专利名称：同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子。
背景技术：
近年来，转基因生物技术在农业生产中得到广泛应用，世界各国正在不断完善转基因生物的检测方法研究，加强对转基因原料及其产品的安全监督。其中核酸检测技术已成为转基因生物检测的最主要和常用的方法。在现有技术条件下外源基因是以随机的方式插入作物基因组的，因此每个转基因作物品种中外源插入片段与作物基因组DNA结合位点的边界序列应该是唯一的，根据边界序列设计引物，从而可以鉴定出转基因作物的品系，即品系特异性检测。然而，不论采用基于核酸或蛋白质的方法，在转基因检测时均必须使用标准物质 (Reference materials)作为阳性对照或制作标准曲线，以对转基因产品进行准确检测。标准分子(Reference molecule)是一种重组质粒分子，其一般包含转基因作物检测的外源基因或品系特异性片段以及物种特异性片段。由于操作简便、生产成本低、容易获得高纯度和高浓度DNA样品。近年来标准分子被认为是解决转基因作物检测标准物质缺乏的有效途径之一，已作为新型DNA标准物质用于转基因作物检测和定量分析。目前，全世界已有20多个转基因油菜品系进入商业化种植，其中孟山都公司的抗草甘磷品系RT73(GT73)和拜耳公司的6个抗除草剂品系(MS8XRF3，MS1 XRF1，MS1 XRF2， 0xy235, Topas 19/2和T45)于2004年3月通过我国农业部的安全性评估并获得加工原料进口许可。迄今为止，还没有同时将以上7种转基因油菜品系外源基因构建标准分子的报道。为了给中国转基因油菜品系监管提供必要的技术支撑，以及为了简化多种转基因油菜品系的检测，有必要开发适于多种转基因油菜品系特异性检测的、稳定可靠的通用型标准分子。
发明内容
本发明的目的在于提供可满足多种转基因油菜品系特异性检测的、稳定可靠的通用型标准分子。在本发明的第一方面，提供一种重组质粒，其包含(较佳地为5’ 一 3’)以下序列片段MSl 5，端品系特异性序列(MS1-5) ；RT73 3，端品系特异性序列(RT73-3) ；RF33，端品系特异性序列(RF3-3) ；MS8 3’端品系特异性序列(MS8-3) ；0xy235 5’端品系特异性序列(0XY235-5) ；MS8 5，端品系特异性序列(MS8-5) ；RF3 5，端品系特异性序列(RF3-5)； T45 5，端品系特异性序列(T45-5) ；Topasl9/2 3，端品系特异性序列(Topas) ；RF2 5，端品系特异性序列(RF2-5) ；0xy235 3’端品系特异性序列(0XY235-3) ；RFl 5’端品系特异性序列(RF1-5)；油菜内源标准基因HMG序列片段；油菜内源标准基因PEP序列片段。
在另一优选例中，所述的RFl 5’端品系特异性序列(RF1-5)与MSl 5’端品系特异性序列(MS1-5)之间距离大于2000bp ；或所述的RF25’端品系特异性序列反向连接入重组质粒中。在另一优选例中，所述的MSl 5，端品系特异性序列(MS1-5)如SEQ ID N0:1所示；所述的RT73 3，端品系特异性序列(RT73-3)如SEQ ID NO 2所示；所述的RF33， 端品系特异性序列(RF3-3)如SEQ ID NO :3所示；所述的MS8 3，端品系特异性序列 (MS8-3)如SEQ ID NO :4所示；所述的0xy235 5，端品系特异性序列(0XY235-5)如SEQ ID NO :5所示；所述的MS8 5，端品系特异性序列(MS8-5)如SEQ ID NO :6所示；所述的RF3 5， 端品系特异性序列(RF3-5)如SEQ ID N0:7所示；所述的T455，端品系特异性序列(T45-5) 如SEQ ID N0:8所示；所述的Topasl9/2 3’端品系特异性序列(Topas)如SEQ ID NO 9 所示；反向的RF2 5，端品系特异性序列(RF2-5)如SEQ ID NO 10所示；所述的0xy235 3， 端品系特异性序列(0XY235-3)如SEQ IDNO 11所示；或所述的RFl 5，端品系特异性序列 (RF1-5)如 SEQ ID NO 12 所示。在另一优选例中，所述的油菜内源标准基因HMG序列片段如SEQ ID NO 13所示； 或所述的油菜内源标准基因PEP序列片段如SEQ ID N0:14所示。在另一优选例中，所述的重组质粒中还包括来源于动物⑶C37的基因片段。在另一优选例中，所述的来源于动物⑶C37的基因片段如SEQ ID NO 15所示。在另一优选例中，所述的重组质粒的大小为7000_10000bp。在另一优选例中，所述的重组质粒的大小为7500_8500bp。在另一优选例中，所述的重组质粒的骨架质粒是pEASY-T3载体。在本发明的另一方面，提供所述的重组质粒的用途，用于作为标准分子，检测转基因油菜RT73品系、MSl X RFl品系、MS1XRF2品系、MS8XRF3品系、T45品系、0xy235品系和/或Topas 19/2品系。在另一优选例中，所述的标准分子是通用型标准分子。在本发明的另一方面，提供一种检测转基因油菜RT73品系、MS1XRF1品系、 MS1XRF2品系、MS8XRF3品系、T45品系、0xy235品系和/或TopasWA品系的方法，所述方法包括以所述的重组质粒为标准分子，测定待测油菜样品中相应的转基因油菜RT73品系、MS1XRF1 品系、MS1XRF2 品系、MS8XRF3 品系、T45 品系、0xy235 品系或 Topasl9/2 品系特异性序列的存在与否以及存在量；若待测油菜样品中存在RT73 3’端品系特异性序列，则表明该样品含有RT73品系；若待测油菜样品中存在MSl 5’端品系特异性序列以及存在RFl 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MSl XRFl品系；若待测油菜样品中存在MSl 5’端品系特异性序列以及存在RF2 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MSl X RF2品系；若待测油菜样品中存在MS8 3’端品系特异性序列和/或5’端品系特异性序列，以及存在RF3 3’端品系特异性序列和/或5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MS8XRF3 品系；
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若待测油菜样品中存在T45 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有T45品系；若待测油菜样品中存在0xy235 5’端品系特异性序列和/或3’端品系特异性序列，则表明该样品含有0xy235品系；若待测油菜样品中存在TopaS19/2 3’端品系特异性序列，则表明该样品含有 Topasl9/2 品系。在另一优选例中，采用PCR的方法扩增待测油菜或其来源样品中MS1 5’端品系特异性序列(MS1-5) ；RT73 3’端品系特异性序列(RT73-3) ；RF3 3’端品系特异性序列 (RF3-3) ；MS8 3，端品系特异性序列(MS8-3) ；0xy235 5，端品系特异性序列(0XY235-5)； MS8 5，端品系特异性序列(MS8-5) ；RF3 5，端品系特异性序列(RF3-5) ；T45 5，端品系特异性序列(T45-5) ；Topasl9/2 3’端品系特异性序列(Topas) ；RF2 5’端品系特异性序列(RF2-5) ；0xy235 3，端品系特异性序列(0XY235-3)和/或RFl 5，端品系特异性序列 (RF1-5)；以及油菜内源标准基因HMG序列片段和/或油菜内源标准基因PEP序列片段；将获得的扩增结果与同样扩增条件下扩增的重组质粒的扩增结果进行比较，从而获得待测油菜及其来源样品中转基因油菜品系的存在与否以及存在量。在本发明的另一方面，提供一种检测转基因油菜RT73品系、MS1XRF1品系、 MS1XRF2品系、MS8XRF3品系、T45品系、0xy235品系和/或Topasl9/2品系的试剂盒，含有所述的重组质粒。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有扩增所述的MSl 5’端品系特异性序列、 所述的RT73 3’端品系特异性序列、所述的RF3 3’端品系特异性序列、所述的MS8 3’端品系特异性序列、所述的0xy235 5’端品系特异性序列、所述的MS8 5’端品系特异性序列、所述的RF3 5’端品系特异性序列、所述的T45 5’端品系特异性序列、所述的TopaS19/2 3’ 端品系特异性序列、所述的RF2 5’端品系特异性序列、所述的0xy235 3’端品系特异性序列、所述的RFl 5’端品系特异性序列、油菜内源标准基因HMG序列片段和/或油菜内源标准基因PEP序列片段的引物。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有选自以下的试剂PCR扩增试剂(如DNA 聚合酶)，电泳相关试剂(如琼脂糖)，DNA分子量标记，使用说明书等。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、标准分子pCan0la9结构示意图和插入序列。其中，MS1-5，MSl品系5’端品系特异性序列；RT73-3，RT73品系3’端品系特异性序列；RF3_3，RF3品系3’端品系特异性序列；MS8-3，MS8品系3’端品系特异性序列；0xy235_5，0xy235品系5’端品系特异性序列； MS8-5，MS8品系5，端品系特异性序列；RF3-5，RF3品系5，端品系特异性序列；T45-5, T45 品系5’端品系特异性序列；T0pas，T0pas19/2品系3’端品系特异性序列；RF2_5，RF2品系 5，端品系特异性序列；0xy235-3,0xy235品系3，端品系特异性序列；RF1_5，RF1品系5，端品系特异性序列；PEP，油菜内标准基因PEP片段；HMG，油菜内标准基因HMG片段；CDC37，一段来源于动物CDC37的基因片段，用于将内标准基因与品系特异性片段间的距离加大。图2、标准分子普通PCR特异性检测。(A)以标准分子pCan0la9为模板的扩增。
6(B)分别以油菜 T45，RFl, RF2, RF3, MSI, MS8, 0xy235, Topasl9/2 品系，转基因玉米 BT176, NK603和M0N863品系基因组DNA为模板的扩增。(C)以非转基因油菜基因组DNA为模板的扩增。M :DL2000分子量标记；泳道1 空白对照；泳道2-12 转基因油菜RT73品系，内源片段 PEP，内源片段 HMG，转基因油菜 T45, RFl，RF2, RF3, MSl，MS8, 0xy235 和 Topasl9/2 品系特异性序列扩增。泳道13-15 转基因玉米BT176，NK603和M0N863品系特异性序列扩增。图3、标准分子普通PCR检测灵敏度测试。(A)PEP片段；(B)HMG片段；(C) RT73品系特异性片段；(D)T45品系特异性片段；(E)Topasl9/2品系特异性片段；(F)0xy235品系特异性片段；(G)MSl品系特异性片段；(H)MSS品系特异性片段；⑴RFl品系特异性片段；(J) RF2品系特异性片段；(K)RF3品系特异性片段。泳道1为空白对照；泳道2_8分别为50000、 5000、500、50、20、10和5拷贝标准分子DNA的扩增；M为DL2000分子量标记。箭头示扩增产物大小。图4、实时荧光扩增标准曲线图。㈧内源片段PEP实时荧光PCR扩增标准曲线； ⑶内源片段HMG实时荧光PCR扩增标准曲线；(C) RT73品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(D)T45品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(E)RFl品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(F) RF2品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(G) RF3品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(H) MSl品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(I)MSS品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(J) 0xy235品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(K)TopaS19/2品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线。
具体实施例方式针对目前转基因油菜产品检测标准物质缺乏的难题，本发明人经过深入的研究， 构建了同时适于转基因油菜RT73品系、MSl X RFl品系、MSlX RF2品系、MS8XRF3品系、T45 品系、0xy235品系和/或TopaS19/2品系特异性检测的通用型标准分子(即本发明的重组质粒)，其包含以下序列片段MS1 5’端品系特异性序列；RT73 3’端品系特异性序列；RF3 3’端品系特异性序列；MS8 3’端品系特异性序列；0xy235 5’端品系特异性序列；MS8 5’端品系特异性序列；RF3 5’端品系特异性序列；T45 5’端品系特异性序列；TopaS19/23’端品系特异性序列；RF2 5’端品系特异性序列；0xy235 3’端品系特异性序列；RFl 5’端品系特异性序列；油菜内标准基因HMG和PEP片段。对所述标准分子在定性和定量检测中的适用性进行验证表明，所述的标准分子高度特异于上述转基因油菜品系的检测。特异性序列为了构建特异性好、稳定性高、灵敏度高、适用性广的通用型标准分子，本发明人经过了反复的研究，找到了合适的基因片段。所述的基因片段是转基因油菜MS15’端品系特异性序列；RT73 3’端品系特异性序列；RF3 3’端品系特异性序列；MS8 3’端品系特异性序列；0xy235 5’端品系特异性序列；MS8 5’端品系特异性序列；RF3 5’端品系特异性序列；T45 5’端品系特异性序列；TopaS19/23’端品系特异性序列；RF2 5’端品系特异性序列；0xy235 3’端品系特异性序列；RFl 5’端品系特异性序列。较佳地，还克隆了油菜内源标准基因HMG和PEP片段。将上述序列片段共同构建入适当的质粒(载体)中，从而用于转基因油菜RT73品系、MSl X RFl品系、MSlX RF2品系、MS8XRF3品系、T45品系、0xy235品系和/或TopaS19/2品系的特异性鉴定。
由于以上的基因片段中，多个片段间同源性很高，如RFl与MSl序列。因此，作为本发明的优选方式，为了防止标准分子作为标准品进行PCR扩增中出现非目标扩增，在标准分子设计中将同源性很高的片段尽量分开，距离在2kb以上，对于无法分开的片段，采用反向插入的方法。因此，更佳地，所述的RF2 5’端品系特异性序列反向连接入重组质粒中。作为本发明的优选方式，所述的MSl 5，端品系特异性序列(MS1-5)如SEQ IDNO 1 所示；所述的RT73 3，端品系特异性序列(RT73-3)如SEQ ID NO 2所示；所述的RF3 3，端品系特异性序列(RF3-3)如SEQ ID NO :3所示；所述的MS8 3，端品系特异性序列(MS8-3) 如SEQ ID NO :4所示；所述的0xy235 5，端品系特异性序列(0XY235-5)如SEQ ID NO 5 所示；所述的MS8 5，端品系特异性序列(MS8-5)如SEQ ID NO 6所示；所述的RF3 5，端品系特异性序列(RF3-5)如SEQ ID NO :7所示；所述的T45 5，端品系特异性序列(T45-5) 如SEQ ID NO 8所示；所述的Topasl9/23’端品系特异性序列如SEQ ID NO 9所示；所述的RF2 5，端品系特异性序列(RF2-5)如SEQ ID NO :10(反向序列)所示；所述的0xy235 3，端品系特异性序列(0XY235-3)如SEQ ID NO 11所示；或所述的RFl 5，端品系特异性序歹Ij (RF1-5)如 SEQ ID NO 12 所示。本发明人经过大量的试验发现，采用以上SEQ ID NO :1_12所示序列的片段作为检测的目的片段，不仅PCR扩增效果良好，而且检测结果最为准确，其全面地涵盖了转基因油菜各品系检测所需的特异性检测区域，适用性广。作为本发明的优选方式，所述的油菜内源标准基因HMG序列片段的核苷酸序列如 SEQ ID N0:13所示。作为本发明的优选方式，所述的油菜内源标准基因PEP序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 14所示。重组质粒上述的三种序列片段插入到适当的质粒(载体)中，构成重组质粒(重组载体)， 作为本发明的标准分子。所述的重组质粒的骨架质粒可以有多种的选择，可以是一些商业化的质粒。作为本发明的优选方式，所述的骨架质粒的大小约为2000-5000bp ；较佳地约为2000-4000bp ； 较佳地约为2500-4000bp ；较佳地约为2500-3500bp。上述的骨架质粒在构建成本发明的重组质粒后，重组质粒的大小范围约在7000-10000bp ；较佳地约为7500-8500bp。本发明人在研究中发现，适当大小的重组质粒，稳定性好，PCR扩增效果良好，有利于获得准确、稳定的检测结果。一些具体的骨架质粒例如但不限于pEASY系列的载体、T系列载体、pUC系列载体、PBR系列载体等。作为本发明的优选方式，所述的骨架质粒是pEASY系列的载体(如 PEASY-T3 载体)。以上的序列片段较佳地插入到质粒的多克隆位点中，形成串联的形式。所述的序列片段在载体上的前后次序可以是变化的。只要它们能够被引物识别和扩增。作为本发明的优选方式，同源性较高的序列片段，在重组质粒上的间距大于2000bp ；较佳地，RFl 5’端品系特异性序列(RF1-5)与MSl 5，端品系特异性序列(MS1-5)之间距离大于2000bp。作为本发明的另一优选方式，所述的RF2 5’端品系特异性序列反向连接入重组质粒中，作为本发明的最优选方式，所述的序列片段在载体上的次序，从5’ 一3’端，为 MSl 5，端品系特异性序列(MS1-5) ；RT73 3，端品系特异性序列(RT73-3) ；RF3 3，端品系
8特异性序列(RF3-3) ；MS8 3’端品系特异性序列(MS8-3) ；0xy235 5’端品系特异性序列 (0XY235-5) ；MS8 5，端品系特异性序列(MS8-5) ；RF3 5，端品系特异性序列(RF3-5) ；T45 5’端品系特异性序列(T45-5) ；Topasl9/2 3’端品系特异性序列(Topas) ；RF2 5’端品系特异性序列(RF2-5) ；0xy235 3’端品系特异性序列(0XY235-3) ；RFl 5’端品系特异性序列 (RF1-5)；油菜内源标准基因HMG序列片段；油菜内源标准基因PEP序列片段。作为本发明的最优选方式，所述的重组质粒中，还包括一段来源于动物⑶C37的基因片段，用于将内标准基因与品系特异性片段间的距离加大，从而有利于多重PCR扩增的需要。检测方法本发明还提供了一种检测转基因油菜RT73品系、MSl X RFl品系、MSlX RF2品系、 MS8XRF3品系、T45品系、0xy235品系和/或Topasl9/2品系的方法，所述方法包括以所述的重组质粒为标准分子，测定待测油菜样品中各转基因油菜品系相应的特异性序列的存在与否以及存在量。在获得了本发明提供的标准分子后，本领域技术人员均了解如何进行待测油菜样品进行检测。以本发明的重组质粒作为标准分子，通常采用聚合酶链反应(PCR)的方法来进行品系的鉴定，也可采用基于核酸的其它检测方法，如芯片检测。一种检测转基因油菜各品系的方法是采用PCR的方法扩增待测油菜或其来源样品中各转基因油菜品系相应的特异性序列以及油菜HMG或PEP序列片段；将获得的扩增结果与同样扩增条件下扩增的重组质粒的扩增结果进行比较，从而获得待测油菜或其来源样品中各转基因油菜品系的存在与否以及存在量。利用本发明的标准分子，可以构建出标准曲线，分别计算各种基因片段的量(拷贝数)。聚合酶链反应(PCR)是本领域技术人员公知的技术。在本发明的实施例中，制备了标准分子pCanolag，其高度特异于转基因油菜 RT73品系、MSl X RFl品系、MS1XRF2品系、MS8XRF3品系、T45品系、Oxy2;35品系和/或 Topasl9/2品系的检测。本发明的标准分子可很好的替代植物来源阳性标准品用于转基因油菜各品系及其来源产品品系特异性检测。试剂盒本发明还提供了一种检测转基因油菜RT73品系、MSl X RFl品系、MSlX RF2品系、 MS8XRF3品系、T45品系、0xy235品系和/或TopaS19/2品系的试剂盒，含有所述的重组质粒(通常包含在容器中)。所述的试剂盒还可含有扩增所述的MSl 5’端品系特异性序列、所述的RT733’端品系特异性序列、所述的RF3 3’端品系特异性序列、所述的MS8 3’端品系特异性序列、所述的0xy235 5’端品系特异性序列、所述的MS8 5’端品系特异性序列、所述的RF3 5’端品系特异性序列、所述的T45 5’端品系特异性序列、所述的TopaS19/2 3’端品系特异性序列、所述的RF2 5’端品系特异性序列、所述的0xy2353’端品系特异性序列、所述的RFl 5’ 端品系特异性序列、油菜内源标准基因HMG序列片段和/或油菜内源标准基因PEP序列片段的引物。以便于进行PCR扩增和/或检测。所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、电泳等所需的各种试剂，包括但不限于抽提液、DNA聚合酶、扩增液、杂交液、限制性酶、对照液、洗液、电泳相关试剂(如琼脂糖)、DNA分子量标记等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。I、材料与方法样品非转基因油菜籽(中国常规品种“秦优7号”)，转基因油菜RT73(参见农业部 869号公告-11-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜籽RT73及其衍生品种定性PCR方法)、MSl XRFl (参见农业部869号公告-4-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜籽MSl、RFl及其衍生品种定性PCR方法)、MS1XRF2 (参见农业部869号公告-6-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜籽MS1、RF2及其衍生品种定性PCR 方法)、MS8XRF3 (参见农业部869号公告-5-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜籽MS8、RF3及其衍生品种定性PCR方法)、T45 (参见农业部953号公告-3-2007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜籽T45及其衍生品种定性PCR方法)、0xy235 (参见农业部953号公告-4-2007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜籽Oxy-235及其衍生品种定性PCR方法)和TopaS19/2品系(参见农业部1193号公告-2-2009转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜TopaS19/2及其衍生品种定性PCR方法)。转基因玉米Btl76(参见农业部869号公告_8_2007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Btl76及其衍生品种定性PCR方法)，NK603 (参见农业部869号公告-13-2007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米NK603及其衍生品种定性PCR方法)，M0N863 (参见农业部869号公告-10-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米 M0N863及其衍生品种定性PCR方法)。试剂植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，Cat#DP305_02。 Axygen质粒DNA小量提取试剂盒，爱思进生物技术(杭州)有限公司，Cat :#AP-MN-P_50。 TakaRa Premix Ex Taq 试剂盒，大连宝生物公司，Cat#. D332。Hot StartqPCR Master MixI 试剂盒，上海睿诚生物科技有限公司。100-2000bp ladder DNA Marker 大连宝生物公司。10 X Loading Buffer 大连宝生物公司。琼脂糖；TAE(50X) :Fermentias公司。10 XBuffer (无MgCl2)大连宝生物公司。Mg2+溶液Q5mM)大连宝生物公司。dNTP溶液(每种2. 5mM)大连宝生物公司。Taq DNA聚合酶，5单位/μ 1 大连宝生物公司。超纯水(ddH20)大连宝生物公司。引物和探针 上海皓嘉科技发展有限公司合成。配成100 μ M母液-20°C储存，稀释为终浓度10 μ M待使用。植物基因组DNA提取用冷冻研磨机(美国SPEX公司FREEZER MILL 6850型)将待检测的油菜样品分别研磨成均勻的粉末。使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，
10Cat :#DP305-02)并按其操作步骤提取样品基因组DNA。具体操作程序如下1)用冷冻研磨机将样品在液氮中研磨成均勻的粉末。2)称取彡IOOmg研磨好的粉末，迅速转移到预先装有700 μ L 65°C预热缓冲液GPl 的离心管中，迅速颠倒混勻，将离心管放在65°C恒温震荡孵育器中孵育1个小时。3)加入700 μ L氯仿，充分混勻，12，OOOrpm离心5分钟。4)将上一步所得上层水相转入一个新离心管中，加入700 μ L缓冲液GP2，混勻。5)将混勻的液体转入吸附柱CB3中，12，OOOrpm离心30秒，弃掉废液。6)向吸附柱CB3中加入500 μ L缓冲液GD, 12，OOOrpm离心30秒，倒掉废液。7)向吸附柱CB3中加入700 μ L漂洗液Pff, 12，OOOrpm离心30秒，倒掉废液。8)向吸附柱CB3中加入500 μ L漂洗液Pff, 12，OOOrpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放入收集管中，12，OOOrpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3 开盖置于室温放置5分钟，以晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入60-100 μ L 洗脱缓冲液ΤΕ，室温放置5分钟，12，OOOrpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。标准分子的构建设计和研制同时适于转基因油菜RT73、MSl X RFU MS1XRF2、MS8XRF3、Τ45、 0xy235和TopaS19/2品系特异性检测的标准分子，使其适用于中国现行国家标准和行业标准的检测要求。鉴于现有检测方法同时涉及转基因作物5’和3’两端邻接区序列，因此标准分子的构建尽量将两端序列均插入载体以满足各种检测方法的要求。经对检测方法和序列的分析，发现多个片段间同源性很高，如RFl与MSl等序列， 为了防止标准分子作为标准品进行PCR扩增中出现非目标扩增，在标准分子设计中将同源性很高的片段尽量分开，距离在21Λ以上，对于无法分开的片段，采用反向插入的方法。标准分子设计包括如下片段MS1 5’端品系特异性序列、RFl 5’端品系特异性序列、RF2 5’端品系特异性序列、MS8 5’端和3’端品系特异性序列、RF3 5’端和3’端品系特异性序列、0xy235 5’端和3’端品系特异性序列、T45 5’端品系特异性序列、RT73 3’端和TopaS19/2 3’端品系特异性序列，以及油菜内标准基因HMG和PEP片段。构建步骤如下(1)整理中国现行的国家标准和行业标准中转基因油菜RT73、MS1XRF1、 MS1XRF2、MS8XRF3、T45、0xy235和Topasl9/2品系特异性普通PCR和实时荧光PCR检测方法，以及国内外公开刊物上发表的检测方法，主要是引物和探针序列和信息等。(2)设计标准分子构建用引物，使扩增区域涵盖上述所有标准和文献中涉及的检测引物和探针扩增的区域(见表1)。(3)禾Ij 用 L1-MS1-F/R、L2-RT73-3-F/R、L3-RF3-3-F/R、L4-MS8-3-F/R 以及 L6-0xy235-5-F/R五对引物分别扩增MSl 5，端片段、RT73 3，端片段、RF3 3，端片段、MS8 3，端片段以及0xy235 5，端序列，再通过重叠PCR方法将MS1/5，-RT73/3，-RF3/3，-MS8/3， -0xy235/5’五个片段串联起来，利用T/A克隆策略将其插入pEasy-T3载体(购自北京全式金生物技术有限公司)的多克隆位点。(4)利用快速定点突变技术在载体的1218位点后插入一段依次携带有Bglll、 PstI和XhoI的序列。
(5)利用表 1 中的 CDC37-BamHl-f/CDC37-BglII-XhoI-r 引物扩增 CDC37 部分序列 (933bp)，酶切后与载体经BglII和B10I酶切后回收片段进行连接，转化。(6)利用表 1 中的引物 HMG-BamH15，/HMG-3，和 PEP-5，/PEP-Sal 1-3'分别扩增 HMG和PEP片段，进行重叠PCR扩增，得到HMG-PEP串联片段，BamHI和Mil酶切后与载体经BglII和B10I酶切后回收片段进行连接，转化。(7)合成引物 BXXK-Linker-f/BXXK-Linker-r，在载体的 PstI 和 SalI 间插入一段依次带有Bglll、Biol、^CbaI和KpnI酶切位点序列(注插入后MlI位点被破坏)。(8)利用表 1 中的引物 L12-Oxy2;35-3-XhoI-f/L12-Oxy2;35-3-r 和 L13-RFl_f/ L13-RFl-XbaI-r分别扩增Oxy2;35 3，端和RFl片段，进行重叠PCR构建0xy235/3，-RFl串联片段，酶切后与载体经》ιοΙ和^CbaI酶切位点进行连接，转化。(9)禾丨J 用表 1 中的引物 L5-MS8-5-PstI-f/L5-MS8-5-r 和 L7-RF3-5-F/ L7-RF3-BglII-r分别扩增MS8 5，端和RF3 5，端序列，进行重叠PCR以构建MS8/5，-RF3 串联片段，酶切后与载体经I3StI和BglII酶切后回收片段进行连接，转化。(10)利用表 1 中的引物 L9-T45-5-f/L9-T45-5-r，L10-Topas-f/L10-Topas-r 以及 Lll-RF2reverse-f/Lll-RF2reverse-r 分别扩增 T45 5，端、Topasl9/2 3，端和 RF2 5，端序列，其中RF2 5，端序列为反向扩增，再进行重叠PCR以构建T45/5，-Topas-RF2 (Reverse) 的串联片段，酶切后与载体经BglII和B10I酶切后回收片段进行连接，转化。以上构建获得的标准分子分别送英潍捷基(上海)贸易有限公司和鼎安生物技术 (上海)有限公司进行质粒全基因测序。表1、标准分子构建中设计的引物
权利要求
1.一种重组质粒，其特征在于，其包含以下序列片段:MSl 5’端品系特异性序列；RT73 3’端品系特异性序列；RF3 3’端品系特异性序列；MS8 3’端品系特异性序列；0xy235 5’端品系特异性序列；MS8 5’端品系特异性序列；RF3 5’端品系特异性序列；T45 5’端品系特异性序列；TopaS19/2 3’端品系特异性序列；RF2 5’端品系特异性序列；0xy235 3’端品系特异性序列；RFl 5’端品系特异性序列；油菜内源标准基因HMG序列片段；油菜内源标准基因PEP序列片段。
2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的RFl5’端品系特异性序列与MSl 5’端品系特异性序列之间距离大于2000bp ；或所述的RF2 5’端品系特异性序列反向连接入重组质粒中。
3.如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于，所述的MSl 5，端品系特异性序列(MS 1-5)如SEQ ID NO 1所示； 所述的RT73 3，端品系特异性序列(RT73-3)如SEQ ID NO 2所示； 所述的RF3 3，端品系特异性序列(RF3-3)如SEQ ID NO 3所示； 所述的MS8 3，端品系特异性序列(MS8-3)如SEQ ID NO 4所示； 所述的0xy235 5，端品系特异性序列(0XY235-5)如SEQ ID NO 5所示； 所述的MS8 5，端品系特异性序列(MS8-5)如SEQ ID NO 6所示； 所述的RF3 5，端品系特异性序列(RF3-5)如SEQ ID NO 7所示； 所述的T45 5，端品系特异性序列(T45-5)如SEQ ID NO 8所示； 所述的Topasl9/2 3，端品系特异性序列(Topas)如SEQ ID NO 9所示； 反向的RF2 5，端品系特异性序列(RF2-5)如SEQ ID NO 10所示； 所述的0xy235 3，端品系特异性序列(0XY235-3)如SEQ ID NO 11所示；或所述的RFl 5，端品系特异性序列(RF1-5)如SEQ ID NO 12所示。
4.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的油菜内源标准基因HMG序列片段如SEQ ID NO 13所示；或所述的油菜内源标准基因PEP序列片段如SEQ ID N0:14所示。
5.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒中还包括来源于动物 ⑶C37的基因片段。
6.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的大小为 7000-10000bp。
7.权利要求1-6任一所述的重组质粒的用途，用于作为标准分子，检测转基因油菜 RT73品系、MSl X RFl品系、MS1XRF2品系、MS8XRF3品系、T45品系、0xy235品系和/或 Topasl9/2 品系。
8.一种检测转基因油菜RT73品系、MSl X RFl品系、MSlX RF2品系、MS8XRF3品系、T45 品系、0xy235品系和/或TopaS19/2品系的方法，其特征在于，所述方法包括以权利要求1 所述的重组质粒为标准分子，测定待测油菜样品中相应的转基因油菜RT73品系、MSl XRFl 品系、MS1XRF2品系、MS8XRF3品系、T45品系、0xy235品系或TopasW/^品系特异性序列的存在与否以及存在量；若待测油菜样品中存在RT73 3’端品系特异性序列，则表明该样品含有RT73品系； 若待测油菜样品中存在MSl 5’端品系特异性序列以及存在RFl 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MSl XRFl品系；若待测油菜样品中存在MSl 5’端品系特异性序列以及存在RF2 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MSl X RF2品系；若待测油菜样品中存在MS8 3’端品系特异性序列和/或5’端品系特异性序列，以及存在RF3 3’端品系特异性序列和/或5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MS8XRF3 品系；若待测油菜样品中存在T45 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有T45品系； 若待测油菜样品中存在0xy235 5’端品系特异性序列和/或3’端品系特异性序列，则表明该样品含有0xy235品系；若待测油菜样品中存在TopaS19/2 3’端品系特异性序列，则表明该样品含有 Topasl9/2 品系。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，采用PCR的方法扩增待测油菜或其来源样品中MSl 5’端品系特异性序列；RT73 3’端品系特异性序列；RF3 3’端品系特异性序列； MS8 3’端品系特异性序列；0xy235 5’端品系特异性序列；MS8 5’端品系特异性序列；RF3 5’端品系特异性序列；T45 5’端品系特异性序列；TopaS19/2 3’端品系特异性序列；RF2 5’端品系特异性序列；0xy235 3’端品系特异性序列和/或RFl 5’端品系特异性序列；以及油菜内源标准基因HMG序列片段和/或油菜内源标准基因PEP序列片段； 将获得的扩增结果与同样扩增条件下扩增的重组质粒的扩增结果进行比较，从而获得待测油菜及其来源样品中转基因油菜品系的存在与否以及存在量。
10.一种检测转基因油菜RT73品系、MSl X RFl品系、MS1XRF2品系、MS8XRF3品系、 T45品系、0xy235品系和/或TopaS19/2品系的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1_6任一所述的重组质粒。
全文摘要
本发明涉及同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子。构建了同时适于转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系特异性检测的通用型标准分子，对所述标准分子在定性和定量检测中的适用性进行验证表明，所述的标准分子高度特异于上述转基因油菜品系的检测。
文档编号C12Q1/68GK102212540SQ20111008112
公开日2011年10月12日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者刘月明, 吕蓉, 张舒亚, 李想, 潘良文, 高琴 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局