专利名称：一种油菜DNA分子Bnoleosin1基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域和农学领域，更具体地涉及一种油菜DNA分子 Bnoleosinl基因，同时还涉及一种油菜DNA分子Bnoleosinl基因在提高油料作物种子含油 量中的应用。
背景技术：
脂类是植物种子贮藏能量最有效的形式，许多植物种子以贮存的脂类为随后的生 命活动及活跃的代谢过程提供能量。植物种子的这种贮脂颗粒常被称为油体(Oilbodies)。 一般认为，油体内部为液态基质，主要成分是三酰甘油酯(TriacylglycerolsTAG)，被一层 磷脂和蛋白质镶嵌而成的半单位膜所覆盖。磷脂层的疏水酰基与内部的三酰甘油酯相互作 用，而亲水头部基团则面向细胞液。组成半单位膜的蛋白质主要是油体相关蛋白，目前已发 现三种这类蛋白(Oleosin, Ealeosin和Steroleosin)。其中，Oleosin发现最早，含量最 丰富。Oleosin—般覆盖于油体表面，属于碱性、疏水、嵌入蛋白。不同植物种子中Oleosin 的分子量范围在15 26kDa之间。甘蓝型油菜种子Oleosin占种子总蛋白的8%。Oleosin的结构和功能一般认为，Oleosin包括三个结构分区两性(兼具亲水性和亲脂性)N末端区， 中心疏水区，两性C末端区。Oleosin似图钉一样分布在油体上，其中心疏水区部分钉入油 体，N、C末端区则覆盖在油体表面。Oleosin蛋白的中心疏水区相当保守，由约70个氨基酸 组成，是目前已知蛋白质中存在的最长的疏水区域。N和C末端区物种间变化较大，分别由 50-70、55-98个氨基酸组成。作为油体最主要的相关蛋白，从油体的发生到分解消失过程中Oleosin起着重要 的生物学作用。关于油体的个体发生，比较流行的是“出芽”说，其基本过程为TAG先在内 质网膜内合成，Oleosin —旦形成就流向累积有TAG的内质网膜内，随后TAG-Oleosin “芽” 逐渐长大，形成油体。缺少Oleosin，油体将不可能形成。当植株需要动员贮藏在油体内的 脂类时，Oleosin可能作为脂酶与油体结合的识别信号，也可能是脂酶的活化剂，促进油体 分解。当油体表面磷脂层的水化作用不足以阻止油体相互接合或融合时，Oleosin产生的 空间障碍和相斥电荷起到了稳定油体的作用。其生理意义在于能阻止油体在种子干化过程 中相互结合，能保持油体成为相对独立、可流动的颗粒。用胰蛋白酶处理分离的油体可以破 坏其稳定性，如果不用胰蛋白酶处理，仅用磷酸磷脂酶处理，则不能影响油体的完整性，充 分说明Oleosin对稳定油体有十分重要的作用。模式植物拟南芥上的研究表明，如果抑制掉油体蛋白基因Oleosinl的表达，会 导致种子中的油体无法维持稳定而互相融合到一起，形成异常的大油体；当恢复Oleosinl 的表达后油体大小又回复正常，这直接证明了油体大小受到Oleosinl基因的调控。在申 请人对甘蓝型油菜的研究中发现，一些低含油量油菜品种种子中也出现异常大油体，而且 Oleosin蛋白和Oleosinl基因表达水平都明显低于高油品种，这说明Bnoleosinl基因与含 油量高度相关。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种油菜DNA分子Bnoleosinl基因，该基因调控种子 油体的大小，过量表达该基因可以提高种子含油量。本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜DNA分子Bnoleosinl基因在提高油 料作物种子含油量中的应用。为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术措施一种油菜DNA分子Bnoleosinl基因的制备方法，其步骤是油菜油体蛋白基因Bnoleosinl的获得1)在高低含油量油菜组合及其F2代群体测序的分析结果中获得该基因EST序列， 在NCBI数据库中检索已发表的拟南芥Oleosinl基因序列(AT4g25140)，并以此编码区序列 BLASTNCBI EST数据库，寻找与之同源的油菜Oleosin基因的EST序列，并设计基因编码序 列的两侧引物(正向引物[5，-ATGGCGGATACTGCTAGAACC-3，]；反向引物[5，-GCGTGATTTA TGTAGTAGTGGT-3’ ])。2)以油菜品系中双9号cDNA第一链为模板进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段 进行测序，获得Bnoleosinl基因序列，一种DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示的核 苷酸序列。通过上述方法获得了油菜油体蛋白基因Bnoleosinl，采用一种提高油菜 Bnoleosinl表达活性的转基因拟南芥，其特征在于转基因植物表现为Bnoleosinl基因表 达丰度增强。在本发明中为了达到上述目的采用以下技术措施提供了一种PCR8/GW/T0P0质粒(Invetrogen公司购买)，可以与表达载体质粒重 组构建基因表达质粒的实验方法。提供了 一种质粒表达载体PearIeygate 100 (Invetrogen公司购买)，它含有35S启 动子和翻译控制件。提供了一种可在植物中表达的宿主菌(根癌农杆菌)，本发明优选的是农杆菌 GV3101 (Invetrogen 公司购买)。本发明提供了一种能够过量表达Bnoleosinl的转基因拟南芥的方法，其特征在 于拟南芥中Bnoleosinl表达量增加。该方法包括下列步骤1)将克隆得到的油菜油体蛋白基因Bnoleosinl与PCR8/GW/T0P0质粒连接， 命名为topo-Bnoleosinl,利用PCR8/GW/T0P0质粒与质粒表达载体PearleygatelOO 可以体外重组的特性将油菜油体蛋白基因Bnoleosinl转移至表达载体，命名为 Pearleygate100-BnoIeosinl ；2)将步骤1)中制备的载体PearleygatelOO-Bnoleosinl转入根癌农杆菌 GV3101，再导入拟南芥植株中；3)筛选阳性植株。种植拟南芥TO代所收获的种子，待10天左右喷洒除草剂(草甘膦)用于筛选阳 性植株，叶片DNA提取后进行PCR鉴定。本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地增强或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。克隆本发明中所述的油菜油体蛋白基因Bnoleosinl的方法是本领域中所常采用 的方法(《分子克隆实验指南》第三版，J.萨姆布鲁克、D. W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出 版社)。提取植物叶片DNA是常用的分子生物学技术，提取RNA的方法也有多种成熟的技 术，试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen)可从商业途径获得，而构建cDNA文库也是常 用的分子生物学技术。构建本发明中所述的载体和将载体转染入植株也是本领域中所常采 用的方法。其中所涉及的质粒(入门载体PCR8/GW/T0P0，质粒表达载体PearleygatelOO)， 转染用媒体(如根癌农杆菌GV3101和表面活性剂Silwet-77)可从商业途径获得。本发明是国内首次公开油菜油体蛋白基因Bnoleosinl序列。本发明实验结果表 明转基因拟南芥Bnoleosinl表达量与受体对照(非转基因植株)相比均有很大程度的提 高。转基因纯合株系生长于21-23°C培养箱中，收获种子后测其含油量的变化。结果显示， 转基因株系的种子含油量比野生型明显提高，最高提高了 6个百分点。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果前人研究报道，油体蛋白基因Oleosinl的主要功能是调控种子中油体的大小，如 果抑制Oleosinl基因的表达会导致异常大油体的产生，但目前还没有研究报道该基因的 表达与含油量是否相关。本发明上述结果表明，利用油体蛋白基因的过量表达可以提高含 油种子的油含量，这是该基因的一个新的功能。因此本发明提出可利用油体蛋白的过量表 达或者增强油体蛋白基因的功能来增强油料作物种子含油量以便用于油料作物高含油量 品种的选育。实现上述观点的方法是通过转基因方法，利用强启动子大量表达油体蛋白基 因及其转录因子，以便提高油体蛋白的表达量或增强某些油体蛋白的功能。
图1为Bnoleosinl基因在高低含油量油菜品种中的RT-PCR表达图2为高低含油量油菜品种中0LE0SIN蛋白的SDS-PAGE分析L，蛋白质 Marker ;1，B. napus 6F313 ；2, B. napus zy036 ；3, B. napus 53165 ；4, B.napus 93275；5,B.napus 51070图3为高低含油量油菜品种成熟种子胚的超微结构比较(A)B. napus 6F313 ； (B)B. napus zy036 ； (C)B. napus53165 ； (D)B. napus 93275 ； (E) and(F)B. napus 51070.黑箭指示正常的油体，箭头指示蛋白体；白箭指示异常大油体。 标尺 Bars = 2 μ m.图4为一种植物表达载体示意图，根据图示的方法构建得到过量表达Bnoleosinl 基因的载体，该载体分别带有Kan和Bar两个筛选标记。图5为一种除草剂筛选过后的转基因植株，转基因阳性植株因为带有抗除草剂标 记基因，在除草剂筛选过后能够存活下来。图6为一种转Bnoleosinl基因拟南芥Tl代的PCR鉴定结果，1，3，4，6，8，9，11，12，
13，15样为转基因植株，WT为对照野生植株。图7为一种转基因拟南芥与对照含油量的比较，1，8，9，11，12，13，15样为转基因 植株，WT为对照野生植株。其中转基因植株9，11，12，13，15含油量明显高于对照材料。
具体实施例方式通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或 Draper 等人(Blackwell 科学出版社，1988) 所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。一种油菜DNA分子Bnoleosinl基因的制备方法，其步骤是油菜Bnoleosinl基因在拟南芥中的转化，筛选和分析BnoleosinlcDNA 编码区序列在NCBI数据库中检索已发表的拟南芥Oleosinl基因序列，BLAST到油菜EST 序列并拼接出油菜Bnoleosinl编码区全长。设计基因编码序列的两侧引物(正向引物 [5，-ATGGCGGATACTGCTAGAACC-3‘]；反向引物[5，-GCGTGATTTATGTAGTAGTGGT-3‘])，用来 从油菜中扩增Oleosinl的对应序列。1、提取油菜 mRNA。RNA 的提取(TRIZ0L TM Kit 提取 RNA)液氮研磨IOOmg材料A.加 ImlTRIZOL,室温(20-25°C，下同)放置 5min。B.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。C. 12000g，15min，4 °C，取上清至新管中，加入500u 1异丙醇，混勻后室温放置 15min。D. 12000g，15min，4°C，去上清，加入 Iml 70% (V/V)乙醇。E. 7500g, 7min, 4°C，去上清，空气干燥。F. DEPC-H2O 溶解。2、cDNA第一链的反转录采用 RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)，操作参照所用试剂盒说明进行。3、以cDNA为模板进行PCR扩增，得到了基因序列如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序 列。一种油菜DNA分子Bnoleosinl基因，该基因与油菜种子中油体的大小以及油菜含 油量有高度的相关性。申请人对三个含油量在49%以上的高油油菜和两个含油量在34% 以下的低油油菜品种进行研究发现(表1)，三个高油油菜中Bnoleosinl基因的表达水平 (图1)和油体蛋白水平(图2)都明显高于两个低油油菜品种。而且在这两个低油油菜品 种中，形成了一些异常的大油体(图3)。这些研究结果不仅说明油菜Bnoleosinl基因具有 与其他物种报道的该基因的功能，即维持油体形态调控油体大小，而且该油菜Bnoleosinl 基因还与种子的含油量高度相关，我们将该基因转化拟南芥的实验结果也证明了这点。表1、不同油菜品种总含油量和总蛋白含量分析油菜品种 总含油量 总蛋白含量 B. napus lines Lipid (%) Protein (%)
下
4中油菜DNA分子Bnoleosinl基因在提高油料作物种子含油量中的应用过程如
IBnoleosinl表达载体的构建及拟南芥的转化
将PCR扩增得到的基因序列与TOPO入门载体(invitrogen公司)连接后， 转化到感受态细胞DH5 α (invitrogen公司)中，壮观酶素筛选，载体引物(T7引 物)与基因引物(基因上游引物)扩增鉴定正向插入克隆，质粒经小量制备后与 PearleygatelOO (invitrogen公司)进行重组，并转化到感受态细胞DH5 α中，卡那霉素筛 选，其插入片段经载体引物(35S启动字序列引物)与基因引物(基因下游引物)PCR鉴定， 示意图见图4。拟南芥的转化过程试剂配制渗透培养基(IL):l/2xMurashige-Skoog ；5% (W/V)蔗糖；0. 5 克MES ；用 KOH调至 pH5. 7 ；再加10微升lmg/ml的6-BA母液；200微升Silwet L-77转化步骤(1)制备好已转化了相应质粒的农杆菌(GV3101)菌液10ml，在转化前一天晚上， 转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液在600nm的吸光值0. D600应当在1. 2到 1.6之间。(2)室温 5OOOrpm 离心 分钟。(3)弃上清，将农杆菌(GV3101)沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使0. D600
在0.8左右。(4)将整个植株直接浸泡至农杆菌(GV3101)悬浮液中30s。(5)避光培养过夜，然后正常培养至结子。2、转基因拟南芥的筛选和验证转化子的筛选将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。 两天后光照，三天后揭膜。人工培养室条件相对湿度80%，恒温20-24°C，光照强度80-200umol/M2/S，光照 周期为8h黑暗、16h光照培养。一周左右，喷除草剂(草甘膦)筛选阳性植株(图5)。PCR 鉴定(1)用于PCR的转化植株总DNA的提取A. 70% (V/V)乙醇擦洗叶片，称取大约IOOmgB.加入 600ul 抽提缓冲液(0. 2M Tris-Cl, 0. 25NaCl,25mM EDTA，0. 5% (ff/V) SDS,PH 7. 5)，室温快速研磨。C. 1. 5ml Ependorff 管中涡旋混勻 5_10s。D. 12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，-20摄氏度沉淀过夜。E. 12000rpm, 15min，室温。加入 70% (V/V)乙醇 200ul 泡洗 DNA 沉淀。F. 12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。G..加无菌水IOOul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。H.以总DNA为模板，进行PCR。(2) PCR 程序PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，依据植物表达载体中目的基因及其上游 35S启动子序列和基因下游引物[5’ -ACCACTACTACATAAATCACGC-3’ ]，反应的时间和温度作 如下94"C 3min94°C 45s,59°C 45s72°C 2min 30s,30cycles72 °C 5min检测结果显示，大多数转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带，而阴性对照 则没有，表明转基因拟南芥基因组中已经含有外源基因DNA片段，结果如图6所示。3、拟南芥含油量检测转基因纯合株系分别生长于21-23°C培养箱中，收获种子后测其含油量的变化。结 果显示，转基因及野生型拟南芥种子含油量有了明显的区别(图7)。SEQUENCE LISTING<110>中国农业科学院油料作物研究所<120> 一种油菜DNA分子Bnoleosinl基因和应用<130> 一种油菜DNA分子Bnoleosinl基因和应用<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>543<212>DNA<213>Bnoleosinl<400>1
0103]atggcggatactgctagaacccatcacgacataaccagccgtgaccagtacccgatattg600104]ggccgagaccgagaccagtatccttacggacgatcagactaccagacgtcgggccaagac1200105]tactccaagactaggcagattgctaaagctgctaccgcagtcaccgccggagggtccctt1800106]cttgtcctctccagtctcacccttgtcggaacagtcattgctttgactgttgccactcct2400107]ctgcttgttatctttagcccaatcctcgtgccggctctcatcaccgtagcacttctcatc3000108]actggctttctctcctctggtgggtttggcattgcagctataaccgtcttctcctggatc3600109]tataagtacgcaacgggagagcacccacaggggtcagataagttggacagtgcaaggatg420
aagctgggaa ccaaagctca ggatattaaa gacagagctc aatactacgg acaggtggtg agcatgaccg tgaccgtacc cgtggaaccc atcacaccac
acagcaacat 480 cactactaca 540
taa54权利要求
一种油菜DNA分子Bnoleosin1，其序列为SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的一种基因Bnoleosinl在提高油料作物种子含油量中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种油菜DNA分子Bnoleosin1基因和应用，其步骤是A、油菜油体蛋白基因Bnoleosin1的获得1)在高低含油量油菜组合及其F2代群体测序的分析结果中获得该基因EST序列，在NCBI数据库中检索已发表的拟南芥Oleosin1基因序列；2)以油菜cDNA第一链为模板进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得Bnoleosin1基因序列，一种DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO1所示。研究结果表明，该油体蛋白在拟南芥中过量表达可以提高拟南芥种子的含油量。鉴于上述结果，本发明提出所有利用转基因过量表达Oleosin油体蛋白及其转录因子用于聚合育种可提高种子含油量的方法均可用于提高油料作物的含油量。
文档编号C12N15/29GK101899447SQ200910062250
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月26日 优先权日2009年5月26日
发明者刘贵华, 华玮, 王新发, 王汉中, 胡志勇 申请人:中国农业科学院油料作物研究所