6081-6087);质体蓝素(Lawrence等，(1997)/.说o/.C&w.272(33):20357-20363);分支酸合酶(Schmidt等，(1993)说o/.C/zem.268(36):27447-27457);以及集光叶绿素^结合蛋白(LHBP)(Lamppa等，(1988)/.5,'o/.C/j柳.263:14996-14999)。另参见VonHeijne等，(1991)P/a加Afo/.S/o/.A印.9:104-126;Clark等，(1989)/.说o/.C/ew.264:17544-17550;Della-Cioppa等，(1987)尸/a"fP/^/o/.84:965-968;Romer等，(1993)5/0/7/2".Comww".196:1414-1421;和Shah等，(1986)Sc/e"ce233:478-481。用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如Svab等，(1990)/Voc.爿cac/.87:8526-8530;Svab和Maliga(1993)A^/.爿cadSc/.90:913-917;Svab和Maliga(1993)/.12:601-606。该方法依靠粒子枪传递含有选择性标记的DNA,并将该DNA通过同源重组靶向质体基因组。另外，可通过核编码和质体导向的RNA聚合酶的组织优选的表达反式激活质体携带的沉默转基因的，由此实现质体转化。这样的系统已在McBride等，(1994)尸rac.Waf/.y4cadSc/.[/&491:7301-7305中净良道。可以优化被靶向叶绿体的目标多核苦酸，用以在叶绿体中表达，以说明植物核和该细胞器之间的密码子使用差异。以此方式，可使用36叶绿体优选的密码子合成目标多核苷酸分子。参见例如美国专利号5,380,831,该专利通过引用结合到本文中。本发明的方法包括将多肽或多核苷酸分子导入到植物中。"导入"是指向植物提供多核苷酸分子或多肽，提供方式可使序列进入植物细胞内部。本发明的方法不依赖于向植物中导入序列的具体方法，只要多核苷酸分子或多肽进入植物的至少一个细胞内部。将多核苷酸分子或多肽导入4直物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导的方法。"稳定转化"意指导入到植物中的目标核苷酸构建体整合到植物基因组中，并能由其子代遗传下去。"瞬时转化"意指多核苷酸分子被导入到植物中，并且不整合到植物基因组中，或者将多肽导入到植物中。转化程序以及向植物中导入多肽或多核苷酸序列的程序可依据作为转化靶标的植物或植物细胞的类型(即是单子叶还是双子叶)而变化。向植物细胞导入多肽和多核苷酸的适合方法包括微注射(Crossway等，(1986)5/(^c/2W々i^4:320-334)、电穿孔(Riggs等，(1986)尸rac.A^/.A:^/.L/&483:5602-5606)、土壤杆菌介导的转化(美国专利第5,563,055号和美国专利第5，981,840号)、定向基因转移(Paszkowski等，(1984)￡MS(9/.3:2717-2722)及弹道颗粒加速法(参见例如美国专利第4,945，050号；美国专利第5,879,918号；美国专利第5,886,244和5,932,782号；Tomes等，(1995)栽于尸/a"fCe〃，r&we,朋d(9rg""Cw/旨e:FiW謹e她/Md/0(iy,Gamborg和Phillips编辑，(Springer隱Verlag,Berlin);McCabe等，(1988)5Zo^c/2"o/ogy6:923画926);和Lecl转化(WO00/28058)。另参见Weissinger等，(1988)」肌"ev.G認t22:421-477;Sanford等，(1987)尸arto/她Sc/e脏朋drec/2"o/ogy5:27-37(洋葱)；Christou等，(1988)尸/朋f尸/2^,'o/.87:671-674(大豆)；McCabe等，(1988)说o/Tec/2"o/ogy6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)/"P7fraCe〃Dev.倫/.27P:175-182(大豆)；Singh等，(1998)T7eor，96:319-324(大豆);Datta等，(1990)说ofec/jwo/ogy8:736-740(水稻)；Klein等，(1988)尸rac.爿cadScZ.[/&485:4305-4309(玉米)；Klein等，(1988)B/o&c/wo/ogy6:559-563(玉米)；美国专利第5,240,855、5,322,783和5,324,646号；Klein等，(1988)尸/a"fP/2>w'o/.91:440-444(玉米)；Fromm等，(1990)5Zofec/wo/ogy8:833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren等，(1984)A^fw^(London)311:763-764;美国专利第5,736,369号(谷物)；Bytebier等，(1987)尸rac.Zo^.WX484:5345-5349(百合)；DeWet等，(1985)载于77e￡!x/7m'wewto/她w—/加'owo/Ovw/eT7纖es'Chapman等编辑,(Longman，NewYork),197-209页(花粉)；Kaeppler等，(1990)尸/a"fCe〃9:415-418和Ka印pler等，(1992)T72eorjpp/.84:560-566(颈须介导的转化)；D'Halluin等，(1992)尸/"WCW/4:1495-1505(电穿孔)；Li等，(1993)Ce〃12:250-255以及Christou和Ford(1995)j""a/s。/So^y75:407-413(水稻)；Osjoda等，(1996)Atow"说o&c/"o/ogy14:745-"0(玉米通过根瘤土i裏杆菌转化)；所有这些文献均通过引用结合到本文中。在具体的实施方案中，可使用多种瞬时转化方法将本发明的Zm-D9序列提供给植物。这样的瞬时转化方法包括但不限于将Zm-D9蛋白或其变体和片段直接导入植物中，或者将Zm-D9转录物导入植物中。这样的方法包括例如微注射或颗粒轰击。参见例如Crossway等，(1986)Afo/202:179-185;Nomura等，(1986)尸/朋fSc/.44:53-58;Hepler等，(1994)尸rac.扁.爿c。dSc,.91:2176-2180和Hush等，(1994)77eJow77fl/0/CW/Sc&"ce107:775-784,所有文献都通过引用结合到本文中。或者，Zm-D9多核苷酸分子可使用本领域已知的技术瞬时转化到植物中。这些技术包括病毒载体系统和以排除后续DNA释放的方式沉淀多核苷酸分子。因此，可由与颗粒结合的DNA进行转录，但其被释放以整合到基因组中的频率被极大降低。这些方法包括使用包被聚乙烯聚胺(polyethylimine)(PEI;Sigma冲3143)的颗粒。在其它实施方案中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本发明的多核苷酸分子导入植物中。通常，这样的方法包括将本发明的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子中。应当认识到，本发明的Zm-D9氨基酸序列最初可作为病毒多聚蛋白的一部分而合成，该部分稍后可在体内或体外通过蛋白水解加工，产生所需的重组蛋白。另外，要意识到的是，本发明的启动子还包括通过病毒RNA聚合酶转录^吏用的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的、用于将多核普酸导入才直物中并在其中表达编码蛋白的方法是本领域已知的。参见例如美国专利第5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931号和Porta等，(1996)Mo/ecw/wS/Wec/mo/ogy5:209-221;所述文献通过引用结合到本文中。在植物基因组中的特定位置靶向插入多核苷酸分子的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，使用位点特异重组系统实现多核苷酸分子在所需基因组位置的插入。参见例如W099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855和W099/25853,所有文献都通过引用结合到本文中。简而言之，本发明的多核苷酸分子可包含在转移表达盒中，侧接两个不引起重组的重组位点。将转移表达盒导入到耙位点已稳定掺入其基因组中的植物中，所述靶位点侧接两个对应于转移表达盒的位点的不引起重组的重组位点。提供合适的重组酶，使转移表达盒整合在靶位点。因此，目标多核苷酸分子被整合在植物基因组中的特定染色体位置。已转化的细胞可按照传统方法培育成植抹。参见例如McCormick等，(1986)P/aWCW/i^ports5:81-84。然后可培育这些植林，用相同转化的植抹或不同植林授粉，并鉴定组成型表达所需表型特征的所获子代。可培育两代或多代，以确保所需表型特征的表达#1稳定地保持并遗传，然后收获种子，以确保实现所需表型特征的表达。以此方式，本发明提供已将本发明的多核苷酸分子(例如本发明的表达盒)稳定掺入其基因组中的转化种子(也称为"转基因种子")。39镨系育种从两个基因型的杂交开始，例如目标原种系和另一个具有一种或多种与目标原种系互补的所需特征(即稳定掺入本发明的多核苷酸分子，调控的本发明多肽的活性和/或水平等)的近交系。如果两个原始亲本不提供所有需要特征，则在繁殖种群中可包括其它来源。在谱系方法中，使优良植4^自交，并在连续子代中选择。在随后的子代中，杂合状态被由自花授粉和选择产生的纯系代替。典型地，在谱系育种方法中，进行5个或更多个连续子代的自交和选择Fl~>F2;F2卄F3;F3■>F4;F4—F5等。在足量近交后，连续的子代将用于增加发育近交系的种子。在具体的实施方案中，近交系在其约95%以上的基因座包含纯合等位基因。回交除了用于产生回交转化之外，还可用于与语系育种组合，以改变目标原种系和使用改变的原种系产生的杂种。如前所述，回交可用于将来自一个系(供体亲本)的一个或多个特定所需特征转移到称为轮回亲本的近交系中，该近交系具备整体上良好的农学特征，但却没有所需的一种或多种特性。不过，该相同的程序可用于使子代倾向轮回亲本的基因型，4旦同时通过在早期停止回交并继续进行自交和选择保持非轮回亲本的许多组分。例如，产生诸如商品化杂种的Fl。该商品化杂种可与其亲本系之一回交，产生BC1或BC2。子代进行自交并选择，以使新发育的近交系具有轮回亲本的多种特征，但具有非轮回亲本的几个所需特征。该方法平衡了新型杂种和育种中所用的轮回亲本的价值和强度。因此，本发明的一个实施方案是使目标玉米近交系回交转化的方法，该方法包括以下步骤使目标玉米近交系植物与赋予所需特征(即降低林高或林型)的突变基因或转基因的供体植林杂交，选择赋予所需特征的突变基因或转基因的Fl子代植抹，并将选定的Fl子代植抹与目标玉米近交系植#朱回交。该方法还可以包括以下步骤获得目标玉米近交系的分子标记谱，并用该分子标记谱选择具有所需特征和目标近交系分子标记谱的子代才直株。按同样的方式，该方法通过增加以下40的最后一个步骤可用于生产Fl杂种种子使目标玉米近交系的所需特征转化与不同的玉米植林杂交，以产生赋予所需特征的突变基因或转基因的F1杂种玉米种子。轮回选择是在植物育种程序中用于改良植物群体的方法。该方法需要使个体植抹彼此杂交授粉，以形成子代。培育子代，并通过众多选择方法筛选优良子代，其包括个体植林、半同胞子代、全同胞子代、自交子代及顶交子代。选定的子代彼此杂交授粉，以形成另一群子代。种植该种群，并再次选择优良植抹，彼此进行杂交授粉。轮回选择是一个循环过程，因此可根据需要重复多次。轮回选择的目的是改良种群的品质。然后可将改良的种群用作育种材料的来源，以获得用于杂种或用作合成栽培变种的亲本的近交系。合成栽培变种是通过几个选定近交系的杂交所形成的后代。混合选择在与分子标记增强选择联合使用时是一种有用的技术。在混合选择中，根据表型和/或基因型选择来自个体的种子。然后，将这些选定的种子混合在一起，用于培养下一代。混合选择需要成批培育植物群，使植4朱自花授粉，成批收获种子，然后使用成批收获的种子的样本种植下一代。直接授粉可代替自花授粉用作育种程序的一部分。突变育种是可用于将新性状引入原种系的众多方法中的一种。对于植物育种工作者，自发产生或人工诱导的突变可为变异性的有用来源。人工诱变的目标是提高所需性状的突变速率。通过多种不同方法可提高突变速率，包括温度、长期种子储存、组织培养条件、辐射(例如X射线、Y射线(例如钴60或铯137)、中子(原子反应堆中铀235的核裂变产物)、p辐射(^U文射性同位素如磷32或碳14发射)或紫外线照射(优选地从2500nm至2900nm))，或化学诱变剂(例如-威基类似物(5-溴尿嘧啶)、相关化合物(8-乙氧基咖啡因)、抗生素(链黑霉素)、烷化剂(硫芥子气、氮芥、环氧化物、乙烯胺、硫酸盐、磺酸盐、砜、内酯)、叠氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶。一旦通过诱变观测到所需性状，41则可以通过传统育种技术如回交将该性状掺入既有种质中。突变育种的细节可见于"PrincipalsofCultivarDevelopment,"Fehr,1993MacmillanPublishingCompany,其公开内容通过引用结合到本文中。另外，在其它系中产生的突变可用于产生含这些突变的原种系的回交转化。本文使用的术语植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及在植物或才直物部分(例如胚、花粉、胚珠、种子、叶子、花、枝、果实、核/仁、耳穗(ears)、穗轴、外壳、杆、根、根尖、花药等)中完整的植物细胞。籽粒意指商业种植者为了生长或繁殖物种以外的目的而生产的成熟种子。再生的植物的后代、变体和突变体也包括在本发明范围内，只要这些部分包含导入的多核苷酸。本发明可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目标植物物种的实例包括但不限于玉米(Zeamap);芸苔类(Bra肌cflsp.)(例如甘兰型油菜(及"apzw)、白菜型油菜(凡ra;a)、芥菜型油茱(5.尤其是那些可用作种子油来源的芸苔类；苜蓿(Me血agos加'va)、水稻(O，a她va)、黑麦(Seca/ece，/e)、高粱(Sorg/MOT6/co/o/%Sorg/rawvw/gare)、黍(侈'J^口珍珠稷(尸ewm.s"wmg7awcw附)、稷(Paw/cwwm〃/aceww)、粟(Sefa〃'a"a//ca)、龙爪稷(五/eww'"ecorac朋(^'))、向曰葵(/^//""^^a朋wiw)、红花(Cart/wwz^"w"on'w力、马铃薯(So/a"wwfwZerosMW)、花生(^4rac//s/y^ogaea)、才帛花(Gos"/7/wm6ar6a(iewse,Gas^_y/7Zww//nsz^wm)、甘募(/po附oea6afaft^)、木募(Ma"z720fescw/e幽)、咖啡(Co,a卿.)、椰子(Coc(w肌cz/era)、菠萝(^4"朋ascomora力、4甘才禹属;f对(C"n^可可(r/2eo6rowaacao)、茶(Cawe〃/aWe服'力、香蕉(她sa聘梨(尸e，aa附m'ca—、无花果(FZcwscas7'ca)、番石榴(尸sW應g呵'crra)、芒果(M^喂/era/"血a)、橄榄(0/eaewro/aea)、番木瓜(Co7/3a/a少a)、腰果(^4/7acaWw附occ/c;fewto/e)、澳洲坚果(她c"由附Za〖>7fegrz/o//Gf)、杏仁(尸rw"wsam;vg必/w力、糖甜菜(万etovw/ga&)、甘蔗(Sfircc/wrn/m^/.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。蔬菜包括番痴(Z^copera'cowesctz/ew幽)、莴苣(例如Lac加casa"'vc()、扁豆(P/]aseo/usvw/gan's)、利马豆(尸/w^eo/iW/Zwe"w'力、豌豆(Lo^yms^;.)和黄瓜(Cwcwwz'力属成员，例如黄瓜(C.ra"V^)、哈密瓜(C.c朋to/w/e朋,》和甜瓜(C.we/o)。观赏植物包括杜鹃花(i/206to血"(irawW/7.)、八仙花(Macra//2少〃"/2>^ra/g—、芙蓉(/i7^cwsramycr"e"^)、玫瑰(ioraspp.)、郁金香(7W^as;p.)、水仙花(A^r/^iw^/7.)、矮牵牛花(尸W廳'flf/^6n'cto)、荷兰石竹(DZa涵wscfl^yop/y/〃w51)、一品红(Ewp/207"6/(3/w/c/2em'附句和菊花。可用于实施本发明的针叶树包括例如松树，例如火炬松(尸Z"wstoeda)、沼'泽^^(尸/"twe肌o"7)、美国黄;^"(尸z力iAy/70Wfifercwa)、黑l^(尸/"iwcowtorta)牙口辐射+》(尸Z"iASra&'Gfto);花》真+A(尸化wcfo^7^awe"2/e57'/);力口州纟失杉(Z^wgaca""cfe"wX);美国西力口云杉(尸/ceag/fifwca);红杉(Se《wo/a"wpervz'rais);冷杉，例如银批(^46&sa附GZ)Zfo)和胶枇(^4&esZw/sa附^);和雪,例如美国西部侧柏(r/^'ap"coto)和黄扁柏(C/wmaec^pahswoo^7tow&)。在具体的实施方案中，本发明的植物为栽培才直物(例如玉米、苜蓿、向曰葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、黍、烟草等)。在其它实施方案中，玉米和大豆植物是最佳的，在进一步的其它实施方案中，玉米植物是最佳的。其它目标植物包括提供目标种子的谷类植物、油类种子植物和豆科植物。目标种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。油类种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜尔豆、槐豆、胡,巴、大豆、青刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。提供在植物中调控本发明多肽的浓度和/或活性的方法。一般而言，浓度和/或活性相对于不含导入的本发明序列的天然对照植物、植物部分或细胞增加或降低至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。本发明中的调控可发生在植物生长至所需发育阶段的过程中和/或之后。在具体的实施方案中，在单子叶植物中尤其是玉米调控本发明的多肽。Zm-D9多肽的表达水平可通过例如植物中的Zm-D9多肽水平直接检测，或者例如通过植物中的Zm-D9多肽的Zm-D9活性(例如测定整体抹高或茎或杆的高度)间接检测。测定Zm-D9活性的方法在本文它处描述。在具体的实施方案中，将本发明的多肽或多核苷酸分子导入到档—物细胞中。随后，使用本领域技术人员已知的方法，例如但不限于DNA印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析，选择导入了本发明序列的植物细胞。通过前述实施方案而被改变或修改的植物或植物部分在档j朱形成条件下生长一段时间，该段时间足以调控本发明多肽在植物中的浓度和/或活性。植抹形成的条件在本领域中众所周知，并在本文它处简要论述。还要认识到的是，可使用不能在转化植物中引导蛋白或RNA表达的多核苷酸分子调控多肽的水平和/或活性。例如，本发明的多核苷酸可用于设计多核苷酸构建体，该构建体可用于改变或突变生物中的基因组核香酸序列的方法中。这样的多核苷酸构建体包括但不限于RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合双螺旋寡核苷酸、自身互补的RNA:DNA寡核苷酸和引起重组的寡核苷酸酶。这些核苷酸构建体和使用方法是本领域已知的。参见美国专利第5,565，350、5,731,181、5,756,325、5,760,012、5,795,972和5,871,984号；所有专利都通过引用结合到本文中。另参见WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821和Beetham等，(1999)P亂扁.加dSci.[/&496:8774-8778;所述文献通过引用结合到本文中。因此，要认识到，本发明的方法不依赖于将整个多核苷酸掺入基因组中，只要植物或其细胞由于多核苷酸分子导入细胞中而发生改变即可。在本发明的一个实施方案中，基因组可在多核苷酸分子导入细胞中之后而被改变。例如，多核苷酸或其任何部分均可掺入植物基因组中。本发明的基因组改变包括但不限于基因组中的核苷酸的增加、缺失和取代。尽管本发明的方法不依赖于任何特定数目核苷酸的添力口、缺失和取代，但公认这类添加、缺失或取代包含至少1个核苷酸。在一个实施方案中，增加本发明的Zm-D9多肽的活性和/或水平。可通过向植物提供Zm-D9多肽实现本发明的Zm-D9多肽水平和/或活性的增加。如本文它处所论述，本领域已知向植物提供多肽的许多方法，包括但不限于将多肽直接导入植物中，和将编码具有Zm-D9活性的多肽的多核苷酸构建体导入植物中(瞬时地或稳定地)。还要认识到，本发明的方法可使用不能在转化植物中指导蛋白或RNA表达的多核苷酸分子。因此，Zm-D9多肽的水平和/或活性可通过改变编码Zm-D9多肽的基因或其启动子而增加。参见例如Kmiec，美国专利5,565,350;Zarling等，PCT/US93/03868。因此，提供了在Zm-D9基因中携带突变的诱变植物，其中突变增加Zm-D9基因的表达，或增加所编码Zm-D9多肽的Zm-D9活性。在其它实施方案中，通过将抑制本发明的Zm-D9多肽的水平或活性的多核苷酸导入植物中降低或去除本发明的Zm-D9多肽的活性和/或水平。所述多核苷酸可通过阻止Zm-D9信使RNA的翻译而直接抑制Zm-D9表达，或通过抑制编码Zm-D9蛋白的Zm-D9基因的转录或翻译的编码多肽间接抑制Zm-D9表达。在植物中抑制或去除基因表达的方法在本领域众所周知，任何这样的方法均可在本发明中用于抑制Zm-D9在植物中的表达。在本发明的其它实施方案中，用抑制Zm-D9多肽活性的多肽的编码序列转化植物细胞来降低或去除Zm-D9多肽的活性。在其它实施方案中，可通过^C坏编码Zm-D9多肽的基因降低或去除Zm-D9多肽的活性。本发明包括在Zm-D9基因中携带突变的诱变植物，其中突变降低Zm-D9基因的表达，或抑制编码的Zm-D9多肽的Zm-D9活性。植物遗传工程的若干方面需要降低特定基因的活性(也称为基因沉默或基因抑制)。许多基因沉默技术在本领域众所周知，包括但不限于反义技术(参见例如Sheehy等，(1988)尸roc.爿o^.Sc/.V&485:8805-8809;和美国专利号5,107,065;5,453,566;和5,759,829);共抑制(例如Taylor(1997)尸/"WCe〃9:1245;Jorgensen(1990)7Ve"A伤ofec/2.8(12):340國344;Flavell(1994)尸rac.A^/.爿cadScZ.7&491:3490-3496;Finnegan等，(1994)说o/Tec/wo/ogy12:883-888;和Neuhuber等，(1994)Afo/.G饥Ge"ef.244:230-241);RNA干扰(Napoli等，(1990)尸/a"fCW/2:279-289;美国专利号5,034,323;Sharp(1999)Ge"^Dev.13:139-141;Zamore等，(2000)Ce〃101:25-33;和Montgomery等，(1998)Prac.A^/.爿cadOS495:15502-15507);病毒诱导的基因沉默(Burton等，(2000)尸/a"fCe//12:691-705;和Baulcombe(1999)O/tt.Op.尸/"m5/0.2:109-113);耙-RNA-特异性核酶(Haseloff等，(1988)胸脚334:585-591);发夹结构(Sm池等，(2000)Atow^407:319-320;WO99/53050;WO02/00904;WO98/53083;Chuang和Meyerowitz(2000)尸rac.iVa".爿cadSc/.[/&497:4985-4990;Stoutjesdijk等，(2002)P/朋fiVzyo/.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)Ato.4:29-38;Pandolfini等，SMC说ofec/^o/ogy3:7，美国专利公布号20030175965;Panstruga等，(2003)Mo/.说o/.30:135-140;Wesley等，(2001)尸/a"f汄27:581-590;Wang和Waterhouse(2001)Cwr.Qp/".尸/aW说o/.5:146-150;美国专利7>布号20030180945;以及WO02/00904,所有这些文献都通过引用结合到本文中)；核酶(Steinecke等，(1992)J.11:1525;和Perriman等，(1993)JwtoeraeAay.Dev.3:253);寡核苦酸介导的靶向修改(例如WO03/076574和WO99/25853);锌指靶向分子(例如WO01/52620;WO03/048345;和WO00/42219);转座子标记(Maes等，(1999)TVe"Af/aWSc/.4:90誦96;Dharmapuri和Sonti(1999)A^cra^'o/.179:53-59;Meissner等，(2000)P/"""22:265-274;Phogat等，(2000)A(wcz'.25:57-63;Walbot(2000)Cww.Opz>2.P/aW^o/.2:103-107;Gai等，(2000)A^c/e/c爿czAi仏28:94-96;Fitzmaurice等，(1999)Ge"e"cs153:1919-1928;Bensen等，(1995)P/"WCe〃7:75-84;Mena等，(1996)Sc/e"ce274:1537-1540;和美国专利第5,962,764号)；所述文献的每一个均通过引用结合到本文中；以及其它方法和本领域技术人员已知的以上方法的组合。要认识到的是，用本发明的多核苷酸可以构建与Zm-D9序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的反义构建体。构建的反义核普酸与对应的mRNA杂交。可对反义序列进行修饰，只要该序列与对应的mRNA杂交并干扰其表达。以此方式，可以使用与对应的反义序列具有70%、优选80%、更优选85%的序列同一性的反义构建体。此外，反义核普酸的部分可用于破坏耙基因的表达。一般而言，可使用至少50个核苷酸、IOO个核苷酸、200个核苷酸、300个、400个、450个、500个、550个以上的核苷酸的序列。本发明的多核苷酸还可以用于在植物中以有义方向抑制内源基因表达。使用有义方向的多核苷酸在植物中抑制基因表达的方法是本领域已知的。一般来说，该类方法涉及用^sf在植物中驱动表达的启动子的DNA构建体转化;植物，所述启动子与对应于内源基因转录物的至少部分多核苷酸有效连接。典型地，该核苷酸序列与内源基因转录物的序列具有显著的序列同一性，优选约65%以上的序列同一性，更优选约85%以上的序列同一性，最优选约95%以上的序列同一性。参见美国专利第5,283,184和5,034,323号，所述专利通过引用结合到本文中。因此，许多方法可用于降低或去除Zm-D9多肽的活性。可使用一种以上的方法降低单一Zm-D9多肽的活性。另外，还可以使用组合方法来降低或去除Zm-D9多肽的活性。在某些实施方案中，用表达抑制Zm-D9表达的多核苷酸的表达盒转化Zm-D9植物细胞来降低或去除Zm-D9的活性。该多核苷酸可47通过阻止Zm-D9信使RNA的翻译而直接抑制一个或多个Zm-D9蛋白表达，或通过编码抑制编码Zm-D9蛋白的玉米基因的转录或翻译的多肽间接抑制一个或多个Zm-D9蛋白表达。在^f直物中抑制或去除基因表达的方法在本领域众所周知，任何这样的方法均可在本发明中用于抑制一个或多个Zm-D9蛋白的表达。根据本发明，如果Zm-D9的蛋白水平在统计上低于在未进行遗传改变或诱变以抑制该Zm-D9蛋白表达的植物中的相同Zm-D9的蛋白水平，则Zm-D9的表达^支抑制。在本发明的具体实施方案中，在本发明的改变植物中的Zm-D9蛋白的蛋白水平低于在不是突变体或还未4皮遗传改变以抑制该Zm-D9蛋白表达的植物中相同Zm-D9蛋白的蛋白水平的95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。Zm-D9蛋白的表达水平例如可通过测定玉米片直物细胞或植物中表达的Zm-D9蛋白水平直接测定，或者例如通过检测玉米植物细胞或植物中Zm-D9蛋白的Zm-D9活性间接测定。测定Zm-D9蛋白的Zm-D9活性的方法在本文它处描述。在本发明的其它实施方案中，用表达盒转化玉米植物细胞来降低或去除一个或多个Zm-D9蛋白的活性，所述表达盒含编码抑制一个或多个Zm-D9蛋白活性的多肽的多核苷酸。根据本发明，如果Zm-D9蛋白的Zm-D9活性在统计上^^于在未进行遗传改变以抑制该Zm-D9蛋白的Zm-D9活性的植物中相同Zm-D9蛋白的Zm-D9活性，则Zm-D9蛋白的Zm-D9活性被抑制。在本发明的具体实施方案中，在本发明的改变植物中的Zm-D9蛋白的Zm-D9活性低于在还未进行遗传改变以抑制该Zm-D9蛋白表达的植物中相同Zm-D9蛋白的Zm-D9活性的95%、90%、80°/。、70。/。、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。根据本发明，当通过本文它处描述的检测方法不能检出Zm-D9蛋白的Zm-D9活性时，则该活性被"去除/消除"。测定Zm-D9蛋白的Zm-D9活性的方法在本文它处描述。在其它实施方案中，可通过破坏编码Zm-D9蛋白的基因降低或48去除Zm-D9蛋白的活性。本发明包括在Zm-D9基因中携带突变的诱变玉米植物，其中所述突变降低Zm-D9基因的表达，或抑制编码的Zm-D9蛋白的Zm-D9活性。因此，可使用多种方法降低或去除Zm-D9蛋白的活性。可使用一种以上的方法降低单个Zm-D9蛋白的活性。另夕卜，还可使用组合方法降低或去除两个或多个不同Zm-D9蛋白的活性。降低或去除Zm-D9蛋白表达的方法的非限制性实例在下文给出。A.基于多核苷酸的方法在本发明的某些实施方案中，用能够表达抑制Zm-D9蛋白表达的多核苷酸的表达盒转化玉米植物细胞。本文所用术语"表达，，是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，对本发明目标而言，能够在玉米植物中表达抑制至少1个Zm-D9蛋白表达的多核苷酸的表达盒是能够在玉米植物中产生抑制至少1个Zm-D9蛋白的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。从DNA分子"表达"或"产生"蛋白或多肽是指编码序列的转录和翻译产生蛋白或多肽，而从RNA分子"表达"或"产生"蛋白或多肽是指RNA编码序列的翻译产生蛋白或多肽。在玉米植物中抑制Zm-D9蛋白表达的多核苷酸的实例在下文给出。1.有义抑制/共抑制在本发明的某些实施方案中，可通过有义抑制或共抑制获得对Zm-D9蛋白表达的抑制。对于共抑制，表达盒设计用于以"有义，，方向表达对应于编码Zm-D9蛋白的信使RNA的全部或部分的RNA分子。RNA分子的过表达可导致天然基因表达降低。因此，筛选用共抑制表达盒转化的多个植物系，以鉴定那些表现出最大的Zm-D9蛋白表达抑制的植物系。用于共抑制的多核苷酸可对应于编码Zm-D9蛋白的序列的全部或部分，Zm-D9蛋白转录物的5'和/或3'非翻译区的全部或部分，或者编码Zm-D9蛋白的转录物的编码序列和非翻译区这二者的全部或部分。在某些实施方案中，在多核苷酸包含Zm-D9蛋白编码区的全部或部分时，表达盒^皮设计成除去多核苷酸的起始密码子，使得蛋白产物将不被转录。共抑制可用于抑制植物基因表达，以产生由这些基因编码的蛋白的蛋白水平不可检测的植物。参见例如Broin等，(2002)尸/朋fCe〃14:1417-1432。共抑制还可以用于抑制同一植林中多个蛋白的表达。参见例如美国专利第5,942,657号。用共抑制抑制植物中的内源基因表达的方法描述于下列文献中Flavell等，(1994)尸rocMW/.爿cadt/&491:3490-3496;Jorgensen等，(1996)P/aWMo/.说o/.31:957-973;Johansen和Carrington(2001)P/aW尸wo/.126:930-938;Broin等，(2002)尸/o"fO〃14:1417-1432;Stoutjesdijk等，(2002)尸/a加尸/^/。/.129:1723-1731;Yu等，(2003)尸/y/toc/^m加^63:753-763;和美国专利第5,034,323、5,283,184和5,942,657号；所述文献的每一个均通过引用结合到本文中。可通过在表达盒的有义序列的3'位和聚腺苷化信号的5'位包含poly-dT区来提高共抑制的效率。参见美国专利公开号20020048814,该专利通过引用结合到本文中。典型地，该核苦酸序列与内源基因转录物的序列具有显著的序列同一性，优选约65%以上的序列同一性，更优选约85%以上的序列同一性，最优约95%以上的序列同一性。参见美国专利第5,283,184和5,034,323号，所迷专利通过引用结合到本文中。2.反义抑制在本发明的某些实施方案中，可通过反义抑制获得对Zm-D9蛋白表达的抑制。对于反义抑制，表达盒被设计成表达与编码Zm-D9蛋白的信使RNA的全部或部分互补的RNA分子。反义RNA分子的50过表达可导致天然基因的表达降低。因此，篩选用反义抑制表达盒转化的多个植物系，以鉴定表现出最大的Zm-D9蛋白表达抑制的那些植物系。用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码Zm-D9蛋白的序列的互补物的全部或部分，Zm-D9蛋白转录物5'和/或3'非翻译区的互补物的全部或部分，或者编码Zm-D9蛋白的转录物的编码序列和非翻译区这二者的互补物的全部或部分。另外，反义多核苷酸可以与靶序列完全互补(即与耙序列的互补物100%同一性)或部分互补(即与靶序列的互补物的同一性小于100%)。反义抑制可用于抑制同一植抹中多种蛋白的表达。参见例如美国专利第5,942,657号。此外，反义核苷酸的部分可用于破坏耙基因的表达。一般而言，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苦酸、300个、400个、450个、500个、550个以上的核香酸的序列。用反义抑制来抑制植物中的内源基因表达的方法描述在例如Liu等，(2002)尸/aW尸/jywo/.129:1732-1743和美国专利笫5,759,829和5,942,657号中，所述文献每个均通过引用结合到本文中。可通过在表达盒中的反义序列的3'位和聚腺苷化信号的5'位包含poly-dT区来提高反义抑制的效率。参见美国专利公开号20020048814,该专利通过引用结合到本文中。3.双链RNA干扰在本发明的某些实施方案中，可通过双链RNA(dsRNA)干扰获得对Zm-D9蛋白表达的抑制。对于dsRNA干扰，在同一细胞中表达与以上对共抑制所述类似的有义RNA分子和与有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子，产生对相应内源信使RNA表达的抑制。设计含有义序列和反义序列的表达盒可实现有义和反义分子的表达。或者，可对正义和反义序列使用独立的表达盒。然后筛选用一个或多个dsRNA干扰表达盒转化的多种植物系，以鉴定表现出最大Zm-D9蛋白表达抑制的植物系。用dsRNA干扰抑制内源植物基因表51达的方法描述在Waterhouse等，(1998)尸rac.A^/.爿codSc/.(7&495:13959-13964;Liu等，(2002)尸/a"f尸/;^0/.129:1732-1743和WO99/49029、WO99/53050、WO99/61631和WO00/49035中；所述文献每个均通过引用结合到本文中。4.发夹RNA干扰和含有内含子的发夹RNA干扰在本发明的某些实施方案中，可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含有内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰获得对Zm-D9蛋白表达的抑制。这些方法高效抑制内源基因的表达。参见Waterhouse和Helliwell(2003)W加.Pev.4:29-38和其中提及的参考文献。对于hpRNA千扰，表达盒纟皮设计成表达与自身杂交而形成发夹结构的RNA分子，所述发夹结构含有单链环区和威基配对茎。碱基配对茎区含有对应于内源信使RNA的全部或部分的有义序列以及与该有义序列完全或部分互补的反义序列，所述内源信使RNA编码基因的表达被抑制。因此，分子的碱基配对茎区通常决定RNA干扰的特异性。hpRNA分子高效抑制内源基因表达，其诱导的RNA干扰可由植物后代继承。参见例如Chuang和Meyerowitz(2000)爿cadScZ.[/&497:4985-4990;Stoutjesdijk等，(2002)尸/aW尸/^wo/.129:1723-1731;和Waterhouse和Helliwell(2003)Ato.iev.4:29-38。使用hpRNA干扰抑制或沉默基因表达的方法描述在例如Chuang和Meyerowitz(2000)尸rac.Ato/.爿cadSc/.OX497:4985-4990;Stoutjesdijk等，(2002)P/aW尸/^wo/.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)A^f.4:29-38;Pandolfmi等，5MC说o&c/2"o/ogv3:7和美国专利公开号20030175965中；所述文献每个均通过引用结合到本文中。在Panstruga等，(2003)Mo/.S/o/.化/7.30:135-140中描述了hpRNA构建体在体内沉默基因表达的效率的瞬时测定，该文献通过引用结合到本文中。对于ihpRNA，千扰分子具有与hpRNA相同的通用结构，但RNA分子另外含有能够在表达ihpRNA的细胞中被剪接的内含子。使用内含子使发夹RNA分子中剪接后环的大小最小化，这增加了干扰效率。参见例如Smith等，(2000)Mm/M407:319-320。事实上，Smith等使用ihpRNA介导的干扰表现出100%的内源基因表达抑制。用ihpRNA干扰抑制内源植物基因表达的方法描述在例如Smith等，(2000)407:319-320;Wesley等，(2001)P/aW/27:581-590;Wang和Waterhouse(2001)C鮮.争力.尸/a"肠/.5:146-150;Waterhouse和Helliwell(2003)iVatWe乂4:29-38;Helliwell和Waterhouse(2003)MeAoA30:289-295和美国专利公开号20030180945中，所述文献的每一个均通过引用结合到本文中。用于hpRNA千扰的表达盒还可以设计成有义序列和反义序列不对应于内源RNA。在该实施方案中，有义序列和反义序列位于环序列侧翼，所述环序列含有的核苷酸序列对应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分。因此，是环区决定RNA千扰的特异性。参见例如WO02/00904，该文献通过引用结合到本文中。可通过使用hpRNA构建体实现转录基因沉默(TGS)，其中发夹的反向重复序列与要沉默的基因启动子区共有序列同一性。将hpRNA加工为可与同源启动子区相互作用的短RNA可触发降解或甲基化，从而导致沉默(Aufsatz等，(2002)/WAS99(4):16499-16506;Mette等，(2000)五MS(9J19(19):5194-5201)。v.扩增子介导的干扰扩增子表达盒含有植物病毒来源的序列，该序列含有全部或部分的耙基因，但通常不含天然病毒的所有基因。表达盒的转录产物中存在的病毒序列可使转录产物指导其自身复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列(即Zm-D9蛋白的信使RNA)可为有义的或反义的。用扩增子抑制内源植物基因表达的方法描述在例如Angell和Baulcombe(1997)五MSOJ.16:3675-3684;Angell和Baulcombe(1999)尸/a"f,5320:357-362和美国专利第6,646,805号中，所述文献的每一个均通过引用结合到本文中。6.核酶在某些实施方案中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是催化性RNA，或者对Zm-D9蛋白的信使RNA具有特异性的核酶活性。因此，多核苷酸可使内源信使RNA降解，导致Zm-D9蛋白的表达降低。该方法描述于例如美国专利第4,987，071号，该专利通过引用结合到本文中。7.小干扰RNA或微RNA在本发明的某些实施方案中，可通过表达编码微RNA(miRNA)的基因的RNA干扰获得对Zm-D9蛋白表达的抑制。miRNA是由约22个核糖核普酸组成的调控因子。miRNA高效抑制内源基因表达。参见例如Javier等，(2003)A^we425:257-263，该文献通过引用结合到本文中。t对于miRNA干扰，表达盒被设计成表ii^莫拟内源miRNA基因的RNA分子。miRNA基因编码的RNA形成含22个核苷酸的序列的发夹结构，该结构与另一内源基因(靶序歹'1)互补。为抑制Zm-D9蛋白表达，22个核苷酸的序列选自Zm-D9蛋白转录物序列，并在有义方向含有所述Zm-D9蛋白序列的22个核苷酸，以及与有义序列互补的对应反义序列的21个核普酸。miRNA分子高效抑制内源基因表达，它们诱导的RNA干扰被植物后代继承。B.基于多肽的基因表达抑制在一个实施方案中，多核苷酸编码的锌指蛋白与在玉米植物或细胞中编码Zm-D9蛋白的基因结合，导致基因表达降低。在具体的实施方案中，锌指蛋白与Zm-D9蛋白基因的调控区结合。在其它实施方案中，锌指蛋白与编码Zm-D9蛋白的信使RNA结合，并阻止其翻译。选择锌指蛋白靶向位点的方法描述于例如美国专利第6,453,242号，使用锌指蛋白抑制植物中的基因表达的方法描述于例如美国专利公开号20030037355;所述文献的每一个均通过引用结合到本文中。C.基于多肽的蛋白活性抑制:在本发明的某些实施方案中，多核苷酸编码与至少一种Zm-D9蛋白结合的抗体，并降低Zm-D9蛋白的Zm-D9活性。在另一个实施方案中，抗体的结合通过细胞质控机制导致抗体-Zm-D9蛋白复合物的转换增加。抗体在植物细胞中的表达以及通过在植物细胞中表达抗体并使抗体与蛋白结合而抑制分子途径在本领域众所周知。参见例如Conrad和Sonnewald(2003)A^wre说o^c/j.21:35-36，该文献通过引用结合到本文中。D.基因破坏:在本发明的某些实施方案中，通过破坏编码Zm-D9蛋白的基因降低或去除Zm-D9蛋白的活性。可通过任何本领域已知方法破坏编码Zm-D9蛋白的基因。例如，在一个实施方案中，通过转座子标记破坏基因。在另一个实施方案中，如下破坏基因使用随机或定向诱变诱变玉米植物，并选择Zm-D9蛋白活性降低或改变的植物。1.转座子标记在本发明的一个实施方案中，使用转座子标记降低或去除Zm-D9蛋白的Zm-D9活性。转座子标记包括将转座子插入到内源Zm-D9基因中，以降低或去除Zm-D9蛋白表达。"Zm-D9基因"是指编码本发明的Zm-D9蛋白的基因。在该实施方案中，将转座子插入编码Zm-D9蛋白的基因的调控区或编码区中降低或去除Zm-D9蛋白的表达。可使用位于Zm-D9基因的外显子、内含子、5'或3'非翻译序列、启动子或任何其它调控序列中的转座子降低或去除编码Zm-D9蛋白的表达和/或活性。55用于植物中特定基因的转座子标记的方法在本领域众所周知。参见例如Maes等，(1999)7>e"A尸/"W4:90-96;Dharmapuri和Sonti(1999)F￡MSMZcra6/o/.LW.179:53-59;Meissner等，(2000)P/a"f,22:265-274;Phogat等，(2000),Ao"Z.25:57-63;Walbot(2000)O/rr0戸'".P/aWS/o/.2:103國107;Gai等，(2000)M/c/e/c』cZ&"化28:94-96;Fitzmaurice等，(1999)153:1919-1928)。另外，在Bensen等，(1995)尸/a"fCW/7:75-84;Mena等,(1996)Sc/e訓274:1537-1540;和美国专利第5,962,764号中描述了在选定基因中选择Mu插入的TUSC方法，所述文献的每一个均通过引用结合到本文中。2.活性降低的突变植物降低或去除植物中内源基因表达的其它方法在本领域也是已知的，并可类似地应用于本发明。这些方法包括其它形式的"i秀变，例如在反向遗传学方面(采用PCR)使用曱磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和快中子缺失诱变，以鉴定内源基因已缺失的植物系。这些方法的实例参见Ohshima等，(1998)Wra/ogy243:472-481;Okubara等，(1994)137:867-874;和Quesada等，(2000)154:421-436;所述文献的每一个均通过引用结合到本文中。另外，使用变性HPLC或选定PCR产物的选择性内切核酸酶消化筛选化学诱导突变的快速自动化方法TILLING(定向诱导基因组局部突变)也可应用于本发明。参见McCallum等，(2000)Ato.5/o&c/z"o/.18:455-457，该文献通过引用结合到本文中。影响基因表达或干扰编码蛋白功能(Zm-D9活性)的突变在本领域众所周知。在基因外显子中的插入突变通常产生无效突变体。保守残基突变对抑制编码蛋白的Zm-D9活性特别有效。已描述了植物DELLA蛋白中适于以去除或抑制赤霉素信号转导活性为目标的诱变的保守残基。参见例如Itoh,H.,M.Ueguchi-Tanaka等，(2002)尸/a"fCW/14:57-70。这类突变体可根据众所周知的方法分离，不同Zm-D9基因56座中的突变可通过遗传杂交堆积。参见例如Gruis等，(2002)尸/a"fCe〃14:2863-2882。在本发明的另一个实施方案中，由于基因反向和重复基因座的重组，显性突变体可用于触发RNA沉默。参见例如Kusaba等，(2003)尸/a"fCe〃15:1455-1467。本发明包括降低或去除Zm-D9蛋白活性的其它方法。改变或突变植物中的基因组核苷酸序列的其它方法的实例是本领域已知的，包括但不限于使用RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自身互补的RNA:DNA寡核苷酸和引起重组的寡核苷酸酶。这些载体和使用方法是本领域已知的。参见例如美国专利第5,565,350、5,731,181、5/756,325、5,760,012、5,795,972和5,871,984号，所述各专利均通过引用结合到本文中。另参见WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821和Beetham等，(1999)尸wc.Ato/.^cad[/&496:8774-8778;所述各文献均通过引用结合到本文中。.在某些实施方案中，可以将本发明的多核苷酸分子与目标多核苷酸序列的任意组合相堆叠，以生成具有所需性状的植物。本文使用的性状是指来源于特定序列或序列组的表型。例如，本发明的多核苷酸分子可以与编码具有杀虫剂和/或农药活性的多肽的任意其它多核苷酸分子相堆叠例如其它苏云金芽孢杆菌(Sac"/wsf/wn"peR^)毒蛋白(描述于美国专利号5,366,892;5,747,450;5,737,514;5,723,756;5，593，881;和Geiser等，(1986)Ge"e48:109)、凝集素(VanDamme等,(1994)尸/aWA/o/.万Zo/.24:825)、pentin(描述于美国专利号5,981,722)等。产生的组合还可以包括任一个目标多核苷酸分子的多个拷贝。本发明的多核苷酸分子还可以与任何其它基因或基因组合堆叠，以产生具有多种所需性状组合的植物，包括但不限于针对动物钩料所需的性状例如高油基因(例如美国专利号6,232,529);平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专利号5,990,389;5,885,801;5,885，802;和5,703,409);大麦高赖氨酸(Williamson等，(1987)&oc/2em.165:99-106;和WO98/20122)和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等，(1986)丄说o/.C/em.261:6279;Kirihara等，(1988)71:359;和Musumura等，(1989)尸/a^Mo/.历o/.12:123));增加的消化性(例如改性的贝i藏蛋白(2001年11月7日提交的美国申请系列号10/053,410);和硫氧还蛋白(2001年12月3日提交的美国申请系列号10/005,429));所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。本发明的多核苷酸分子还可以与针对以下的所需性状相堆叠疾病或除草剂抗性(例如fiimonisin脱毒基因(美国专利号5,792,931);无毒力和疾病抗性基因(Jones等，(1994)Sc/e"ce266:789;Martin等，(1993)Scz'e打ce262:1432;Mindrinos等，(1994)Ce〃78:1089);产生除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂，例如草铵磷(phosphinothricin)或草铵磷(basta)(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；以及加工或加工产品所需的性状，例如高油(例如美国专利号6,232,529);改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544;WO94/11S16));改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE));和促进聚羟基链烷酸酯(PHA)表达的聚合物或生物塑料(例如美国专利号5.602，321;|3-酮硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等，(1988)/Sa"en'o/.170:5837-5847));其公开内容通过《1用结合到本文中。人们还可以组合本发明的多核苦酸分子和提供农业性状的多核苷酸分子，所述农业性状例如雄性不育(例如参见美国专利号5,583,210)、杆强度(参见美国专利号6,803,498)、开花时间(参见美国专利号6,573,430)或转化技术性状，例如细^>周期调节或基因打靶(例如WO99/61619、WO00/17364和WO99/25821);所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。这些堆叠组合可以通过任意方法来生成，所述方法包括且不限于，通过任意常规的或TopCross方法或遗传转化杂交育种植物。如果通过遗传转化;拔物堆叠序列，则可以在任意时间且以任意次序组合目58标多核普酸序列。例如，可以将包含一个或多个所需性状的转基因植物用作通过随后的转化导入其它性状的靶。在共转化方案中，可以与转化盒的任意组合提供的目标多核苷酸分子同时导入性状。例如，如果将导入2个序列，则2个序列可以包含在分开的转化盒中(反式)或包含在相同转化盒中(顺式)。序列的表达可以由相同启动子或不同启动子驱动。在某些情况下，可能需要导入将抑制目标多核苷酸表达的转化盒。这可以与其它抑制盒或超表达盒的任意組合相组合，以在档_物中生成所需的性状组合。还要认识到，多核苷酸序列可以使用位点-特异性的重组系统在需要的基因組位置堆叠。参见例如099/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855和W099/25853,它们全部通过引用结合到本文中。表型的多种改变中令人感兴趣的包括改变植物的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等。这些结果可通过提供异源产物的表达或增加植物中内源产物的表达来实现。或者，所迷结果可通过提供一种或多种内源产物表达的降低来实现，尤其是植物中的酶或辅因子。这些改变导致转化植物的表型改变。目标基因反映了商品市场，并且是涉及该作物开发的那些人的目标。作物和目标市场改变，并且随着发展中国家打开国际市场，新的作物和技术还将涌现。另外，随着我们对农业性状和特征(例如产量和杂种优势)的理解的增加，用于转化的基因的选择也将相应改变。目标基因的一般分类包括例如涉及信息的那些基因，例如锌指，涉及通讯的那些基因，例如激酶，以及涉及看家的那些基因，例如热激蛋白。更具体的转基因分类例如包括编码重要农业性状、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育、籽粒特征和商品化产物的基因。目标基因一般包括涉及油、淀粉、碳水化合物或营养代谢的那些基因，以及影响谷粒大小、蔗糖载量等的那些基因。在农业上重要的性状，例如油、淀粉和蛋白含量，除使用传统育种方法外还可以经遗传工程改变。修改包括增加油酸、饱和和不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸以及淀粉改性。Hordothionin蛋白改性描述于美国专利号5,703,049、5,885,801、5,885,802和5，990,389,这些专利通过引用结合到本文中。另一个实例是由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白，其描述于美国专利号5,850,016，和得自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，其描述于Williamson等，(1987)/.S/oc/em.165:99-106，这些文献的公开内容通过引用结合到本文中。可通过定点诱变制备编码序列的衍生物，以增加编码多肽中预先选定的氨基酸的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因来源于大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，1996年11月1日提交的美国申请序列号08/740,682和WO98/20133，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。其它蛋白包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，例如来自向日葵种子(Lilley等,(1989)o/『or/dCo"gmwo"F"eg咖A/eP/x^e/wL^'/z'z""ow//w附awFoo<is爿w'淤a/i^editWj^,Applewhite编净耳,(AmericanOilChemistsSociety,Champaign,Illinois),497-502页；所述文献通过引用结合到本文中)；玉米(Pedersen等，(1986)5/o/.Ctem.261:6279;Kirihara等，(1988)71:359;这两个文献均通过引用结合到本文中)；和水稻(Musumura等，(1989)尸/朋fA/o/.5Zo/.12:123,该文献通过引用结合到本文中)。其它在农业上重要的基因编码latex、Floury2、生长因子、种子贮存因子和转录因子。昆虫抗性基因可以编码对引起大量减产的昆虫的抗性，如根虫、毛虫、玉米钻心虫等。这些基因包括苏云金芽胞杆菌毒蛋白基因(美国专利号5,366,892;5,747，450;5,736,514;5,723,756;5,593,881;和Geiser等，(1986)G朋e48:109)。编码疾病抗性性状的基因包括脱毒基因，例如抗伏马毒素的基因(美国专利号5/792，931);无毒力(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones等,(1994)Scze"ce266:789;Martin等，(1993)Scz'e"ce262:1432;和Mindrinos等，(1994)Ce〃78:1089);等等。除草剂抗性性状可包括编码除草剂抗性的基因，所述除草剂用于抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用，尤其是磺酰脲类除草剂(例如含有突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，产生这样的抗性，特别是S4和/或Hra突变)；所述除草剂用于抑制谷氨酰胺合酶活性的作用，例如草胺磷(phosphinothricin)或草胺磷(basta)(例如bar基因)；或草甘膦(例如EPSPS基因和GAT基因；参见例如美国公开号20040082770和WO03/092360);或者本领域所知的其它这样的基因。6w基因编码对除草剂草胺蜂(basta)的抗性，基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。不育基因也可在表达盒中编码，为物理去雄提供了一个备选。以此方式使用的基因的实例包括雄性组织优选的基因和具有雄性不育表型的基因，如QM,其描述于美国专利号5,583,2100。其它基因包括激酶基因和编码对雄性和雌性配子发育均有毒性的化合物的那些基因。籽粒的质量反映出性状，例如油的水平和类型、饱和和不饱和、必需氨基酸的质和量以及纤维素水平。在玉米中，改性的hordothionin蛋白描述于美国专利号5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389。商品化特性也可由一个或多个可增加例如用于乙醇生产的淀粉或提供蛋白表达的基因编码。转化植物的另一个重要的商业用途为生成聚合体和原生质体，例如描述于美国专利号5,602,321。诸如P-酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因(参见Schubert等，(1988)Sa"e〃'o/.170:5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。外源基因产物包括植物酶和产物以及来自其它来源(包括原核生物和其它真核生物)的那些产物。这些产物包括酶、辅因子、激素等。可以增加蛋白水平，尤其是具有改善的氨基酸分布的改性蛋白的水平，以改善植物的应用价值。这通过表达所述具有增强的氨基酸含量的蛋白来实现。61"受试的植物或植物细胞"是指其中相对于目标基因已实现基因改变如转化的植物或植物细胞，或者为由如此改变的植物或细胞遗传并含有该改变的植物或植物细胞。"对照"或"对照植物"或"对照植物细胞"提供测定受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。对照植物或植物细胞可包含例如(a)野生型植物或细胞，即其与起始材料具有相同基因型，用于基因改变，产生受试植物或细胞；(b)与起始材料具有相同基因型但已用无效构建体(即对目标性状没有已知影响的构建体，例如含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)在受试植物或植物细胞的后代中为非转化的分离子的植物或植物细胞；(d)与受试植物或植物细胞遗传相同但未接触会诱导目标基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞，或(e)在不表达目标基因的条件下的受试植物或植物细胞本身。提供以下的实施例是为了阐述，而不是为了限制。实施例1玉米D9基因的分离玉米编码两种DELLA蛋白(矮化植物8，D8，以及矮化植物9,D9),其几个显性突变体已被分离(Winkler和Freeling(1994)P/朋to193:341-348)。尽管已在遗传学上描述了Zm-D9(Winkler和Freeling(1994)尸/朋to193:341-348),但以前还没有在分子水平上表征该基因。在本工作的过程中已分离并分析了两个Zm-D9等位基因。野生型Zm-D9等位基因通过RTPCR由玉米系B73的RNA分离。Zm-D9MUT1等位基因通过PCR由分离自称为D9xB73的GA无反应系的幼苗的基因组DNA分离(图1)。预测Zm-D9MUT1没有内含子，其它报告的DELLA基因也没有。为确保获得Zm-D9MUTl的正确编码序列，通过RT-PCR检验cDNA。Zm-D8位于BIN1.09中，而Zm-D9位于染色体5,BIN5.00的同线性(syntenous)区中(Helentjaris等，(1988)g認"cs118:353-363;Winkler和Freeling(1994)尸/a"to193:341-348;Lawrence等，(2005)P/朋f尸/z"Zo/.138:55-58)。为检验分离的等位基因为Zm-D9形式，启动多个项目，包括BAC文库筛选和通过转基因进行表型重演。Zm-D9被作图至不能与遗传和物理图谱联系在一起的B73BACbacb.pk425.i4，尽管其确实与染色体1和5这二者上的标志连锁。为表明推定的Zm-D9与Zm-D8不同，并确定其染色体定位，进行燕麦附加系的PCR分析(图2;Ananiev等，(1997)尸rac.Ato/,Sc/.94:3524-3529),并通过测序反应产物证实。该分析证实，推定的Zm-D9位置与染色体5相同，与染色体l上的Zm-D8基因座不同。通ii荧光蛋白融合体确定两个玉米DELLA蛋白的亚细月包定位(图3)。推定的Zm-D9定位与Zm-D8的定位类似，并与在核中的定位相一致。已在文件中记录了众多DELLA蛋白在其它植物系统中的核定位(Silverstone等，(2001)尸/朋fCe〃10:155-169;Ogawa等，(2000)基因245:21-29;Fleck和Harberd(2002)尸/朋f32:935-947;Gubler等，(2002)尸/a加尸/yw'o/.129:191-200;Wen和Chang(2002)尸/a"fCe〃14:87-100)。使用以下MultisiteGateway(Invitrogen,USA)改良的曰本烟草中间构建体(Hiei等，1994;Ishida等，1996)包被的鴒颗粒PHP23800、attB4:UBIPRO:attBl:ZM-D8:attB2:AC陽GFPl:NOSTE固:attB3或PHP25355、attB4:UBIPRO:attBl:ZM-D9:attB2:AcGFPl:NOSTERM:attB3。在室温于黑暗中发芽后3天(DAG)，使用BiolisticPDS-1000/He粒子传递系统(BioRad,USA)和650psi裂片用以上构建体粒子轰击HG11黄化苗。在DAG为6天时，用CARV旋转盘共焦显微镜(FryerCompany,USA)目检被轰击的黄化苗。已生产了携带由苜蓿维管系统厚壁组织细胞优选的MS-S2a启动子驱动的玉米DELLAcDNA的拟南芥T2植林。矮化作用(由最严重的至最不严重的)表现为以下的Zm-D8MUT>Zm-D8MPL>Zm-D9MUTl〉Zm-D8-Zm-D9(参见图4)。另外，转基因植林看起来具有如63在图5中可见的改变的花形态。在Zm-D8MUT、Zm-D8MPL、Zm-D9和Zm-D9MUT1中，花丝似乎优先被缩短，使得花粉嚢比柱头短。Zm-D8MUT转基因植林看起来受到最大影响，而Zm-D9和Zm-D8MPL转基因植抹几乎不受影响。GUS和Zm-D8转基因植抹的花丝似乎不受影响。所示的特定Zm-D8MUT转基因系也是雄性不育的，因为其不脱落花粉。在图2-5中公开的结果确证，分离的推定Zm-D9等位基因为Zm-D9的真实等位基因。分离的野生型Zm-D9在玉米染色体5上被编码，与先前对Zm-D9测定的一样(Winkler和Freeling，1994)。当将由Zm-D9编码的蛋白与荧光标记蛋白翻译融合时，其存在于与核一致的亚细胞位置，其它DELLA蛋白也是如此。最有意义的是，携带Zm-D9MUT1等位基因的拟南芥转基因植抹是矮化的，而携带野生型的那些为正常;f朱型。这些结果证实，由矮化的D9突变玉米苗分离的突变DELLA蛋白等位基因实际上负责玉米矮化机制，证实该基因的身份为Zm-D9。还在T2拟南芥植才朱中研究了对表达玉米DELLA蛋白的根结构的作用。所有植物都在18小时白天长度下在ArabiSun车载照明系统中于垂直的方形培一上生长。在发芽后10天时测定每4朱才直4朱的平均根长度和平均根尖数量，结果概述于表l。比对照植物(GUS)相比，携带Zm-D8MPL、Zm-D8MUT和MUT1Zm-D9构建体的植抹的平均根长度明显更短，每林植林的根尖明显更少。因此，与Zm-D8基因一样，Zm-D9基因参与根结构的控制，尤其是根长度和根分枝(以每抹植抹的平均根尖数为证)。表1.表达玉米DELLA蛋白对转基因(T2)拟南芥植林主要生长期1.03的根结构的作用(Boyes等，(2001)尸/a"fCe〃13:1499-1510)。<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>上标字母指示依椐LSD分析于95%置信水平彼此不是显著不同的组别。由4个独立转化事件的4-15个平行测定收集数据。实施例2Zm-D9转化玉米植物和转基因植物的再生用含有与MS-S2A启动子(MS-S2aPRO)有效连接的Zm-D9和选择性标记基因PAT(Wohlleben等，(1988)70:25-37)的质粒轰击得自温室供应植物的未成熟玉米胚，所述选择性标记基因PAT赋予对除草剂双丙氨膦的抗性。或者，选择性标记基因在独立的质粒上提供。如下进行转化。培养基配方如下。草巴组织的制备除掉穗的外壳，并在加0.5%Micro变性剂的30%Clorox漂白液中表面消毒20分钟，用无菌水冲洗2次。切下未成熟胚，并将胚轴侧向下(子叶盘侧向上)放置在560Y培养基上达4小时，每个平^li丈25个胚，然后在2.5cm靶区内对齐，准备轰击。制备含有与在植物中可表达的启动子有效连接的Zm-D9的质粒载体。如下使用CaCl2沉淀法将该质粒DNA与含PAT选择性标记的质粒DNA沉淀在l.lpm(平均直径)钨颗粒上100pl制备的鵠颗粒的水溶液；10pl(1pg)DNA的TrisEDTA緩冲液(l貼总DNA);100pl2.5MCaCl2;和10pl0,1M亚精胺。在多管涡旋器上保持的同时将每种试剂依次加入钨颗粒悬浮液中。对最终混合物短暂超声处理，并使其在恒定涡旋下温育10分钟。在沉淀期后，将各管短暂离心，除去液体，用500ml100%乙醇洗涤，并离心30秒。再次除去液体，向最终鴒颗粒沉淀加入105^1100%乙醇。对于粒子枪轰击，对鴒/DNA颗粒短暂超声处理，将10pl点样在每个巨载体中心，并在轰击前将其干燥约2分钟。样品平板在粒子枪中以水平#4轰击。所有样品都接受650PSI的单次轰击，由每管制备的粒子/DNA取出总共IO个等份试样。在轰击后，将胚保持在560Y培养基上达2天，然后转移至含有3mg/升双丙氨膦的560R选择培养基，并每2周进行1次传代培养。约10周选择后，将选出的抗性愈伤组织克隆转移至288J培养基，以启动植抹再生。在体细胞胚成熟(2-4周)后，将良好发育的体细胞胚转移至萌发培养基，并转移至光照培养室。约7-10天后，将发育的小植林转移至在管中的272V无激素培养基培养7-10天，直至小植4朱长势良好。然后，将植物转移至铺有盆栽土的平板(相当于2.5"盆)衬垫中，放在培养室中生长l周，随后放在温室中再生长l-2周，接着转移至经典的600盆(1.6加仑)中，并生长至成熟。监测植林，并记录林高。MUT1Zm-D9林高在该阶段降低约60%。轰击培养基(560Y)含有4.0g/1N6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson氏维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1盐酸硫胺素、120.0g/1蔗糖、1.0mg/12,4-D和2.88g/1L-脯氨酸(用KOH调整至pH5.8后用D-IH20定容)；2.0g/1脱乙酰吉兰糖胶(Gelrite)(用D-IH20定容后加入)；和8.5mg/l硝酸银(在培养基灭菌并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)含有4.0g/1N6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson氏维生素混合物(IOOOXSIGMA-1511)、0.5mg/1盐酸硫胺素、30.0g/1蔗糖和2.0mg/12,4-D(用KOH调整至pH5.8后用D-IH20定容)；3.0g/1脱乙酰吉兰糖胶(用D-IH20定容后加入)；以及0.85mg/1硝酸银和3.0mg/1双丙氨膦(二者均在培养基灭菌并冷却至室温后加66入)。植林再生培养基(288J)含有4.3g/1MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/IMS维生素母液(0.100g烟酸、0.02g/1盐酸硫胺素、0.10g/1盐酸吡喷醇和0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20定容)(Murashige和Skoog(1962)尸/2少w'o/.15:473)、100mg/1肌醇、0.5mg/1玉米素、60g/1蔗糖和1.0ml/10.1mM脱落酸(调整至pH5.6后用精制的D-IH20定容)；3.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(用D-IH20定容后加入)；和1.0mg/1吲哚乙酸和3.0mg/1双丙氨膦(在培养基灭菌并冷却至60°C后加入)。无激素培养基(272V)含有4.3g/1MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/1MS维生素母液(O.IOOg/1烟酸、0.02g/1盐酸硫胺素、0.10g/1盐酸吡哆醇和0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20定容)、0.1g/1肌醇和40.0g/1蔗糖(在调整至pH5.6后用精制的D-IH20定容)；和6g/1细菌琼脂(在用精制的D-IH20定容后加入)，灭菌并冷却至60°C。轰击和培养基轰击培养基(560Y)含有4.0g/1N6基础盐(SIGMA01416)、1.0ml/1Eriksson氏维生素混合物(l000XSIGMA-1511)、0.5mg/1盐酸硫胺素、120.0g/1蔗糖、1.0mg/12，4-D和2.88g/1L-脯氨酸(用KOH调整至pH5.8后用D-IH20定容)；2.0g/1脱乙酰吉兰糖胶(用D-IH20定容后加入)；和8.5mg/1硝酸银(在培养基灭菌并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)含有4.0g/1N6基础盐(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson氏维生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1盐酸硫胺素、30.0g/1蔗糖和2.0mg/12,4-D(用KOH调整至pH5.8后用D-IH20定容)；3.0g/l脱乙酰吉兰糖胶(用D-IH20定容后加入)；和0.85mg/l硝酸银和3.0mg/1双丙氨膦(二者均在灭菌培养基并冷却至室温后加入)。植林再生培养基(288J)含有4.3g/1MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/IMS维生素母液(0.100g烟酸、0.02g/1盐酸硫胺素、0.10g/1盐酸吡p多醇和0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20定容)(Murashige和Skoog(1962)尸/戸o/.15:473)、100mg/1肌醇、0.5mg/1玉米素、60g/1蔗糖和1.0ml/1的0.1mM脱落酸(在调整至pH5.6后用D-I仏0定容)；3.0g/1脱乙酰吉兰糖胶(用D-IH20定容后加入)；和1.0mg/1吲哚乙酸和3.0mg/1双丙氨膦(在培养基灭菌并冷却至60。C后加入)。无激素培养基(272V)含有4.3g/1MS盐(GIBCO11117-074)、5.0ml/1MS维生素母液(O.IOOg/1烟酸、0.02g/1盐酸硫胺素、0.10g/1盐酸吡哆醇和0.40g/1甘氨酸，用精制的D-IH20定容)、0.1g/1肌醇和40.0g/1蔗糖(在调节pH至5.6后用精制的D-IH20定容)；和6g/1细菌-琼脂(在用精制的D-IH20定容后加入)，灭菌并冷却至60。C。实施例3土壤杆菌介导的含Zm-D9的玉米转化和转化植物的再生对于用一种或多种本发明的Zm-D9核苷酸多核苷酸分子进行的土壤杆菌(^gratoc^7MW)介导的玉米转化，使用Zhao的方法(美国专利号5,981,840和PCT专利公布号W098/32326;其内容在此引入作为参考)。简而言之，由玉米分离未成熟胚，使所述胚与土壤杆菌悬浮液接触，其中该细菌能够将目标Zm-D9多核苷酸转移至至少1个未成熟胚的至少l个细胞(步骤l:感染步骤)。在该步骤中，将未成熟胚浸入土i裏杆菌悬浮液中开始接种。将胚与土壤杆菌共培养一段时间(步骤2:共培养步骤)。在感染步骤后将未成熟胚在固体培养基上培养。在此共培养阶段之后，设想了任选的"休眠"步骤。在该休眠步骤中，在至少1种已知抑制土i裏杆菌生长的抗生素存在下温育胚，而且不加入4直物转化体的选择剂(步骤3:休眠步骤)。将未成熟胚在具有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，用于土壤杆菌的消除和感染细胞的休眠期。接着，将接种的胚在含有选择剂的培养基上培养，并回收生长的转化愈伤组织(步骤4:选择步骤)。将未成熟胚在具有选择剂的固体培养基上培养，使转化细胞产生选择性生长。然后愈伤组织再生为植抹(步骤5:再生步骤)，并将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基68上培养，以再生植林。实施例4用Zm-D9转化大豆胚和转化植物的再生培养条件将大豆胚发生悬浮培养物(栽培变种Jack)保持在150ipm、26°C旋转摇床上的35ml液体培养基SB196(参见下文配方)中，按照16:8小时昼/夜光周期冷白荧光灯照明，光强度为60-85^E/m2/s。将约35mg组织接种入35ml新鲜液体SB196中，每7天至2周将培养物传代培养1次(优选的传代培养间隔为每7天1次)。用在以下实施例中描述的质粒和DNA片段通过粒子^r轰击方法转化大豆胚发生悬浮培养物(Klein等，(1987)327:70)。启动大豆胚发生悬浮培养每月2次启动大豆培养，每次启动之间为5-7天。在种植后45-55天由可用的大豆植;昧拣选具有未成熟种子的豆荚，除去它们的外壳后置于品红色无菌箱中。在含有1滴象牙皂的5%Clorox溶液(95ml高压蒸汽灭菌的蒸馏水加5mlClorox和1滴皂)中振摇15分钟消毒大豆种子。充分混合。使用2瓶1升的无菌蒸馏水冲洗种子，将小于4mm的那些种子置于单独的显微镜载玻片上。切下种子的小末端，将子叶压出种皮。将子叶转移至含有SB1培养基的平板(每个平板放25-30个子叶)。用纤维带包裏平板，并储存8周。然后，切下次生胚，并置于SB196液体培养基中达7天。准备轰击用DNA使用含有目标基因和选择性标记基因的完整质粒或DNA质粒片段进行轰击。常规制备用于轰击的质粒DNA，并使用在PromegaProtocolsandApplicationsGuide,第二版(第106页)中描述的方法纯化。通过凝胶分离双重消化的质粒获得携带Zm-D9多核苷酸的质粒片69段。在每种情况下，在适于目标质粒的0.5ml特定酶混合物中消化100吗质粒DNA。获得的DNA片段在1%SeaPlaqueGTG琼脂糖(BioWhitakerMolecularApplications)上进行凝胶电泳分离，由琼脂糖凝胶上切下含有Zm-D9多核苷酸的DNA片段。使用GELase消化酶按照生产商的方案由琼脂糖纯化DNA。将含有3mg金颗粒(3mg金)的50pl等份的无菌蒸馏水加入5pl的1pg/nlDNA溶液(如上所述制备的完整质粒或DNA片段)、50pl2.5MCaCl2和20pl0.1M亚精胺中。将混合物以涡旋振荡器的水平3振摇3分钟，并在台式离心机中离心10秒。在用400pl100%乙醇洗涤后，超声处理将颗粒物悬浮于40pl100%乙醇中。将5plDNA悬浮液分配到BiolisticPDS1000/HE设备盘的每个飞行盘。每5pl等份试样^^有每次轰击(即每盘)约0.375mg金。组织制备和用DNA轰击将约150-200mg的7天龄胚悬浮培养物置于空的无菌60x15mm培养皿中，培养亚用塑料网覆盖。以每个平板1或2次射击来轰击组织，膜破裂压力设置为1100PSI,弹腔祐:抽空至27-28英寸汞柱真空度。将组织置于距保留/阻挡片约3.5英寸处。转化胚的选择使用潮霉素(当使用潮霉素磷酸转移酶HPT基因作为选择性标记时)或氯磺隆(当使用乙酰乳酸合酶ALS基因作为选择性标记时)选择转化胚。潮霉素(HPT、选择在轰击后，将组织置于新鲜SB196培养基中，并如上所述培养。在轰击后6天，用含有30mg/L潮霉素选择剂的新鲜SB196更换SB196。每周更新选择培养基。在选择后4-6周，可观察到由未转化的坏死胚发生丛生长出绿色转化组织。取出分离的绿色组织，并接种70入多孔平板中，以产生新的、克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。氯磺隆(ALS、选择在轰击后，将组织分配在含有新鲜SB196培养基的2个长颈瓶中，并如上所述培养。在轰击后6-7天，用含有100ng/ml氯磺隆选择剂的新鲜SB196更换SB196。每周更新选择培养基。在选择后4-6周，可观察到由未转化的坏死胚发生丛生长出绿色转化組织。取出分离的绿色组织，并接种入含有SB196的多孔平板中，以产生新的、克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。大豆体细胞胚再生为植抹为了由胚发生悬浮培养物获得全抹，必须再生组织。胚成熟在冷白荧光(Phillips冷白EconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(PhillipsF40Agro)灯泡(40瓦)下，以16:8小时光周期和90-120uE/m2s光强度，将胚在SB196中于26。C培养4-6周。此后，将胚丛移至固体琼脂培养基SB166达1-2周。然后将各丛在培养基SB103中传代培养达3周。胚脱水和发芽将成熟的单个胚置于空的小培养皿(35xl0mm)中约4-7天使其脱水。用纤维带密封平板(产生小湿润腔)。将脱水的胚种植在SB71-4培养基中，在该培养基中，使它们在上述相同的培养条件下发芽。由发芽培养基取出发芽的小植4朱，并用水彻底冲洗，然后种植在24-孔浅盘(24-ce11packtray)的Redi-Earth中，用透明的塑料罩覆盖。在2周后，移开罩，植林经过耐寒锻炼l周。如果小植林看起来强壮了，则将它们移植到IO，，盆的Redi-Earth，每个盆至多3棵小植4朱。在10-16周后，收获成熟种子，^争裂并分析蛋白。培养基配方SB196-FN低盐液体增殖培养基(每升)-MSFeEDTA-100x原液110mlMS硫酸盐-100x原液210mlFN低盐囟化物-100x原液310mlFN低盐P、B、Mo-100x原液410mlB5维生素(lml/L)1.0ml2,4-D(10mg/L终浓度)1.0mlKN032.83gm(NH4)2S040.463gm天冬酰胺1.0gm蔗糖(1%)10gmpH5.8FN低盐原液母液#1MSFeEDTA100x原液Na2EDTA*FeS04-7H201000ml500ml3.724g1.862g2.784g1.392g*首先加入，在搅拌的同时溶于黑色瓶中2MS硫酸盐100x原液MgS04-7H2037.0g18.5gMnS04-H201.69g0.845gZnS04-7H200.86g0.43gCuS04-5H200.0025g0.00125g3FN低盐面化物lOOx原液CaCl2-2H2030.0g15.0gKI0.083g0.0715gCoCl2-6H200.0025g0.00125g4FN低盐P、B、Mol00x原液KH2P0418.5gH3B030.62gNa2Mo04-2H200.025g9.25g0.31g0.0125gSB1固体培养基(每升)含有1包MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066);1mlB5维生素1000X母液；31.5g蔑糖；2ml2,4-D(20mg/L终浓度)；pH5.7;和8gTC琼脂。SB166固体培养基(每升)含有1包MS盐(GibcoZBRL-目录号11117-066);1mlB5维生素1000X母液；60g麦芽糖；750mgMgCl2六水合物；5g活性炭；pH5.7;和2g脱乙酰吉兰糖胶。SB103固体培养基(每升)含有1包MS盐(Gibco/BRL-目录号11117-066);1mlB5维生素1000X母液；60g麦芽糖；750mgMgCl2六水合物；pH5.7;和2g脱乙酰吉兰糖胶。SB71-4固体培养基(每升)含有1瓶Gamborg氏B5盐w/庶糖(Gibco/BRL-目录号21153-036);pH5.7;和5gTC琼脂。2,4-D原液由浓度为1mg/ml的Phytotech目录号D295预制备获3曰付。以等份试样储存于-20。C的B5维生素原液(每100ml)^^有10g肌醇；100mg烟酸；100mg盐酸吡p多醇；和lg碌u胺素。如果该溶液溶解得不够快，则经加热搅拌器施加低水平热量。氯磺隆母液含有1mg/ml的0.01N氢氧化铵溶液。用Zm-D9进行向日葵分生组织转化和转化植物的再生用含有与MS-S2A启动子有效连接的本发明的Zm-D9多核苷酸分子的表达盒如下转化向日葵分生组织(另参见欧洲专利号EP0486233,该专利在此引入作为参考，和Malone-Schoneberg等，(l"4)尸/a^Scze"ce103:199-207)。使用1台麦穗脱粒机使成熟的向日葵种子(Hetom/wsa朋,sL.)脱壳。用每50ml溶液加入2滴吐温20的20%实施例573Clorox漂白溶液将种子表面消毒30分钟。用无菌蒸馏水冲洗种子两次。通过修改的Schrammeijer等，(Schrammeijer等，(1990)尸/朋fCe//丑W.9:55-60)所述程序制备裂开的胚轴外植体。在表面消毒程序后将种子浸入蒸馏水中达60分钟。然后折断每粒种子的子叶，在胚轴平面得到干净断面。切下根尖后，将外植体在原叶之间纵向对分。将两个半切面的切割面向上放置在GBA培养基上，GBA培养基由Murashige禾口Skoog矿物元素(Murashige等，(1962)尸/z;wo/.尸/a"[15:473-497)、Shepard氏维生素添加剂(Shepard(1980)载于五w^geWrec/2wz々wes/orAeG^we"c/附p厂ove附ewo/Oo/w(UniversityofMinnesotaPress,St.Paul,Minnesota)、40mg/1硫酸^l^票呤、30g/1蔗糖、0.5mg/16-千基-氨基。票呤(BAP)、0.25mg/1吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/1赤霉酸(GA3),pH5.6和8g/l植物琼脂组成。在土壤杆菌处理前，对外植体进行微弹轰击(Bidney等，(1992)f/aWMo/.说o/.18:301-313)。将30-40个外植体以环状放置在60x20mm平板中心进行该处理。将约4.7mg的1.8mm鵠微弹重悬浮在25ml无菌TE緩冲液(lOmMTrisHCl,1mMEDTA,pH8.0)中，每次轰击使用1.5ml等份试样。每块平板在PDS1000⑧颗粒加速器中经置于样品之上2cm的150mmnytex屏轰击2次。在所有转化实验中都使用卸曱根瘤土壤杆菌菌林EHA105。按照Holsters等，(1978)Mo/.G饥Gew",163:181-187所述的冻融法将含有表达盒的二元质粒载体导入土壤杆菌菌林EHA105中，所迷表达盒包含与所述启动子有效连接的Zm-D9多核苦酸分子。该质粒还包含卡那霉素选择性标记基因(即"^/T)。用于植物转化实验的细菌在液体YEP培养基(10g/l酵母提取物、10g/l细菌蛋白胨和5g/lNaCl，pH7.0)中过夜培养(28。C和100RPM连续搅拌)，所述液体YEP培养基含有维持细菌菌林和二元质粒所需的合适抗生素。悬浮液在OD6oo达到约0.4-0.8时使用。沉淀土壤杆菌细胞，并用含有12.5mMMESpH5.7、1g/lNH4Cl和O.3g/lMgS04的接种培养基重悬浮至最终OD6oo为0.5。将轰击过的新鲜外植体置于土壤杆菌悬浮液中，混合，并静置30分钟。然后将外植体转移到GBA培养基，并切面向下于26。C以18小时白昼共栽培。共栽培3天后，将外植体转移到补加250mg/l头孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素的374B(没有生长调控剂且蔗糖水平降低为P/。的GBA培养基)中。将外植体选择培养2-5周，然后转移到不含卡那霉素的新鲜374B培养基中继续发育l到2周。将具有分化的、耐抗生素的、尚未产生适于切除的枝条的生长区的外植体转移到含250mg/1头孢噻肟的GBA培养基中，用以进行第二次3天的植物激素处理。通过ELISA测定来自绿色的、抗卡那霉素的枝条的叶样品的NPTII存在情况，并通过测定Zm-D9活性测定转基因表达的存在情况。将NPTII阳性枝条嫁接到Pionee^杂种6440体外生长向日葵实生砧。使表面消毒的种子在48-0培养基(半浓Murashige和Skoog盐、0.5%蔗糖、0.3%脱乙酰吉兰糖胶，pH5.6)中萌发，并在针对外才直体培养所描述的条件下生长。去掉幼苗上部，在下胚轴上制作1cm垂直切片，然后将转化的枝条插入切口。整个区域用石蜡膜(parafilm)包裹，以保护枝条。可在1周体外培养后将嫁接的植林转移到土壤中。将在土壤中的移植体保持在高湿度条件下，然后对温室环境緩慢适应。在温室中成熟的To植林(亲本代)的转化部分通过叶提取物的NPTIIELISA来鉴定。实施例6Zm-D9的表达和表征表达谱表明，由发育观点看，必显示出对成熟的分化细胞的偏好性，尤其是那些与杆结合的分化细胞，而必与分裂细胞或分生组织细胞更相关(图10)。例如，必在分生组织、杆的分裂区(节间)和过渡区中的表达明显更高，而必和必在节间的成熟区中大致平等地表达。必和必的最高表达水平分别在穗和维管束中。一般而言，维管器官/75组织具有的两种基因的表达均高于非维管器官/组织的表达。这与在双子叶植物维管系统之中和周围的DELLAmRNA和蛋白的存在情况相一致(Haywood等，(2005)P/朋fJowma/42:49-68;Isradsson等，(2005)P/aWJowma/44:494-504),提示在双子叶植物和单子叶植物之间定位是保守的。为进一步剖析D9等位基因的性质，建立结构域交换构建体，并将其转化入拟南芥中。在必和入门克隆之间交换5个遗传区(图11),使用获得的嵌合入门克隆建立S2APRO::DELLA中间体和共整合载体，如对天然玉米等位基因所述用于转化。在Tl代进行结构域交换转基因植林的形态测量分析(图14)。得自DP的E600K突变对于矮化和更早开花的表型变化是必须的并足够的。必E600K和DPK597E产生的形态影响与它们的主链等位基因不同(图14)。最值得注意的差异是片朱高、长角果长度、至开花的天数以及开花时的莲座叶的数量。对于全部4种情况，必(E600K)4i^朱均显示出类似于Z^的特征。平均看来，(E600K)嵌合体产生的才直林的茎和长角果最短，在IO个构建体中的任一个开花时的莲座叶都最少。相反，D9K597E的长角果长度、至开花的天数和开花时的莲座叶数量排在第二高或笫三高。没有其它的多态性展现出清晰的高度或开花时间改变模式。该突变和其它突变因此在玉米林型向籽粒型高产能构型改变方面具有特定用途。玉米DELLA矮化等位基因被发现加速拟南芥开花。DSA/尸丄和DSA^7r将开花移前约6天(图12)。引人注目的是，D9加速开花达11天(26.5%)。该作用似乎与赤霉素-不敏感性有关联，因为必和必转基因植林的开花时间与GUS对照没有显著不同。基因使TOGS3xGaspeFlint开花延后(图13),而必导致开花提前(使用地面上的所有节点作为成熟转变的基础；图12)。在必或DSAf尸丄转基因玉米中还没有观察到开花时间改变。选择MS-S2A启动子，以驱动5个玉米DELLA等位基因在转基因拟南芥中的表达。水稻肌动蛋白1启动子用于驱动这些等位基因在提早的转基因拟南芥组别中表达。这些转化体的Tl植物没有表现出任何可见的表型，提示水稻肌动蛋白1启动子在适宜组织中不表达DELLA蛋白。已知该结果、必和必的玉米表达诿(图10)以及Haywood等人的著作((2005)P/aW/owmo/42:49-68)表明DELLA蛋白和mRNA在3个物种中的维管系统关联，选择MS-S2A启动子，用于在拟南芥和玉米中进行玉米DELLA表达。选择转基因方法，以便可以直接进行玉米等位基因比较，这应当不会被启动子依赖性作用曲解。这些数据确证了组织特异性启动子作为改变植物构型的策略的用途。实施例7Zm-D9变体A.不改变编码的氨基酸序列的Zm-D9的变体核苷酸序列(SEQIDNO:1、3、4或6)在SEQIDNO:l、3、4或6中所示的Zm-D9核苷酸序列用于产生变体核普酸序列，在与SEQIDNO:1、3、4或6的起始未改变的ORF核苷酸序列相比较时，所述变体核苷酸序列具有的可读框的核苷酸序列具有约70%、76%、81%、86%、92%和97%的核苦酸序列同一性。这些功能性变体使用标准密码子表产生。尽管变体的核苦酸序列^L改变，但由可读框编码的氨基酸序列没有改变。B.Zm-D9的变体氨基酸序列产生Zw-D9的变体氨基酸序列。在该实施例中，改变一个氨基酸。具体地说，考察在SEQIDNO:2或5中陈述的氨基酸序列，以确定合适的氨基酸改变。通过参考(与多个物种的另一个直系同源物和其它基因家族成员的)蛋白比对对要改变的氨基酸进行选择。参见图7。选定的氨基酸被认为并未处于高选择压力下(非高度保守的)，而是容易>&具有相似化学特征(即类似的功能性侧链)的氨基酸取代。使用在77图7中所示的蛋白比对可以改变适宜的M酸。一旦鉴定出目标_酸，就实施在实施例6A中积克述的方法。使用该方法产生与SEQIDNO:1、3、4或6具有约70%、75%、81%、86%、92%和97%的核酸序列同一性的变体。C.Zm-D9的其它变体氨基酸序列在本实施例中，产生相对于参比蛋白序列具有82%、87%、92%和97%的同一性的人工蛋白序列。此后一项工作需要由图7中所示的比对鉴定保守区和可变区，然后明智地使用氨基酸取代表。这部分将在下文更详细地论述。很大程度上基于Zm-D9蛋白或其它DELLA蛋白中的保守区决定要改变的氨基酸序列。参见图7。基于序列比对，可能要改变的Zm-D9蛋白的多个区以小写字母表示，而保守区以大写字母表示。一般认为可在以下的保守区进行保守取代，而不改变功能。另外，技术人员应理解，本发明的Zm-D9氨基酸序列的功能变体可在保守区中具有少数非保守的氛基酸改变。保守区存在于SEQIDNO:2的约氨基酸37-109、224-504、528-625之间。非保守区为SEQIDNO:2的约氨基酸l-36、110-223、505-527。然后建立以80-85%、85-90%、90-95%和95-100%同一性的区间不同于原始序列的人工蛋白序列。以这些区间的中点为目标，自由度加上或减去例如1%。氨基酸取代可通过定制Perl脚本实现。取代表在下表2中提供。表2.取代表<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>首先鉴定蛋白中不应被改变的任何保守氨基酸，并被"标明为"与取代隔离。起始甲硫氨酸毫无疑问将被自动加入该列表。然后进行改变。H、C和P在任何情况下都不被改变。首先对异亮氨酸进行改变，从N末端扫描到C末端。然后是亮氨酸，并沿着列表向下类推，直到达到合适的耙点。可实施中间数取代，以便不引起反向改变。列表被标序为1-17,所以根据需要以许多异亮氨酸改变开始，然后是亮氨酸，并以此类推，直到曱硫氨酸。显然，以此方式许多氨基酸不需要被改变。L、I和V涉及两个可选择的最佳取代的50:50取代。变体氨基酸序列被记录为输出。用Perl脚本计算同一性百分率。使用该方法，产生与SEQIDNO:1、3、4或6的起始未改变的ORF核苷酸序列具有约82%、87%、92%和97%的氨基酸同一性的Zm-D9蛋白变体。冠词"一个，，和"一种"在本文用于指1个或1个以上(即至少1个)该冠词的语法宾语。作为实例，"一种因素"意指1个或1个以上的因素。在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都表现出本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都通过引用结合到本文中，其程度如同每个单独的出版物或专利申请^皮具体地和单独地指出通过引用结合到本文中一样。尽管为了清楚理解的目的而通过阐述和实施例相当详细地描述了前述发明，但是很显然，可在随附权利要求的范围内实施某些变更和修改。实施例8Zm-D9在玉米中的表达和表征在玉米(T0代)中测试结构域交换构建体(参见实施例6)d9E600k和D9K597E,以便确定它们对抹高、叶数量、至出穗的天数、至首次花粉脱落的天数和至授粉的天数的影响。将d9E600k和D9K597E的表型数据与使用MUT1Zm-D9等位基因和Zm-D8MPL等位基因的数据对比。在所有情况下，S2a启动子均用于驱动各自的结构基因表达。载体构建详述于实施例6。相比于在温室中同时生长的相同基因型的未转化玉米植林，D9K597E的林高未被改变。同样，D9K597E的叶数量、至出穗的天数、至首次花粉脱落的天数和至授粉的天数与未转化植物类似。MUT1D9和d9E600K转基因植林相比于D9K597E平均具有1个额外的叶。d9E600K和MUT1D9转基因植林相比于D9K597E高度显著降低(分别降低50。/o和30。/())。另一方面，d9E600k和MUT1D9在出穗、花粉脱落和授粉日期方面相比于D9K597E延迟。花粉脱落延迟多达14天(对于MUT1D9)和10天(对于d9E600k)。授粉延迟与这些转基因植类似。另外，这些转基因植林相比于D980K597E表现出约1个额外的节。这些数据在高度方面显示出与拟南芥类似的模式(较短的茎)，但显示出相反的成熟变化表型，其中MUT1D9和d9E600k的成熟延迟。这些数据证实了在拟南芥和玉米这二者中这种4^型和开花时间变化的多态性的意义。MUT1D9和d9E600k突变在玉米的籽粒型高产能构型中对改变备选植株构型的抹型、节数或成熟度可具有特定用途。权利要求1.一种分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列(a)包含SEQIDNO2或5的氨基酸序列；(b)与SEQIDNO2具有至少93％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有Zm-D9活性；(c)与SEQIDNO5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有MUT1Zm-D9活性；(d)由在严格条件下与SEQIDNO1或3的互补物杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述严格条件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中于37℃杂交，并在0.1XSSC中于60℃至65℃洗涤；(e)由在严格条件下与SEQIDNO4或6的互补物杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述严格条件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中于37℃杂交，并在0.1XSSC中于60℃至65℃洗涤；(f)含有SEQIDNO2的至少124个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述多肽保持Zm-D9活性；和(g)包含SEQIDNO5的至少124个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述多肽保持MUT1Zm-D9活性。2.—种分离的多核苷酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列(a)包含SEQIDNO:l、3、4或6的核苷酸序列；(b)编码包含SEQIDNO:2或5的氨基酸序列的核苷酸序列；歹'],其中所述严格条件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37°C杂交，并在0.1XSSC中于60°C至65°C洗涤；(d)与SEQIDNO:1或3具有至少92%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有Zm-D9活性的多肽；(e)含有SEQIDNO:1或3的至少698个连续核苷酸或其互补物的核苷酸序列；(f)编码的氩基酸序列与SEQIDNO:2具有至少93。/。序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有Zm-D9活性的多肽；和(g)与SEQIDNO:4或6具有至少96%序列同一性的核苷酸序歹"其中所述多核苷酸分子编码具有MUT1Zm-D9活性的多肽；(h)含有SEQIDNO:4或6的至少395个连续核苷酸或其互补物的核苷酸序列；和(i)编码的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少95%序列同一性的核苦酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有MUT1Zm-D9活性的多肽。3.—种包含权利要求2的多核苷酸分子的表达盒。4.权利要求3的表达盒，其中所述多核苷酸分子与在植物中驱动表达的启动子有效连接。5.—种含有权利要求3或4的表达盒的非人宿主细胞。6.权利要求5的宿主细力包，其中所述宿主细胞为植物细胞、细菌细胞或真菌细胞。7.—种植物，其含有与在植物中驱动表达的启动子有效连接的多核苦酸分子，其中所述多核苦酸分子含有选自以下的核苷酸序列(a)含有SEQIDNO:1、3、4或6的核苷酸序列；(b)编码含有SEQIDNO:2或5的氨基酸序列的核苷酸序列；列，其中所述严格条件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37°C杂交，并在0.1XSSC中于60。C至65。C洗涤；(d)与SEQIDNO:1或3具有至少92%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有Zm-D9活性的多肽；(e)含有SEQIDNO:1或3的至少698个连续核苷酸或其互补物的核苷酸序列；(f)编码的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少93%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核普酸分子编码具有Zm-D9活性的多肽；和(g)与SEQIDNO:4或6具有至少96%序列同一性的核苷酸序歹'J，其中所述多核苷酸分子编码具有MUT1Zm-D9活性的多肽；(h)^^有SEQIDNO:4或6的至少395个连续核苷酸或其互补物的核苷酸序列；和(i)编码的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有MUT1Zm-D9活性的多肽。8.权利要求7的植物，其中所述植物为细胞。9.权利要求7的植物，其中所述植物为单子叶植物。10.权利要求9的植物，其中所述单子叶植物选自玉米、小麦、水稻、高粱、黑麦、黍和大麦。11.权利要求7的植物，其中所述植物为双子叶植物。12.权利要求11的植物，其中所述双子叶植物选自拟南芥、大豆、向曰葵、红花、苜蓿、芸苔、棉花和花生。13.权利要求7-12中任一项的植物，其中所述多核苷酸分子^C稳定地掺入植物的基因组中。14.权利要求13的植物，其中所述植物为种子。15.—种增加^i物中的多肽水平的方法，该方法包括将含有选自以下的核苷酸序列的多核苷酸分子导入所述植物中(a)包含SEQIDNO:l、3、4或6的核普酸序列；(b)编码包含SEQIDNO:2或5的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)在严格条件下与(a)的核苷酸序列的互补物杂交的核苷酸序歹'J,其中所述严格条件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37。C杂交，并在0.1XSSC中于60。C至65。C洗涤；(d)与SEQIDNO:1或3具有至少92%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有Zm-D9活性的多肽；(e)^^有SEQIDNO:1或3的至少698个连续核苷酸或其互补物的核苷酸序列；(f)编码的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少93%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有Zm-D9活性的多肽；和(g)与SEQIDNO:4或6具有至少96%序列同一性的核苷酸序歹'J，其中所述多核苷酸分子编码具有MUT1Zm-D9活性的多肽；(h)含有SEQIDNO:4或6的至少395个连续核苷酸或其互补物的核普酸序列；和(i)编码的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有MUT1Zm-D9活性的多肽。16.—种用于调节植物中的多肽水平的方法，该方法包括将含有选自以下的核苷酸序列的多核苷酸分子导入所迷植物中(a)包含SEQIDNO:l、3、4或6的核苦酸序列；(b)编码包含SEQIDNO:2或5的氨基酸序列的核普酸序列；歹寸，其中所述严格条件包括在50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37。C杂交，并在0.1XSSC中于60。C至65。C洗涤；(d)与SEQIDNO:1或3具有至少92%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有Zm-D9活性的多肽；(e)^^有SEQIDNO:1或3的至少698个连续核苷酸或其互补物的核苷酸序列；(f)编码的M酸序列与SEQIDNO:2具有至少93%序列同一性的核苷酸序列，其中所迷多核苷酸分子编码具有Zm-D9活性的多肽；和(g)与SEQIDNO:4或6具有至少96%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有MUT1Zm-D9活性的多肽；(h)含有SEQIDNO:4或6的至少395个连续核苷酸或其互补物的核苷酸序列；和(i)编码的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有MUT1Zm-D9活性的多肽。17.权利要求15或16的方法，其中所述多核苷酸分子稳定地掺入植物的基因组中。18.权利要求15-17中任一项的方法，其中所述植物为植物细胞。19.权利要求15-17中任一项的方法，其中所迷植物为双子叶植物。20.权利要求19的方法，其中所述双子叶植物选自拟南芥、大豆、向曰葵、红花、苜蓿、芸苔、棉花和花生。21.权利要求15-17中任一项的方法，其中所述植物为单子叶植物。22.权利要求21的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、小麦、水稻、高粱、黑麦、黍和大麦。23.权利要求15的任一项的方法，其中所述植物为种子。24.—种用于改变植物生长的方法，所述方法包括用多核苷酸构建体转化生物，所述多核苷酸构建体含有与能够在所述生物中驱动所述核香酸序列表达的启动子有效连接的核苷酸序列，其中所述核苦酸序列选自(a)包含SEQIDNO:l、3、4或6的核苷酸序列；(b)编码包含SEQIDNO:2或5的氨基酸序列的核苷酸序列；列，其中所述严格条件包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中于37°C杂交，并在0.1XSSC中于60。C至65。C洗涤；(d)与SEQIDNO:1或3具有至少92%序列同一性的核普酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有Zm-D9活性的多肽；(e)含有SEQIDNO:1或3的至少698个连续核苷酸或其互补物的核苷酸序列；(f)编码的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少93%序列同一性的核苦酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有Zm-D9活性的多肽；和(g)与SEQIDNO:4或6具有至少96%序列同一性的核普酸序列，其中所述多核普酸分子编码具有MUT1Zm-D9活性的多肽；(h)含有SEQIDNO:4或6的至少395个连续核苷酸或其互补物的核苦酸序列；和(i)编码的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少95%序列同一性的核普酸序列，其中所述多核苷酸分子编码具有MUT1Zm-D9活性的多肽。25.权利要求24的方法，其中所述核苷酸序列与所述启动子有效连接以产生反义转录物。26.权利要求24的方法，其中相对于未转化的植物，所述植物的高度降低。27.权利要求24的方法，其中相对于未转化的植物，所述植物的高度增加。28.权利要求27的方法，其中相对于未转化的植物，所述植物的根结构改变。29.权利要求24的方法，其中所述植物为单子叶植物。30.权利要求29的方法，其中所述单子叶植物选自玉米、小麦、水稻、高粱、黑麦、黍和大麦。31.权利要求24的方法，其中所述植物为双子叶植物。32.权利要求31的方法，其中所述双子叶植物选自拟南芥、大豆、向曰葵、红花、苜蓿、芸苔、棉花和花生。全文摘要本发明提供编码玉米D9基因的突变等位基因和野生型等位基因的分离的多核苷酸分子。本发明进一步提供改变植物生长的方法，包括这些分离的多核苷酸分子、分离的多肽和转化的植物、种子和细胞的用途。文档编号C07K14/415GK101479294SQ200780022452公开日2009年7月8日申请日期2007年4月18日优先权日2006年4月19日发明者A·G·劳,D·T·托姆斯,S·拉维特,S·昆杜申请人:先锋高级育种国际公司