一个拟南芥lrr-rlk蛋白激酶及其应用
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及一种拟南芥LRR-RLK蛋白激酶及其在培育耐盐性植物上的应用，属于 基因工程技术领域。
【背景技术】
[0003] 土壤盐渍化（Soilsalinization)问题在世界范围内广泛存在，特别是干旱、半 干旱地区，问题更为严重，盐胁迫已经成为影响全球农作物产量的重要非生物胁迫之一。据 联合国科教文组织UNESCO不完全统计，全球盐碱地面积已达9. 5亿hm2,约占地球陆地总面 积的10%，其中中国为9913万hm2。我国土壤盐渍化的主要特点是面积大、分布广、类型多 且每年盐碱化和次生盐碱化都在不断加重。土壤盐碱化已经成为制约我国农业可持续性发 展的主要因素。盐渍化的土壤可以严重影响植物的生长发育及其产量与品质。但盐碱地改 良是世界性难题，传统措施投资大、效益低。实践证明，利用基因工程技术培育耐盐性增强 的转基因农作物新品种，是开发利用盐碱地资源最经济、最有效的途径之一。
[0004] 目前已了解的植物耐盐相关功能基因主要包括离子转运蛋白、渗透保护物质合成 酶、水通道蛋白、抗氧化酶、蛋白激酶、转录因子等。其中，蛋白激酶在植物胁迫信号的感知、 传递的调控中起着重要作用。蛋白激酶，又称蛋白质磷酸化酶（Proteinphosphakinase) 是一类催化蛋白磷酸化的酶。蛋白激酶可以将腺苷三磷酸（ATP)上的Y-磷酸基团转移 到蛋白质分子的氨基酸残基上，导致蛋白质构象改变，从而使蛋白质功能激活或失活。其 中，受体蛋白激酶（ReceptorProteinKinaseRPK)是细胞信号转导中重要的信号介导 因子。在植物基因组中存在大量受体蛋白激酶结构相似的蛋白，但多数受体功能尚不确 定，故称之为类受体蛋白激酶（Receptor-likekinaseRLK)。富含亮氨酸重复的亚家族 (Leucine-richrepeatsRLK，LRR-RLK)是植物类受体蛋白激酶家族（RLK)中最大的亚家 族。LRR-RLK属于跨膜类受体蛋白激酶，由胞外LRR结构域、单次跨膜区以及胞内激酶结构 域三部分组成。LRR-RLK作为信号识别受体参与CLV、BR、Ax21等信号转导过程，在植物 生长发育、激素调节以及逆境应答反应等方面中发挥重要的作用。植物抗逆性涉及一系列 复杂的生理生化反应或过程，是多基因相互作用的结果。持续挖掘新型的耐盐基因可以更 好地为提高作物的耐盐性奠定技术基础。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种拟南芥LRR-RLK蛋白激酶基因及其编码 的蛋白，通过转基因技术为将来培育和改良抗逆性转基因植物新品种奠定基础。
[0006] 本发明提供的拟南芥耐盐性的LRR-RLK蛋白激酶的核苷酸序列如SEQIDNo: 1所 不。
[0007] 本发明提供的拟南芥耐盐性的LRR-RLK蛋白激酶的氨基酸序列如SEQIDNo: 2所 不。
[0008] 本发明提供的拟南芥耐盐性的LRR-RLK蛋白激酶基因全长为3018bp，编码的蛋白 分子由1005个氨基酸组成（3￡〇10如:2)，等电点（？1)为5.55，分子量（丽）为111.961?， 分子式为(；。 3311794#131801511527，不稳定系数（11)为34.83，平均疏水性（61^￥)为-0.16，脂 肪系数（AI)为91. 17。
[0009] 本发明提供的拟南芥耐盐性的LRR-RLK蛋白激酶被命名为J 基因。实验表明 本发明的拟南芥耐盐性的蛋白激酶JM基因导入拟南芥后受盐胁迫而明显诱导表达，证 明本发明JM基因参与拟南芥的耐盐胁迫应答反应。
[0010] 使用JM基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一 种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动 子（Ubiquitin)，可单独使用或与其它植物启动子结合使用。
[0011] 为了便于对转基因植物材料进行鉴定，可以对植物表达载体进行加工(如加入⑶S 基因、萤光素酶基因、庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因（如抗 除莠剂基因）等。或者不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0012] 本发明同时提供了拟南芥蛋白激酶基因J沈Z府E培育耐盐性植物中的应用，即： 利用克隆的J基因的CDS序列，构建的融合基因，并进行植物转化，从 而获得在拟南芥中组成型表达J^目的基因的转基因植物。
[0013] 本发明所述融合基因的构建，具体操作过程如下： 1) 利用AfcoI/fe试II双酶切通过PCR扩增的基因的⑶S序列片段； 2) 利用AfcoI/fe试II双酶切pCAMBIA1301 (购自CAMBIA公司）质粒并回收载体片 段； 3) 混合步骤1)得到的J基因的⑶S序列片段和步骤2)得到的pCAMBIA1301载 体大片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在PCAMBIA1301载体上的此尤 融合基因的构建。
[0014] 其中，基因的⑶S序列的PCR扩增引物如下： 上游引物：5' -CATGCCATGGATGACTCGTTTACCCTTACC-3'(SEQIDNo:3)； 下游引物：5 ' -GGGTAACCTTATACAAAACCTAAATCTTCAT-3'（SEQIDNo: 4)。
[0015] 在正常条件下，本发明J基因的转基因拟南芥株系的生长状况与野生型拟 南芥基本一致，说明该基因的过表达不影响植物的正常生长；而在NaCl的胁迫条件下，转 乂沈M基因过表达株系的拟南芥长势明显优于野生型对照。
[0016]用本发明JM基因构建植物过表达载体，然后通过农杆菌介导法转入野生型拟 南芥中，发现在非胁迫条件下过表达JM的转基因拟南芥的生长状况与野生型拟南芥 基本一致，说明该基因的大量表达不影响植物的生长；而过表达JM的转基因拟南芥受 NaCl胁迫后其的长势优于对照组野生型。在盐胁迫下过表达的转基因拟南芥植株能 够降低体内过氧化氢和活性氧的积累，细胞损伤程度较低，表现出较强的抗逆能力。本发明 提供的蛋白和基因为人为控制耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗耐逆性增强的 植物中发挥重要的作用。
[0017] 上述应用中，所述调控植物耐逆性具体为提高植物耐逆性；所述耐逆具体为耐盐 性。
[0018] 此外，本领域技术人员可以将SEQIDNo. 1所示的多核苷酸进行优化以增强或改 善在植物中的表达效率。例如。可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以 增强或改善在目标植物中的表达效率。
【附图说明】
[0019] 图1是转化融合基因的转基因拟南芥株系中目的基J的表 达分析，#P< 〇. 01。
[0020] 图2是转化融合基因的转基因拟南芥株系幼苗期的耐盐性分 析。
[0021] 图3显示野生型ColO和过表达转基因株系在正常生长条件下（A)和盐胁迫5天 后的表型（B)图片及存活率统计（C)结果，结果表明突变体存活率极显著高于野生型（P= 0. 05)，表现耐盐表型。
[0022] 图4显示野生型ColO和过表达转基因株系在正常生长条件和盐胁迫下的相对电 导率。
[0023] 下面结合实验方法和数据进一步阐述本发明。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的 材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的％，如无特殊说明，均为质量 百分含量。
[0025] 实施例一：拟南芥LRR-RLK蛋白激酶蛋基因J的克隆 1.提取拟南芥总RNA 所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研钵、枪头、离心管等一应物品 事先用1%DEPC水浸泡过夜后高温高压灭菌备用。
[0026] (1)RNA的提取参考（TRIZ0L?KitRNA提取试剂说明书） (2) 取50mg新鲜植物组织样品用液氮研磨； (3) 加lmlTRIZ0L，室温（20-25°C，下同）放置 10min; (4) 加入200y1氯仿，剧烈振荡60s，室温放置5min; (5) 12000转离心10min(4°C)，取500y1上清至新PE管中，加入lml无水乙醇，混匀 后-20°C放置 20min; (6) 12000转离心10min(4°C)，去上清，加入lml75%乙醇（无水乙醇与DEPC水的体 积比）； (7) 12000转离心5min(4°C)，去上清，空气干燥15min; (8) 加 20-30 ^1尺似86-^66 1120 50-60°(：溶解5111111〇
[0027] 2?反转录合成cDNA第一链 cDNA第一链的反转录米用RevertAidHMinusFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas)，操作参照所用试剂盒说明进行。
[0028]反转录程序： 72°C5分钟；25°C5分钟；42°C60分钟；80°