油菜BnaSPT1基因在促进双子叶植物角果生长中的应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及油菜bnaspt1基因在促进双子叶植物角果生长中的应用。

背景技术：

油菜是我国主要的油料作物之一，油菜的种植及产量直接影响到我国的油料食品安全。而且在世界范围内，油菜在油料作物中的地位也是重中之重。目前我国油菜的产量还远远无法满足国内的需求，提高油菜的产量是当务之急。角果是油菜产量构成因素中重要的组成部分，角果及角果相关性状对油菜产量具有直接或者间接的作用。油菜角果作为油菜的结实器官，不仅是重要的贮藏器官，也是重要的光合器官，具有“库”和“源”的双重作用。角果的生长发育严重影响油菜的产量和品质，角果长度是影响油菜产量的重要因素，培养长角果可以提高油菜的产量潜力。因此，研究和开发关于油菜角果发育控制的遗传资源，提高油菜的生产水平，对于增加国家和地方财政收入，解决“三农”问题和新农村建设具有十分重要的意义。

雌蕊是种子植物的雌性繁殖器官，由心皮、花柱和子房组成并最终发育成果实，其生长发育情况对作物的产量、质量有决定性的影响。spatula(spt)是第一个被发现在植物花器官发育过程中起到重要作用的基因。近年来，spt在模式植物拟南芥中已有深入的研究。

拟南芥spatula基因除了可以调控雌蕊的发育外，在子叶、叶片、根、果实等器官中都有作用，同时对种子的萌发也起到了一定的作用。所以可以说spt的功能贯穿了植物的整个生命周期，但是spt的主要功能是在雌蕊受精之前影响雌性器官的发育。在拟南芥spt突变体中，spt功能缺失会导致隔膜和顶端心皮融合缺陷，以及传输束丧失和柱头组织发育的减少，角果发育缺陷、短小、结实率低。

赵燕等(2009)从哥伦比亚生态型拟南芥中克隆到了与spt相关的同样影响心皮发育的crc基因，转化到具有心形外型心皮形态的荠菜，筛选到转crc基因的荠菜植株，crc基因在荠菜中的组成型表达对荠菜心皮形态和大小都产生一定影响。

杨朴丽等(2013)以结球甘蓝为材料，提取花蕾总rna，反转录cdna。根据拟南芥spt基因设计引物，采用同源克隆的方法从中克隆spt基因，序列1085bp，开放阅读框1062bp。原核表达该蛋白，生物信息学预测其具有bhlh家族结构域。进化树表明结球甘蓝bospt与拟南芥atspt和筷子芥alspt的亲缘关系较近。

许俊强等(2014)以结球甘蓝自交不亲和系e1为材料，提取雌蕊总rna，根据拟南芥中spt和hec1基因设计引物，采用同源克隆方法克隆spt基因和hec1基因。两基因在各器 官中均表达，但spt在果实和雌蕊中表达量最高，而hec1在根和花蕾中的表达量最高。运用酵母双杂交技术试验验证spt和hec1蛋白能够相互作用，可能形成异源二聚体共同调控雌蕊发育。

目前有关油菜中spatula基因的功能研究未见报道，鉴于spatula基因在其他植物中调控雌蕊发育的作用，利用现代生物技术手段研究油菜spatula基因与角果发育的潜在联系，对于提高作物产量具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种油菜bnaspt1基因在促进双子叶植物角果生长中的应用，在拟南芥等双子叶植物中表达外源基因油菜bnaspt1，能够促进拟南芥角果生长发育。

油菜bnaspt1基因在促进双子叶植物角果生长中的应用，所述油菜bnaspt1基因的碱基序列如seqidno.1所示。

角果是十字花科植物特有的果实类型，因此，所述双子叶植物为十字花科植物。作为优选，所述双子叶植物为油菜、亚麻荠、荠菜、甘蓝、山嵛菜或拟南芥。

所述应用，包括：

(1)将油菜bnaspt1基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体；

(2)将重组表达载体转化到受体植物中。

重组表达载体的构建可采用常规方法，如采用gateway系统(invitrogen公司)将油菜基因bnaspt1连入植物表达载体中。

所述植物表达载体为ph2gw7或pk2gw7。

所述的重组表达载体中，启动所述油菜bnaspt1基因表达的启动子为强启动子。强启动子能够启动油菜bnaspt1基因过表达。作为优选，所述的强启动子为35s。

转化受体植物时，可采用农杆菌介导转化的方法，所述的农杆菌具体可以为农杆菌lab4404、gv3101或eha105等。

所述受体植物为油菜、亚麻荠、荠菜、甘蓝、山嵛菜或拟南芥。所述拟南芥的品种可以为columbia及landsbergerecta，但不仅限于columbia及landsbergerecta。更为优选，受体植物为拟南芥野生型或拟南芥spt2、spt12突变体。

利用所述的油菜bnaspt1基因对拟南芥突变体及其野生型等双子叶植物进行遗传转化，经测试发现，bnaspt1的过量表达不仅能够恢复拟南芥突变体的短小角果表型，而且其在野生型中的过量表达也能够显著促进拟南芥角果生长。

本发明还提供了一种重组表达载体，包括原始载体和插入所述原始载体的目的基因，所述目的基因的碱基序列如seqidno.1所示。

所述重组表达载体中，启动所述目的基因表达的启动子为强启动子。作为优选，所述强 启动子为35s。

所述原始载体为ph2gw7或pk2gw7。

本发明还提供了一种包含所述重组表达载体的转化子。

所述的转化子中，宿主菌为农杆菌gv3101、lab4404或eha105。

利用所述转化子侵染受体植物，即可实现重组表达载体对受体植物的转化。

本发明具备的有益效果：本发明通过克隆油菜bnaspt1基因，并在拟南芥中进行遗传转化，过量表达外源油菜bnaspt1基因，能够显著提高拟南芥spt突变体角果的大小，恢复种子数量。借助基因工程技术使油菜bnaspt1基因在受体中超表达，改善角果大小，有助于高产研究。

基于模式植物拟南芥与其他双子叶植物的密切关系，本发明在拟南芥的促进角果生长中得到很好应用，证明本发明的油菜bnaspt1基因也可以应用到其他双子叶植物中促进其角果的发育。

附图说明

图1为野生型(col、ler)和拟南芥突变体(spt12、spt2)及转基因植株(35s::bn1spt12、35s::bn1spt2)不同株系角果表型照片。

图2为实施例3中油菜bnaspt1基因转化拟南芥野生型植株得到的角果的长度对比图，其中col-0为拟南芥野生型，bnaspt1oe-1、bnaspt1oe-2和bnaspt1oe-3为转基因拟南芥。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1油菜bhlh转录因子bnaspt1基因过量表达载体构建和拟南芥遗传转化

(1)取油菜(brassicanapus)叶片，液氮研磨，加入rnaiso试剂(takara公司)，提取rna。取1μgrna进行反转录反应得到cdna。

(2)根据genbank上的bnaspt1(bnaa01g00730d)基因序列设计特异引物，分别在引物5’端加上salⅰ和notⅰ限制性酶切位点，序列如下：

引物1：5’-gcgtcgacatgggagataataagaaactgatttcatc-3’；

引物2：5’-ttgcggccgctcaagtaagtcgatcttttatctcagga-3’。

(3)以全长cdna为模板进行pcr扩增。

采用高保真酶hsdnapolymerase(takaracode：dr010a)体系：

5×primestarbuffer(mg²⁺plus)10μl，

dntpmixture(各2.5mm)4μl，

引物1(10μm)1μl，

引物2(10μm)1μl，

模板cdna1μl，

hsdnapolymerase0.5μl，

灭菌蒸馏水加至总体积50μl。

pcr循环条件为：98℃预变性5分钟，98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸90秒，扩增30个循环，最后72℃延伸10分钟，结束反应。

(4)将pcr产物回收后通过酶切连接到gateway克隆系统入门载体pentr1a，转化大肠杆菌dh5α，测序并分析，bnaspt1基因序列如seqidno.1所示。

(5)将测序正确的含bnaspt1全长cds的pentr1a质粒与过量表达载体ph2gw7进行lr交换反应。

使用gatewaylrclonasetmenzymemix(invitrogen公司，cat.no.11791-019)，体系如下：entryclone(入门载体)50-150ng，destinationvector(目的载体)150ng，5×lrclonasereactionbuffer2μl，ddh2oupto8μl，加入2μllrclonaseenzymemix，短暂涡旋两次混匀，轻微离心，于25℃水浴8h，然后加入1μlproteinaseksolution(蛋白酶k溶液)混匀，37℃放置10分钟结束反应。

取5μl反应产物转化大肠杆菌dh5α，挑取pcr验证阳性克隆培养后提取质粒进行双酶切验证。

(6)从-80℃冰箱中取出gv3101感受态细胞，利用电击法转化农杆菌gv3101。

感受态细胞置于冰上解冻，取2μl左右的目的质粒加到感受态细胞中，混匀后置于冰上30min，再将离心管内的所有混合物加到预冷的电击杯内，冰上放置。打开伯乐电转仪，程序调至agr，吸取1ml的lb液体营养基，将电击杯凸点朝内推入电转仪，按一下plus键，听到蜂鸣声，迅速拿出电击杯，并向电击杯杯加入1ml的lb液体营养基，重悬细胞，转移至1.5ml的离心管内，放在eppendorf混合仪内28℃，700rpm摇2.5h以上，涂布于抗性yep平板上(rif(利福平)50mg/l，spec(盐酸大观霉素)100mg/l)，28℃倒置培养2个晚上以至长出单菌落。

(7)挑取长出的农杆菌单克隆，到含有相应抗生素的5mlyep液体培养基中(相应抗生素为rif50mg/lspec100mg/l)，28℃150rpm振荡培养48小时。将摇的菌按体积比1:10加入yep液体培养基(含相应抗生素)28℃,培养至od600>1。

(8)用拟南芥花浸法转化拟南芥。

1)将果荚去除干净、仅剩下花序的拟南芥整株与穴盘一起倒扣于已转化农杆菌的菌液里，浸苗5min，期间不断地摇晃菌液；

2)侵染完后，取出植株，侧放于托盘内，覆盖避光的黑色塑料布，放置在生长室内，24h 后揭开；

3)将拟南芥植株置于自然光照的条件下进行培养，每周浇1-2次水，待种子成熟后，收获t0代种子；

4)将收获的t0代种子杀菌消毒后，种植在ms+50mg/lkanamycin的固体培养基内，4℃黑暗春化3d后，将培养皿置于人工气候箱内培养，观察拟南芥植株的生长状况。具有卡那霉素抗性的转基因种子将会在筛选培养基内生长，而非转基因的种子萌发后不久就白化死去。

实施例2拟南芥角果的性状观察

拟南芥spt2、spt12突变体的角果比野生型要短小，在中间靠近顶端部分比较扁平，因此我们选择拟南芥spt2、spt12突变体作为实施例1中的转基因受体植株。

对获得的转基因拟南芥植株进行角果长度测量记录，如图1所示，在拟南芥角果发育不良的突变体中过量表达油菜bnaspt1基因(如seqidno.1所示的序列)，使突变体的角果长度显著增长，恢复到野生型水平。

借助基因工程技术使功能基因在受体中超表达，改善角果大小，有助于高产研究。

实施例3

为了检测油菜基因bnaspt1的过量表达是否能够促进拟南芥野生型角果生长，我们也以拟南芥野生型植株columbia为实施例1中转基因受体进行了功能验证。

对收获的转基因拟南芥植株进行角果长度测量记录，统计结果如图2所示。在拟南芥野生型中过量表达油菜bnaspt1基因，可以促进角果生长，角果长度显著大于未转化的拟南芥野生型植株。

我们的实验成果以模式植物拟南芥为背景，证明油菜bnaspt1基因可以促进双子叶植物角果的生长。