专利名称：一种油菜促分裂原活化蛋白激酶基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及油菜促分裂原活化蛋白激酶基因，具体地说是一种来源于油菜沪油15品种(Brassica n即us H)的油菜促分裂原活化蛋白激酶基因。
背景技术：
油菜促分裂原活化蛋白激酶((Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK)是真核生物(油菜)中普遍存在的一类蛋白，是真核生物信号传递网络中的重要元件之一，与油菜的抗病害活性紧密相关。近几年来研究发现，MAPK信号链在茉莉酸信号途径和水杨酸信号途径介导的抗真菌、抗病毒等植物防卫反应过程中均起重要作用，但在油菜中的具体功能尚不太清楚，尤其是在壳寡糖诱抗中的作用尚无报道。
发明内容
本发明提供一种油菜促分裂原活化蛋白激酶基因及其编码蛋白，并揭示了油菜促
分裂原活化蛋白激酶基因与壳寡糖诱导油菜抗病性之间的关系。本发明基因是抗病信号传
导过程中的重要节点基因，利用过表达等转基因技术构建其转基因突变株，并进行后续遗
传育种，可以开发出提高植物免疫响应能力的新型抗病油菜品种。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 —种油菜促分裂原活化蛋白激酶基因，其具有序列表SEQ ID NO :1中碱基序列，其编码蛋白具有序列表SEQ ID NO :2中氨基酸序列。 —种油菜(甘蓝型)促分裂原活化蛋白激酶基因的cDNA的克隆
1). 50mg/L的壳寡糖喷施油菜叶片，喷水作对照，在lh取样提取总RNA，进一步提取mRNA进行基因芯片杂交实验，从差异克隆挑选出一个片断与拟南芥AtMPK4基因同源性高达94% ; 2).利用大连宝生物工程有限公司(TAKARA)公司的RNA PCR KIT (AMV) Ver. 3. 0试剂盒获得油菜BnMPK4基因的3'端序列； 3).利用TAKARA公司的5' -Full RACE Kit试剂盒获得油菜BnMPK4基因的5'端及cDNA全长，进一步推导出氨基酸序列； 4).可被壳寡糖诱导的甘蓝型油菜MPK4基因具有以下cDNA碱基和蛋白质的氨基酸序列； 5).根据甘蓝型油菜MPK4基因的cDNA全长序列和表达载体pGEX_4T_l的特点，设计MPK4基因原核表达的PCR引物序列，以甘蓝型油菜总RNA为模板扩增待表达的基因片段，克隆到表达载体pGEX-4T-l上，转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达，表达出与预期蛋白相符的目的蛋白； 6).由原核表达得到的目的蛋白，通过结晶体衍射等方法得到其空间结构。
本发明优点如下对生物农药的应用具有明显指导作用；该基因的克隆对于揭示
壳寡糖诱导植物抗性反应的分子信号通路很有价值，并在寡糖生物农药的应用方面具有重要的理论指导意义。
图1为RNA电泳图，C对照，T处理；
图2为油菜芯片杂交结果； 图3PCR获取BnMPK4全长及重组质粒pMD 18-BnMPK4的PCR鉴定； 图4. BnMPK4基因及其在植物种间同源序列的进化树； 图5壳寡糖处理后BnMPK4mRNA水平变化； 图6重组蛋白GST-BnMPK4纯化结果的SDS-PAGE分析； 图7. BnMPK4空间结构。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述
实施例1 —种油菜(甘蓝型)促分裂原活化蛋白激酶基因(MPK4)的cDNA序列，具有序列表SEQ ID NO :1中碱基序列；序列特征1332bp、线性双链，最初来源于甘蓝型油菜沪油15(Brassica n即us H);—种油菜(甘蓝型)促分裂原活化蛋白激酶基因(MPK4)的的氨基酸序列具有序列表SEQ ID N0:2中氨基酸序列，线性、单链、373氨基酸。
实施例2基因芯片差异显示获得cDNA片断序列
材料 油菜品种沪油15于温室中培养至幼苗为4-5片叶时，叶面喷施50mg/L壳寡糖，叶面喷施双蒸水作为对照，在1小时取材。
总RNA提取，定量与完整性检测 用双蒸水洗去叶表面尘土，在液氮中研磨，用TRIZOL(Gibco BRL)试剂提取RNA。(1)定量测260、280nm处的吸光值，计算A26。/A28。的值以估计总RNA的纯度。通过A26。的值计算总RNA的量。(2) RNA完整性检测在1 %甲醛变性琼脂糖凝胶上分离总RNA，有两条清晰的带，且大分子量(28SrRNA)的亮度近似为小分子量(18SrRNA)的亮度的2倍，说明总RNA完整(图1)。
基因芯片差异显示 利用上海联合基因公司的甘蓝型油菜cDNA芯片，分别与壳寡糖处理组及对照组进行杂交实验(图2)，得到393个差异片断。从中筛选出一个与拟南芥MPK4基因同源性高达94%的446bp的基因序列片断 图2油菜芯片杂交结果。壳寡糖处理样品标记红荧光(Cy5)，对照标记绿荧光
4(Cy3);芯片上红色点代表壳寡糖处理样品中表达水平高，绿色点代表对照样品中表达水平
高，黄色点代表两者表达水平相当 实施例3:3'末端的克隆 利用Takara的RNA PCR KIT (AMV) Ver. 3. 0试剂盒，使用依据上文中得到的cDNA片断设计的引物TTGTATCAATTGTTGCGTGGA及试剂盒自带引物M13Primer M4，利用Takara的LA Taq酶进行PCR(95。C变性5分钟；92。C 30秒，52°C 30秒，72°C 2分钟为一个反应循环，重复30次；72t:延伸10分钟；)得到了此片段的3'端。琼脂糖凝胶检测后，进行胶回收，回收产物连接到PMD 18-T载体(Takara)上。将连接产物转化大肠杆菌ToplO，经蓝白斑筛选，挑取10个白斑液体扩大培养并提取质粒，经PCR(95t:变性5分钟；92°C 30秒，52°C 30秒，72t: 2分钟为一个反应循环，重复30次；72t:延伸10分钟；)鉴定后，由上海生工生物工程公司测序，得到了此cDNA片断的3'端 实施例4:5'末端的克隆 cDNA5'末端快速扩增按照TAKARA公司的5'-Full RACE Kit扩增试剂盒说明书进行。扩增产物经1 %琼脂糖电泳检测并纯化后连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌ToplO，蓝白斑筛选及PCR鉴定后，由上海生工生物工程公司测序。获得5'端序列
AACGCTT 实施例5 :全长的克隆 依据上文得到的5 ' 、3 ' 端序列，设计引物对GTGCGTCTTGGTTTCCGAT，ACTCTCCCTTACTGAGGATTGAACT利用Takara的LA Taq酶进行PCR，同上胶回收、转化质粒、PCR验证后(图3)，由上海生工生物工程公司测序，结合5' 、3'端序列信息得到了此cDNA全长；
0041] 序列表SEQ ID NO :1中碱基序列CTGAGAAATTAAAACGCAAAAAAAAAAAAAA 将所获得的cDNA全长利用NCBI的Blast程序与基因数据库Genebank进行比对，发现其与植物MAPK基因具有同源性(图4)，与拟南芥的MPK4基因(NM_116367)同源性最高达93%。在其氨基酸序列中发现含有保守的MAPK保守区域TEY。故将此基因命名为BnMPK4登陆到Genebank (DQ206628)。 实施例6 :壳寡糖诱导下不同时间BnMPK4的mRNA表达水平变化 油菜品种沪油15于温室中培养至幼苗为4-5片叶时，叶面喷施50mg/L壳
寡糖，对照植株叶面喷施双蒸水，在15、30分钟、1-168小时分别取材。设计引物对
5' GCGTCTTGGTTTCCGATTC 3' ;5' CGAGGTTTGGTTAGAGCGTAT 3'利用Takara的rTaq酶进行
PCR扩增，1X琼脂糖电泳检测；以油菜Actin基因作为内标。结果显示BnMPK4的mRNA水
平可被壳寡糖迅速诱导(图5)，在30分钟时达到高峰。 实施例7 :BnMPK4蛋白的原核表达 根据甘蓝型油菜BnMPK4基因的cDNA全长序列设计BnMPK4基因原核表达的PCR引物序列，在引物MPK4es和MPK4ea的5'端引入了 EcoR I和Xholl酶切位点(下划线部分)，引物序列如下MPK4上游表达引物(MPK4es) 5' GCGAATTCATGTCGGCGGAGA 3' ;MPK4下游表达引物(MPK4ea) 5，GCGTCGACCCTTACTCGAGGATTGA 3'，以甘蓝型油菜总RNA为模板扩增待表达的基因片段，将PCR反应扩增的目的片段回收后和pGEX-4T-l载体在50ul反应液体系中用EcoR I和Xho I酶切，将酶切后的PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-l上，转化表达菌株BL21 (DE3)诱导表达。将表达菌BL21 (DE3) /pGEX-4T-l-BnMPK4及相应的空载体菌接在LB液体培养基/Amp中，37t:培养过夜，OD值达到0. 5-0. 6时用终浓度为lmmol/L的IPTG诱导表达，持续振荡培养4h。将1. 4ml培养液8000rpm离心10min，将上清转入另一EP管，200iU无菌双蒸水和50iU的5XSDS上样缓冲液吹打悬浮细菌，沸水浴10min，12000rpm离心lmin，取15 yl上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果扩增出预期的目的蛋白，利用Glutathione S印harose 4B进行纯化得到GST-BnMPK4融合蛋白(图6)。
6
序列表SEQ ID NO :2中氨基酸序列 实施例8 :BnMPK4蛋白的空间结构 BnMPK4蛋白的三维结构如图7 :保守区域TEY和C端锚定保守区域用粗体标出(图7)，其三维结构与目前发现的动物及植物MAPK蛋白类似。综上所述，申请人利用分子生物学技术从油菜中克隆得到了一个新的MAPK基因BnMPK4，研究了其序列及结构特性，确定了其与油菜抗病性之间的关系。 本发明基因是抗病信号传导过程中的重要节点基因，利用过表达等转基因技术构
建其转基因突变株，并进行后续遗传育种，可以开发出提高植物免疫响应能力的新型抗病
油菜品种。在今后生产实践中种植此提高抗病性的油菜品种，可以减少农药使用，从而减轻
环境污染及农民负担，对推广我国绿色农业大有裨益，总而言之，此项发明具有长远的经济
和社会价值。 Untitled. ST25 SEQUENCE LISTING 〈110〉中国科学院大连化学物理研究所 〈120〉 一种油菜促分裂原活化蛋白激酶基因及其编码蛋白 〈130〉 〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211>1332
〈212>DNA 〈213〉甘蓝型油菜沪油15(Brassica napus H) 〈220〉 〈221>CDS 〈222>(70). (1188) 〈223〉 〈400〉 1 gggcgtgcgt cttggtttcc gattcaattc gatttttgte ggggttteaa tcacaaggte 60
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15 20 25 30
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10
Ser Leu Thr Glu Glu Asn lie Lys Glu Leu lie Tyr Arg Glu Thr Val
355 360 365 Asn Phe Asn Pro Gin
370
权利要求
一种油菜促分裂原活化蛋白激酶基因，其特征在于具有序列表SEQID NO1中碱基序列。
2. 按照权利要求1所述油菜促分裂原活化蛋白激酶基因的编码蛋白，其特征在于具有序列表SEQ ID NO :2中氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种油菜促分裂原活化蛋白激酶基因(Mitogen ActivatedProtein Kinase，MAPK)；具体地说是真核生物(油菜)中普遍存在的一类蛋白，是真核生物信号传递网络中的重要元件之一，与油菜抵御病虫害紧密相关，其核苷酸序列和氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。本发明优点如下对生物农药的应用具有明显指导作用；该基因的克隆对于揭示壳寡糖诱导植物抗性反应的分子信号通路很有价值，并在寡糖生物农药的应用方面具有重要的理论指导意义。
文档编号C12N15/10GK101768595SQ20081023031
公开日2010年7月7日 申请日期2008年12月29日 优先权日2008年12月29日
发明者尹恒, 李曙光, 杜昱光, 白雪芳, 赵小明 申请人:中国科学院大连化学物理研究所