专利名称：油菜BnRabGDI3基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程和生物技术领域。具体涉及一种控制油菜和拟南芥花粉育性的RabGDI3基因，同时还涉及一种控制植物花粉育性的RabGDI3基因的制备方法，还涉及一种控制植物花粉育性的RabGDI3基因的用途。本发明还涉及含有该基因或其同源核苷酸序列的载体和涉及利用该基因在油菜基因工程中的应用。
背景技术：
Rab蛋白是小分子GTP(鸟苷三磷酸)结合蛋白家族中最大的亚家族，作为囊泡运输的分子开关起重要调控作用(吴文林，吴穗洁.Rab蛋白的结构、功能与研究展望.台湾海峡，2006，25 (4) :599-605)。Rab蛋白作用循环是Rab-GDP与Rab-GTP两种不同结合状态的转化过程。其中存在于细胞质中的Rab-GDP为无活性状态，而与膜结合的Rab-GTP为有活性的状态并参与调控囊泡的运输(Vanessa Vernoud, Amy C. Horton, Zhenbiao Yang, et al. Analysis of the Small GTPase Gene Superfamily of Arabidopsis. PlantPhysiology, 2003, 131:1191-1208)。对于大多数Rab蛋白，与特定膜的连接是通过其蛋白C端保守的半胱氨酸异戍二烯化修饰实现的，这一过程需要GGTase (Rab geranylgeranyltransferase,猶牛儿猶牛儿基转移酶)和REP (Rab escort protein, Rab护送蛋白)的共同参与来完成(樊俊蝶，王伟，梁爱华.Rab蛋白的结构、功能及进化.《生命的化学》，2004，24(1) :31-33)。而经过修饰的Rab蛋白的稳定状态则受到Rab⑶I的控制。RabGDI (Rab GDP dissociation inhibitor proteins)是一种 GDP 解离抑制齐IJ，是Rab⑶P/RabGTP转化过程所需的调控因子之一。该因子在Rab蛋白调控囊泡转运过程中起着重要作用。它能够抑制Rab蛋白释放GDP (鸟苷二磷酸)，从而使Rab蛋白不能与GTP (鸟苷三磷酸)结合，使其维持在无活性状态。膜结合的有活性的Rab-GTP，参与囊泡运输的调节，最后转变成Rab-GDP，在Rab⑶I的作用下与膜分离。Rab⑶I分离Rab-GDP的过程可能是自发的，但此过程还需要其它因子的调节，例如GTPase激活蛋白(GTPaseactivating protein, GAP)和鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotideexchange factor, GEF, Yao-ffen Wu, Ku1-Thong Tan, Herbert ffaldmann, et al. Alexandrovinteraction analysis ofprenylated Rab GTPase with Rab escort protein and GDPdissociation inhibitor explains the needfor both regulators. PNAS, 2007, 104(30):12294-12299)。RabGDI，最早是从牛脑细胞质中分离得到的，起初的研究发现GDI是一种抑制⑶P从Rab3A解离的蛋白。随后的研究发现发现⑶I可以使失去活性的Rab⑶P从膜上分离，回到胞液中从而进入下个循环。GDI有广泛作用的特性，例如对Rab3A起作用的GDI对已检测得到的哺乳动物中的其它Rab蛋白都起作用，因此将其统一命名为“ RabGD I ”(Takashi Ueda, Noriyuki Matsuda, Toyoaki Anai, et al. An Arabidopsis gene Isolatedby a novel method for detecting genetic interaction in Yeast encodes the GDPdissociation inhibitor of Ara4 GTPase. ThePlant Cell, 1996，8:2079-2091 )。随后的研究发现在酵母中只有I个GDI基因，是由GDI1/SEC19编码的，该基因的突变体表现出多种表型，并对囊泡运输途径造成影响。而在老鼠的基因组中至少存在5个GDI基因(Janoueix-Lerosey1.,Jollivet F. ,Camonis J. , et al.Two-hybrid systemscreenwith the small GTP-binding protein Rab6.Biol Chem, 1995，270:14801-14808)。Uedal996年发现了一个编码拟南芥Rab⑶I的基因，即AtRab⑶II，这是第一个在高等植物里定位的GDI。后续的研究又在拟南芥中又发现了 AtRabGDI2。目前发现在拟南芥中存在三个编码Rab⑶I的基因4七1^1^0114七1^1^013。其中通过酵母突变体 secl9 功能互补实验证实 AtRab⑶Il (At2g44100)和 AtRab⑶ 12 (At3g59920)在酵母和植物中具有保守的功能活性。研究表明AtRabGDIl在各组织中均有表达，而AtRab⑶12在根中表达量较高，在花中少量表达，而在其它组织中表达量极低(UedaT. , MatsudaN. , Anai T.,et al. An Arabidopsis geneisolated by a novel method fordetecting genetic interaction in yeast encodes the GDP dissociationinhibitor of Ara4 GTPase. Plant Cell, 1996, 8:2079-2091;Ueda T. , Yoshizumi T. , Anai T. , etal. AtGDI2, a novel Arabidopsis gene encoding a Rab GDP dissociation inhibitor.Gene, 1998, 206:137-143;Zarsky V. , Cvrckova F. , Bischoff F.,et al. At-GDIl fromArabidopsis thaliana encodes arab-specific GDP dissociation inhibitorthat complements the sec 19 mutation of Saccharomycescerevisiae.FEBSLett, 1997,403:303-308。Kim等在通过真菌侵染水稻的实验研究中发现侵染早期，水稻中的两个Rab⑶I (Os⑶Il和Os⑶12)表达出现上调。虽然具体的分子机制还不清楚，但推测OsGDI在植物对病原侵害早期的抵御信号扩散具有重要作用。同时发现它们与烟草GDI的蛋白同源性为86%-87%，与拟南芥蛋白同源性为82%-84%，说明该基因可能在植物抗性方面也具有一定的研究价值(Kim W. Y. , Kim C. Y. , Cheong N. E. , et al. Characterizationof two fungal-eIicitor induced rice cDNAs encoding functional homologuesofthe rab-specific GDP-dissociation inhibitor. Planta 1999,210:143-149)。关于AtRab⑶13及BnRab⑶13的表达分析以及其它相关研究未见报道。近年来，基于微RNA (microRNA, miRNA)作用原理而发展的人工微RNA(artificialmiRNA, amiRNA)技术是一种新型的RNA干扰技术。它利用目标基因的特定序列置换植物miRNA的茎序列(一般为21-22nt)，构建amiRNA表达载体来干扰目标基因的表达。该技术不仅能够像传统RNAi技术一样同时干扰沉默所有目标序列或基因，同时也可以精确的干扰基因家族或者等位基因中的单个特殊目标基因，具有闻度的特异性和闻效性，克服了基因代谢补偿作用，而且能够克服传统RNAi技术(效应分子为小干扰RNA，smallinterfering RNA, siRNA)在实验操作过程中出现的“脱革巴”等问题(Ossowski S, SchwabR, Weigel D. Genesilencing in plants using artificial microRNAs and other smallRNAs. Plant J. 53:674-690.，2008)，有效的提高了基因干扰的效率。油菜作为中国主要的油料作物，在长江流域广泛种植，对国计民生具有重要影响。油菜杂种优势明显，利用细胞核雄性不育配制杂种优势组合是杂种优势利用的重要途径。目前国内外已发现了多种类型的细胞核雄性不育材料，并在理论和应用方面取得了重要进展，而新型不育源的发现和研究一直是杂种优势研究的基础，并以此创造出更多的天然和人工不育材料，为育种和生产所应用。
因此，本发明开发了一个和油菜花粉发育和育性调控相关的基因BnRab⑶13。通过荧光定量PCR检测该基因在可育植株的雄蕊中高量表达。通过转基因实验证实，抑制AtRabGDI3的表达会造成拟南芥花药发育异常，导致雄性不育；而通过在拟南芥中过表达BnRabGD13基因，和雄性不育转基因植株杂交可以使杂交后代中RabGdDI3基因的表达水平得到恢复，同时花药和花粉粒的育性也恢复到正常水平。申请人的结果预示着RabGDI3在控制油菜和拟南芥花粉育性，创造雄性不育转基因新材料中具有相当的应用前景。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种油菜BnRab⑶13基因，该基因在油菜的花蕾及雄蕊中高效表达，通过抑制该基因的表达可以降低植物花药的育性，从而获得雄性不育植株，应用于杂交育种。而且该基因在其它大部分植物组织中不表达，因此在植物基因工程中沉默该基因的表达不会引起植物营养生长阶段的变化。本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜BnRab⑶13基因的制备方法，通过BLAST比对拟南芥及油菜、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜序基因组测序列数据库，在包含基因全长的序列两端设计同源引物，应用简单的PCR方法即可以获得该基因的序列。本发明还有一个目的是在于提供了一种油菜BnRab⑶13基因在控制油菜和拟南芥花粉育性中的应用。通过沉默该基因的表达，发明人可以人工创造雄性不育系材料；而利用基因工程技术过表达该基因得到的恢复系材料，可以使雄性不育材料花粉的育性得到恢复。这一对材料可以在油菜杂交育种生产中应用。为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案为了获得本发明，发明人对花粉发育过程中的相关基因进行了深入和全面的研究，结果发现了一个新基因BnRabGDI3，在可育植株的花药中高效表达，而在不育植株中几乎不表达，因此该基因和植物花粉的育性调控有关。转基因实验也证实了这一点抑制该基因的表达会造成拟南芥花药发育异常，导致雄性不育。根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供油菜花药高效表达基因BnRab⑶13来实现，所述基因含有SEQ ID No.1所述核苷酸序列或与它们实质上同源的核苷酸序列。根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供植物油菜花药高效表达多肽BnRab⑶13来实现，所述多肽含有SEQ ID No. 2氨基酸序列或与它们实质上同源的氨基酸序列。根据本发明的另一个方面，上述目的通过提供含有BnRab⑶13基因靶标(AATUTUTATATUUTGTUGAG)序列的人工微RNA干扰重组载体(pamiRNA1-Rab⑶13)来实现对拟南芥中RabGDI3基因表达量的抑制。根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体(pamiRNA1-BnRab⑶13)转化的微生物(根癌农杆菌EHA105，购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同)来实现对拟南芥的转化，从而抑制拟南芥中RabGDI3基因的表达量。根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物(包含有pamiRNA1- Rab⑶13重组载体的根癌农杆菌EHA105转化的转基因植物来实现对花药育性的调控，获得雄性不育转基因植株。
一种油菜BnRab⑶13基因的制备方法，其步骤是1、油菜花药高效表达基因的克隆1.1油菜BnRab⑶13基因的引物序列根据本实验室正在进行甘蓝型油菜(Brassica napus)基因组测序资源，通过ORFFinder和BLAST软件对所有已测资源序列进行分析，确定BnRab⑶13序列。所以通过比对分析后，在已知的油菜序列中包含ORF的同源区域设计引物，从而确保扩增产物为全长序列。引物为BnRab⑶I3S :5' -GTAAGATAGGAGGTGGTGG-3'和 BnRabOHSA = S' -CGTAAAACCACTCAGCCAA-3,。1. 2油菜BnRab⑶13基因的制备本发明所用油菜为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中双九号(油料作物研究所 王新发副研究员提供，以下相同)。中双九号播种于大田，正常田间管理。利用SDS裂解法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)提取基因组DNA。以此为模版，进行PCR扩增(
图1)。步骤是提取基因组DNA25y 1，以此为模板进行扩增，反应体系为50 μ 1，分别添加IOXEx Taq buffer 5 μ 1，dNTP4 μ 1，5，弓丨物 1μ 1，3’引物 I μ I7ExTaq O. 5 μ 1，DNA 模版 I μ I 约 IOOng, ddH20 37. 5 μ I。根据油菜全基因组测序获得的BnRab⑶13基因序列设计PCR所用引物为BnRab⑶13S和BnRab⑶13Α (前面已述)。扩增产物大小为2064bp，PCR反应程序为940C 5分钟，94°C I分钟，60°C I分钟，720C 2分钟，33个循环，720C 10分钟，16°C 3小时，PCR产物经1. 0% (琼脂糖凝胶/TE溶液质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技北京有限公司，以下相同)纯化回收后，连接到PMD18-T载体(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)，热激法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)转化gold菌株的感受态细胞(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)，涂布于含有氨节青霉素50 μ g/mL (质量体积比，以下相同)的LB固体培养基(配方如下分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859 X 104Pa下高压消毒20分钟。分装到培养皿中，4°C冷藏备用，以下相同)平板上，37 °C培养过夜，挑选白斑6个。采用Ml3引物5 ' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 '和 5 ' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'，做菌落 PCR 检测。菌落PCR具体方法(以下相同)是用灭菌的牙签挑取少量菌斑做模版，反应体系为IOyL内含:10XTaq buffer (含 MgCl2)ly I,1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5，引物(lOymol/L)0. 5μ 1，3，引物(10ymol/L)0. 5μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 6· 5μ I。反应条件为94°C 5分钟，94°C I分钟，55°C I分钟，72°C 2分钟30秒，33个循环，72°C 10分钟，扩增大小为2744bp，1. 0%(前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测大小正确后。将PCR检测大小正确的菌斑接种到含氨苄青霉素50 μ g/mL的液体LB培养基(配方如下分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升，121 °C，6. 859X 104Pa下高压消毒20分钟，以下相同)，37°C下200r/min振荡培养过夜，小量碱法(J.萨姆布鲁克.D. W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)提取质粒，1. 0% (前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA大小正确后(为2064bp)，采用Kpn I /Xba I酶(2种酶购自TaKaRa公司，以下相同)切对质粒进行双酶切(以下相同)，酶切体系(以下相同)为10 μ 1，包含质粒 DNA5y 1，Kpn I 0. 5 μ 1，Xba I O. 5 μ 1，ddH20 4 μ 1，37°C过夜，1. 0% (前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测。将检测正确的阳性重组克隆命名为pMD18-BnRabOTI3 (将目的基因序列BnRab⑶13连入pMD18_T载体构建而成，以下相同)，为了确保载体中启动子的序列信息，将PMDlS-BnRab⑶13送上海英骏公司进行测序，分析结果显示，获得了一种分离的油菜BnRab⑶13基因全长，其序列为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。通过在线软件Genescan(http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)分析得到该基因的⑶S序列以及氨基酸序列。将基因的⑶S序列与拟南芥⑶S序列通过NCBI比对分析，发现该段区域中含有完整的ORF阅读框及起始密码子ATG。获得了一种分离的油菜BnRabGDI3蛋白全长，其序列为SEQ ID N0:2所示氨基酸序列。对蛋白质的分子量和理论等电点进行在线计算(http://us. expasyorg/tools/pi tool.htm)。BLAST 发现 BnRabGDI3 与 AtRabGDI3CDS核苷酸同源性大于90%，利用DNA MAN以及在线软件TCOFFEE (http://www. tcoffee.org/)它们的氨基酸同源性达到97%。结果表明所克隆的油菜Rab⑶13是AtRab⑶13的同·源基因，将其命名为BnRab⑶13。通过 GSDS (Gene Structure Display Server) (http: //gsds. cb1. pku. edu. cn/)分析预测发现BnRab⑶13与AtRab⑶13基因结构非常相似。该基因起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。含有12个外显子，11个内含子，每个内含子、外显子的大小、分布等都与AtRabGD13 相同。通过在线软件 Genescan (http://genes. mit. edu/GENSCAN. html)分析得到该基因的⑶S序列以及氨基酸序列。BLAST发现与AtRab⑶13⑶S核苷酸同源性大于90%，AtRab⑶13和BnRab⑶13同源基因分别编码了 445、436个氨基酸。应用SOPMA预测发现两个基因所编码蛋白在二级结构上非常保守，其α螺旋、延伸链、β转角和不规则卷曲等组成比例极为相似。通过在线软件 ProtScale(http://www. expasy. ch/tools/protscale.html)分析二者氨基酸的亲疏水性的排布较一致，两序列大部分的氨基酸在O轴线的下方，因此大部分的氨基酸属于亲水氨基酸。我们利用TMHMM在线软件(http://www. cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)对2个Rab⑶13蛋白的跨膜结构域进行了分析。拟南芥和甘蓝型油菜的蛋白序列的AAs值表明两条序列没有信号肽段，没有明显的跨膜区域，且两个蛋白序列的N-1n值都较低，因此Rab⑶13不是一个膜蛋白。应用PSORT程序(http://psort. hgc.jp/)对其进行亚细胞定位分析，结果表明该蛋白可能存在于细胞质中。软件预测结果与GDI在Rab蛋白循环中的作用环境一致。因此BnRab⑶13和其他⑶I基因一样在Rab蛋白调控囊泡转运过程中起着重要作用，具有控制囊泡运输的功能。本发明通过构建RabGDI3的RNA干扰载体转化拟南芥后发现，转基因植株由于RabGDI3的表达受到抑制而均出现了雄性不育的表型。说明RabGDI3具有控制拟南芥花药发育和花粉育性的新功能。2、油菜BnRab⑶13基因的表达模式本发明所用另一种油菜为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)显性核不育杂合不育系JOSAI^Msmsrfrf^msmsrfrf )。系经多年回交和姐妹交而育成。不育株命名为A,可育株命名为B，二者可视为一对近等基因系，仅存在不育位点差异(胡胜武，于澄宇，赵惠贤，路明，油菜显性核不育材料Shaan — GMS纯合两型系803AB的选育。西北农业学报，2002，ii (4)25 - 2)。供试材料播种于大田，正常田间管理。从同一大田生长条件相同的可育植株上取根、茎、叶、花蕾、角果，从花蕾中解剖分离雌蕊和雄蕊(花药)，每种材料至少取三个重复，每个重复至少一株，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，-80°C保存。在大田分别从油菜可育植株和不育植株上取花蕾，带回实验室后，在冰盒上分别挑取可育植株和不育植株花蕾中的雄蕊和雌蕊，每种材料至少取三个重复，每个重复至少一株，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，_80°C保存。提取RNA时,在液氮中将植物样品研磨至粉状,利用Trirol提取试剂盒(购自Invitrogen公司，以下相同)的要求进行RNA的提取。所提总RNA溶于无RNase的双蒸水中。DNase I (购自Promega公司，以下相同)去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪(DU 650 BECKMAN，USA)分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1% (质量体积比)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板，根据Promega公司逆转录酶的说明进行逆转录，得到的cDNA分装后于_80°C保存备用。荧光定量PCR仪为IQ5 (美国伯乐公司)，采用油菜Actin作为内标基因(登录号 AF111812)，Actin 基因引物为 5 ' CTGGAATTGCTGACCGTATGAG3 '和5 ' ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG 3 '。根据拟南芥和油菜Rab⑶13基因CDS序列的保守区段设计的BnRab⑶13基因引物为5 ' -CCCCGACTACTATGGAGGAGAA-3 '和5' -AGCGTGTGGATTAGGGTTTGA-3'。
荧光定量PCR反应每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。分别检测BnRab⑶13在油菜组织(根、茎、叶、花、角果，大、中、小花蕾，雄蕊、雌蕊)中的表达。用比较Ct法(Λ ACt)计算基因的相对表达量。通过2_Λ w估算目的基因的相对表达量和系统误差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001, Analysis of RelativeGeneExpression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2_& &CT Method.METHODS 25，402 - 408.)。在计算相对表达量时，以根的样本为参照，即将其值转换成I (标准值)，其它样品再与其比较，获得相对表达值。3、Rab⑶13基因的功能验证3.1Rab⑶13基因人工微RNA干扰植物表达载体pamiRNAi_AtRab⑶13的构建为了研究本发明中的花粉高效表达基因BnRab⑶13的功能，采用了 amiRNAi(artif icialmicroRNA interference,人工微RNA干扰，以下相同)技术。由于油菜BnRabGD13和拟南芥的RabGDI3具有相似的表达模式、基因结构(李振波.油菜小孢子发育相关基因BnRabGDI3的功能研究.[硕士学位论文].湖北武汉中南民族大学)以及90%以上的蛋白同源性，推测两者具有相同的功能，因此油菜BnRabGDI3的功能是通过研究拟南芥AtRab⑶13的功能获得的。人工微RNA干扰载体的构建原理如图3所示(SchwabR. ,Ossowski S. , Riester M. , et al. Highly specific gene silencing by artificialmicroRNAs in Arabidopsis. Plant Cell, 2006，18 (5) : 1121-1133)。选取的革巴序列为TTACACAGCACTCAAACGTGG，相应的 Oligo DNA 为AATGTGTCGTGAGTTTGCACC。在此方法基础上Yan等发明提出了一种快速高效的植物人工微RNA表达载体的构建方法(Yan H.，DengX. , et al. A novel approach for the construction ofplant amiRNA expressionvectors. Journal of Biotechnology, 2011, 151:9_14),参照上述文献报道方法完成了本实验中人工微RNA干扰载体pamiRNA1-AtRab⑶13的构建。通过冻融法(J.萨姆布鲁克.D. W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，以下相同)将含有上述获得的pamiRNA1-AtRabGDI3载体的质粒转化农杆菌EHA105 (购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同)步骤如下
1:取O. 2ml感受态农杆菌，于冰中缓慢融化。2 :加入约2 μ g重组质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min后，投入液氮速冻lmin，然后37°C水浴5min，融化细胞。3 :加入800 μ I不含抗生素LB液体培养基(前面已述)，28°C轻摇培养4_5h。4:12000rpm，30s，去上清，细胞重悬于O. 2ml LB液体培养基(前面已述)培养基。5 :将培养物均匀涂布在含Rif (50mg/L)和Str (50mg/L)的LB固体培养基(前面已述)琼脂板上，28°C培养2天，待平板上出现转化子 后挑菌，以BarF:5' -TTTCGGTGACGGGCAGGAC-3'和 BarR:5' -CTGCACCATCGTCAACCAC-3'为引物进行菌落PCR检测。检测方法如下是用灭菌的牙签挑取少量菌斑做模板，反应体系为10 μ I 内含模板 DNA 模板 I μ L(约 IOOng)，IOXTaq buffer (含 MgCl 2)1 μ I,1. 5mmol/L dNTP (IOmmoI/L) I μ 1，5，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ l，Taq(5U/μ 1)0. 5μ l，ddH20 5· 5μ I。反应条件为 94°C 5 分钟，94°C 30 秒，55。。80 秒，72。。I 分钟，32个循环，72°C 10分钟，扩增大小为1028bp。将pamiRNA1-AtRab⑶13转入根癌农杆菌EHA105 (前面已述)，用利福平(50μ g/mL)抗性平板筛选，挑取菌斑，菌落PCR检测验证(前面已述)。3. 2amiRNAi植物表达载体pamiRNA1-AtRab⑶13在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选采用花序侵染法(Zhang X. R. et al.Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsisthaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1:1-6,以下相同)进行拟南芥转化。制备含有重组载体pamiRNA1-AtRab⑶13的根癌农杆菌EHA105 (前面已述)菌液，在转化前一天转入含有利福平50 μ g/ml的LB液体培养基((前面已述)中，28 °C过夜培养。第二天，用紫外分光光度计(SPEK0L 1300)于276nm纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值达到在1. 6-2. O之间时取出。室温(20-25°C，以下相同)以4000g离心IOmin,弃上清，沉淀悬浮于等体积的5%蔗糖溶液(蔗糖与蒸馏水的质量体积比，以下相同)中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0. 02% (体积比)的Silwet1-77 (购自北京五洲元业科贸中心，以下相同)。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15秒，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的TO代种子播在混有PNS营养液的蛭石中，(PNS营养液成份为每升含 5ml IM KN03，2ml IM Ca (N03) 2 . 4H20, 2ml IM MgS04 . 7Η20，2· 5ml 20mMFe. EDTA, 2. 5ml IM磷酸缓冲液(pH5. 5)，Iml MS微量元素)。转移到温度20-25 °C，光照强度5000-10000流明，光周期为16小时光照/8小时黑暗，空气湿度大于80%以上的培养间中，正常管理。根据表达载体上特有的草胺磷(Bar)抗性筛选阳性植株。拟南芥长出一片真叶后，喷洒30ppm的除草剂Basta (购自拜尔公司)。一星期后，喷洒50ppm的Basta，获得拟南芥转基因阳性苗。筛选得到的转化植株，称Tl代转化植株(以下相同)。叶片长到足够大小时(3-4叶期)，取少许绿苗叶片，提取DNA (前面已述)，进行转化材料的PCR阳性检测(以下相同)。引物序列为BarF: 5 ' -TTTCGGTGACGGGCAGGAC-3 '和BarR: 5 ' -CTGCACCATCGTCAACCAC-3 '，反应体系为 10 μ I 内含模板 DNA 模板 I μ L (约IOOng)，IOXTaq buffer (含 MgCl 2) I μ 1，1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’ 弓丨物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，3，引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 5· 5μ I。反应条件为94°C 5分钟，94°C 30秒，55°C 80秒，72°C I分钟，32个循环，72°C 10分钟，扩增大小为1028bp。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测(前面已述)，结果表明，Rab⑶13基因人工微RNA干扰植物表达载体PamiRNA1-AtRab⑶13已经成功转入拟南芥。共获得了 11株转基因阳性植株(含有检测目的片段的植株称阳性植株，以下相同，图4)，分别命名为ΜΙ-1，ΜΙ-2等(以下相同)。3. 3人工微RNA干扰载体pamiRNA1-AtRab⑶13转基因拟南芥表型观察经过除草剂筛选和PCR检测后获得的转基因阳性植株在生长间中正常管理并观察其表型。在开花期，选取各个转基因植株的分支顶端已经漏白但未开放的花朵，拨开花蕾。在放大镜(3倍)以及体视显微镜(OLYMPUS SZ61TRC)下观察花药以及花粉。用解剖针分离出花药，参照亚历山大染色法(Alexander, M. P. Differential staining of abortedandnon-aborted pollen. Stain Technol,, 44:117-122. , 1969,以下相同)，40 °C 水浴加 热亚历山大染色液(以配制大约100毫升染色液为例乙醇10ml，1%的孔雀石绿酒精溶液lml，蒸馏水50ml，甘油25ml，1%的酸性品红水溶液5ml，1%的橙黄G水溶液0. 5ml，冰醋酸
l-4ml，苯酚5克，水合氯醛5克，以下相同)并浸泡花药过夜(10-15小时)，用压片法在显微镜(OLYMPUS 1X71)下观察小孢子。通过观察并统计正常小孢子(染成桔红色)和败育小孢子(染成绿色)的比例判断小孢子的败育程度。结实期用肉眼观察转基因拟南芥的结实情况。染色观察结果显示野生型拟南芥的花药饱满并且充满了小孢子，小孢子均染成橘红色，说明小孢子发育正常。而转基因拟南芥的花药中小孢子数目都远远少于野生型，有少量正常的小孢子数目，其它均为空瘪或被染成绿色的败育的小孢子(图5)。经过对所有转基因后代植株进行观察统计，结果显示大部分转基因后代拟南芥均出现了雄性不育表型，说明AtRabGDI3干扰转基因植株出现了典型的雄性不育表型。4、BnRab⑶13基因的互补功能验证4.1BnRab⑶13基因过表达植物表达载体OX-BnRab⑶13的构建和根癌农杆菌菌株EHA105的转化。为了进一步证实油菜BnRab⑶13基因和拟南芥AtRab⑶13基因具有相同的功能，我们构建BnRab⑶13基因过表达植物表达载体，转化拟南芥。用获得的OX-BnRab⑶13转基因后代为父本，以人工微RNA干扰的pamiRNA1-AtRabGDI3雄性不育转基因后代为母本进行杂交，检测杂交后代植株的花药育性是否能够得到恢复。过表达载体的构建方法如下油菜花期，在田间收集油菜花蕾，投入液氮速冻。按照Trirol提取试剂盒(购自Invitrogen公司，前面已述)的要求提取中双九号(前面已述)花蕾的RNA,以获得的RNA为模板，根据Promega公司逆转录酶的说明进行逆转录(前面已述)，得到的cDNA分装后于_80°C保存备用。以获得的花蕾cDNA为模板进行BnRab⑶13基因⑶NA片段的PCR扩增。根据甘蓝型油菜BnPABP5基因序列(SEQ ID NO:1)设计引物，Rab⑶I3F:GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG和 Rab⑶I3R:GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC。引物序列的 5'末端分别引AT XbalI和SacI限制性内切酶位点。PCR反应体系为25 μ L内含:1 XPCR buffer, MgCI1.5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L (毫摩尔每升)、引物浓度为0. 5mol/L,Pfu酶1. 5单位,模板约100ng。PCR 反应程序如下-MV 5min ；94°C 30sec, 55°C 45sec, 72°C lmin，35 个循环；72° C延伸8min。PCR产物经1. 0% (质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测(前面已述)。完成后用凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段(前面已述)，获得BnRab⑶13基因⑶NA全长序列。用获得的BnRab⑶13基因⑶NA全长序列替换pBI121植物表达载体中的⑶S基因序列，获得BnRab⑶13基因的植物过表达载体。为完成此目的，首先用Xba I/SacI双酶切(2种酶购自TaKaRa公司)BnRab⑶13基因 CDNA 片段，同时用 Xba I/SacI 酶切 pBI121 (Chen, P. Y. , Wang, C. K.，Soong, S. C. To, Κ.Y. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloningT-DNAinsertion from transgenic plants. Mol. Breed. 11，287-293)质粒的 GUS 片段。酶切体系为10 μ I (前面已述)，酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1% (质量体积比)琼脂糖胶电泳检测。 将BnRab⑶13基因⑶NA片段的酶切产物和克隆载体ρΒΙ121上切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒(前面已述)回收。按BnRab⑶13基因⑶NA片段的酶切产物比ρΒΙ121载体片段(150ng BnRab⑶13基因⑶NA片段50ng载体片段)=3:1的比例(摩尔浓度t匕)混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，10 X反应缓冲液，无菌水补充体积至20 μ L，16°C连接过夜。转化后，在含有卡那霉素(50 μ g/mL)固体LB平板上筛选，挑斑后以NPT II F 5' -GATGGATTGCACGCAGGT-3'和 NPT II R 5/ -TCAGAAGAACTCGTCAAG-3 '引物进行菌落PCR检测。菌落PCR具体方法(以下相同)是用灭菌的牙签挑取少量菌斑做模版，反应体系为 IOyL 内含10XTaq buffer (含 MgCl 2) I μ I,1. 5mmol/L dNTP (I Ommo I/L) I μ 1，5，弓 I物(10 μ mol/L) 0. 5 μ 1，3，引物(10 μ mol/L) 0. 5 μ 1，Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 6· 5μ I。反应条件为94°C 5分钟，94°C I分钟，55°C 30秒，72°C 2分钟30秒，33个循环，72 °C 10分钟，扩增大小为800bp，1. 0% (前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测大小正确后。以BarF和BarR(前面已述)为引物进行做菌落PCR (前面已述)，选择阳性菌株提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为OX-BnRab⑶13。然后利用冻融法(前面已述)将OX-BnRab⑶13转入根癌农杆菌EHA105 (前面已述),卡那霉素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)双抗性平板筛选,挑斑,进行菌落PCR检测验证(前面已述)。4. 20X_BnRab⑶13在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选采用花序侵染法进行拟南芥转化(前面已述)。在转化拟南芥前一天，将制备含有载体OX-BnRab⑶13的根癌农杆菌EHA105 (前面已述)菌液转入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50μ g/ml的LB液体培养基中，28°C过夜培养。第二天，用紫外分光光度计(SPEK0L1300)于276纳米波长下检测吸光值，当菌液的吸光值在1.6-2. O之间时取出。室温(20-25°C,以下相同)以4000g离心IOmin,弃上清,沉淀悬浮于等体积的5%(质量体积比)鹿糖中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0. 02%(体积比)的Silwet
1-77 (购自北京五洲元业科贸中心，以下相同)。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15秒，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的TO代种子用70%(体积比)酒精和0. 01% (体积比)的升汞表面消毒10分钟后用蒸馏水洗涤数次(5 7次)，然后均匀地吹打到MS固体筛选培养基(MS大量元素母液100ml ;MS微量元素母液10ml ;MS有机母液10ml ；MS铁盐IOml ;肌醇IOml ;蔗糖30g ;用IM NaOH调PH至5. 8，12g琼脂粉，定容至1L，高压121度灭菌后备用。加入Sg琼脂粉可配置成固体培养基。各种母液配方见表I)表面。4°C春化4-6天，放入恒温培养箱培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。叶片长到足够大小时(3-4叶期)，取少许绿苗叶片进行PCR阳性检测，引物为NPT II F 和NPT II R(前面已述)，反应体系为10 μ I。内含:模板DNA I μ L (约IOOng)，10 X Taqbuffer(含 MgCl 2) I μ 1，1. 5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’ 引物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，3’ 引物(10 μ mol/L)O. 5 μ l,Taq(5U/y 1)0. 5 μ l,ddH20 5· 5μ I。反应条件为 94°C 5 分钟，94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分钟，32个循环，72°C 10分钟，扩增大小为800bp。结果表明(图7)获得了转基因阳性植株(含有检测目的片段的植株称阳性植株，以下相同)。将阳性植株自交3代以上，获得8个纯合T3代株系。分别命名为OX-1，0X-7等(以下相同)。表IMS培养基母液配方
权利要求
1.一种分离的基因，其序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种分离的多肽，其序列为SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的一种分离的基因在控制拟南芥花粉育性中的应用。
4.权利要求2所述的一种分离的多肽在控制拟南芥花粉育性中的应用。
5.权利要求1所述的一种分离的基因在控制油菜花粉育性中的应用。
6.权利要求2所述的一种分离的多肽在控制油菜花粉育性中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种油菜BnRabGDI3基因及其应用，一种分离的基因，其序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示。RabGDI3是一种GDP解离抑制剂，是RabGDP/RabGTP转化过程所需的调控因子之一，在Rab蛋白调控囊泡转运过程中起着重要作用。BnRabGDI3在油菜花药和小孢子中呈显著的优势表达。干扰拟南芥AtRabGDI3基因的表达能够使其小孢子败育。利用过表达BnRabGDI3的转基因拟南芥作为父本，和干扰RabGDI3基因的转基因拟南芥授粉，杂交后代植株的花药和花粉育性得到恢复。这一互补实验证实油菜BnRabGDI3和拟南芥AtRabGDI3具有相同的功能控制油菜、拟南芥花药发育以及花粉育性。通过基因工程技术调控RabGDI3的表达水平可以控制花粉的育性，创造雄性不育系材料和恢复系材料，可用于雄配子发育研究及农作物品质改良。
文档编号C12N15/29GK103014018SQ20121049454
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者刘胜毅, 董彩华, 黄军艳, 李振波, 童超波, 刘越英, 程晓辉 申请人:中国农业科学院油料作物研究所