一种检测rs9263726等位基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和基因诊断领域，具体涉及一种检测rs9263726等位基因的方法。
【背景技术】
[0002]当多种原因引起血液中尿酸浓度升高、细胞外液的尿酸盐呈现超饱和时，就会发生高尿酸血症，若尿酸盐在机体组织中沉积造成进一步损害，则转变为痛风，表现为患者关节活动受限、热、痛、肿，伴有关节畸形、结节性痛风结石甚至肾脏病变，给痛风患者带来极大痛苦(Smith et al.,2011)o高尿酸血症和原发性痛风的发病率呈逐年上升趋势。据统计，我国的高尿酸血症患者人数已达1.2亿，其中痛风患者超过7500万人，并且正以每年9.7%的年增长率迅速增加，呈现出年轻化趋势，痛风已经成为我国仅次于糖尿病的第二大代谢类疾病(张心菊等，2014)。痛风的治疗原则除了严格的低嘌呤饮食、戒酒之外，消炎止痛药和控制尿酸药物的使用也是必不可少的。
[0003]在痛风发病间期和慢性期，通常使用降尿酸药物治疗。2012年11月，美国风湿病学会(American College of Rheumatology, ACR)发布了最新的痛风指南(Khanna Det al.，2012)，其中“降尿酸药物治疗建议”中推荐将别嘌醇(Allopurinol)或非布索坦(Febuxostat)作为一线降尿酸用药。鉴于非布索坦是2009年上市的新药，虽然疗效显著，但其长期服用的安全性以及对4期及以上程度的慢性肾脏疾病患者的安全性尚未得到证实。而自上世纪六十年代起就推向临床的别嘌醇价格低廉、疗效明确，因此具有更好的应用前景。
[0004]别嘌醇是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，通过抑制该酶的活性，减少次黄嘌呤和黄嘌呤合成尿酸，从而减少尿酸的生成，使血和尿中的尿酸含量减低到溶解度以下水平，防止尿酸形成结晶沉积在其他组织内，被广泛用于痛风、高尿酸血症的治疗中，还可预防白血病、淋巴瘤或其他肿瘤在化疗或放疗后继发组织内尿酸盐沉积、肾结石，尤其适用于尿酸生成过多、对排尿酸药过敏或无效，以及不宜使用排尿酸药物(如有肾功能不全)的患者(Hamburger M et al.，2011)。但2%-5%患者服用别嘌醇后会发生皮肤反应(Hoskison TK et al.，2006)，虽然只有少于 I % 患者(Pluim H J et al., 1998 ；Kim S C et al., 2013)会转变为包括 Stevens-Johnson 综合征(Stevens-Johnson syndrome, SJS)、中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermal necrolysis，TEN)和剥脱性皮炎在内的重症药疹，但是死亡率极高，其中SJS死亡率约5%，TEN死亡率约30-50% (Gerull R et al., 2011) 0 SJS表现为严重的多形性红斑，可累及皮肤与粘膜，包括口、鼻、眼、阴道、尿道、胃肠道和下呼吸道粘膜，患者有失明之虞，可进一步发展形成TEN，全身黏膜溃烂，在红斑上发生松弛性大泡或表皮剥离，若遇轻度触碰或牵拉可导致表皮大面积剥离(Aubock&Fritsch, 1982 ；Arellano&Sacristan, 1993)。因此，目前别嘌醇在临床上的使用面临极大的医疗风险。
[0005]美国风湿病学会最新发布的2012痛风指南(Khanna D et al., 2012)中建议在HLA-B*5801分布频率较高且与重症药疹关系密切的国家(如中国和韩国)，服用别嘌醇前需进行HLA-B*5801等位基因检测，以作为别嘌醇诱发重症药疹的筛查指标，判断该患者是否是别嘌呤醇所致重症药疹的高危人群。此项检测的推出可以有效降低由别嘌醇引起的严重不良反应，让痛风患者放心服用别嘌醇。但鉴于HLA-B多态性位点的复杂性，HLA-B*5801检测方法操作繁琐、干扰因素多，且可能由于罕见或未知HLA等位基因的干扰导致结果模棱两可难以判读。
[0006]2012年，日本学者Maekawa等人(Maekawa K et al.，2012)发现，PS0RS1C1 基因上的 rs9263726 等位基因(G>A)与 HLA_B*5801 呈现完全连锁(r2= 1，D’ = I)，即 rs9263726基因型为GA或AA型的人群，必定为HLA-B*5801等位基因携带者，反之亦然。这个发现意味着可以使用rs9263726等位基因的基因型，替代HLA_B*5801成为别嘌醇诱发重症药疹的预测指标，进行别嘌醇的个体化用药指导。
[0007]目前，筛查已知SNP常用检测方法有TaqMan探针法、测序、基因芯片、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)等多种技术。但各有缺点，如TaqMan探针法易受到待测位点周围临近的SNP位点的干扰，且价格昂贵；基因芯片不适宜小样本、少数SNP位点的检测；测序虽然是核苷酸检测的金标准，但成本较高，周期长，不适合向临床推广；而RFLP仅能检测有酶切位点的SNP，无酶切位点不能检测，且要用到电泳方法，灵敏度有限，对环境有污染。
[0008]因此，迫切需要建立一种操作简便、不受其他位点干扰的rs9263726检测方法。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是建立一种快速、廉价、简便、高特异性、不受临近SNP位点干扰的rs9263726等位基因检测方法。
[0010]本发明提供的rs9263726等位基因检测方法，首先通过Sanger测序方法对大样本中国健康人群的rs9263726等位基因上游200bp与下游200bp序列进行测序，构建该位点该区域内的多态性位点分布数据库。测序发现位于PS0RS1C1基因的rs9263726位点(NG_021348.l:g.28892G>A)，其附近位置密布SNP和发生频率较高的突变或缺失，包括已经被报道的 2 种 SNP 位点 rs3132557(NG_021348.l:g.28802T>C)和 rs9501057 (NG_021348.l:g.289090T)，以及尚未报道的 NG_021348.1: g.28852C>A、NG_021348.1: g.28999A>G、NG_021348.l:g.29036G>A、NG_021348.l:g.28900del C 和 NG_021348.l:g.28900 ins C共5种点突变和插入缺失突变。其中，最近的突变点距离待测位点rs9263726仅间隔7个碱基，且自待测点后第二个碱基起存在连续7个胞嘧啶(C)。这些特殊情况导致采用普通Taqman探针检测rs9263726时，探针容易错配，从而干扰正常检测。并且若要达到区分rs9263726等位基因型是GG、GA还是AA型的目的，必须设计2条Taqman探针才能实现，增加了检测量和检测成本。本发明根据rs9263726周围干扰位点分布特点，以HRM法为基础，采用unlabeled probe探针，对待测位点进行精确区分，可做到既能准确辨别rs9263726的GG、GA和AA基因型，又能同时显示邻近干扰位点突变情况，并且整个反应仅使用了 I条探针进行I次扩增即可完成，方便、快捷，准确度高。
[0011]具体地，为了实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0012]—种检测rs9263726等位基因的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0013]步骤一，从全血中抽提DNA ；
[0014]步骤二，以步骤一提取的DNA为样本DNA进行不对称PCR扩增；
[0015]步骤三，扩增结束后，加入荧光染料SYTO 9，在高分辨率PCR仪上检测熔解温度，分析温度上升时样本荧光信号的变化；
[0016]步骤四，对待测样本rs9263726的基因型进行分析；
[0017]其中，所述步骤二中PCR扩增中的探针为:
[0018]5’ -CTCCGAGGAAACTCATCCCCCC-PH0-3’
[0019]引物为:
[0020]上游引物:5，-ACCCCAGCTTTACAAGGACCC-3’
[0021]下游引物:5’ -GCTCCATGTGGCAAAGTCGGTCA-3 ’。
[0022]为了优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括:
[0023]上述步骤二中PCR扩增反应体系优选为:10 μ I Premix Taq HS，2 μ M上游引物0.5 μ 1，10 μ M下游引物R 0.5 μ 1，探针0.5 μ I (10 μ Μ)，25ng样本DNA，以及将体系总体积加至20 μ I的水。
[0024]上述步骤二中PCR扩增反应条件为:95 °C预变性2min，95 V 30s，55 V 30s，72°C 30s，50 个循环。
[0025]上述步骤三中的检测恪解温度的反应条件和操作优选为:95°C lmin，40°C Imin预处理后，熔解温度从55°C升至90°C，每升高0.5°C采集一次数据，获得高分辨率熔解曲线图。
[0026]上述探针在3 ’端作磷酸化封闭。
[0027]本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果:
[0028]本发明在PCR完成后再加入饱和荧光染料SYTO 9，放大扩增信号、减少荧光对PCR的抑制作用；本发明的方法根据大样本测序发现的rs9263726周围