专利名称：一种提取植物总蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取植物总蛋白的方法。
背景技术：
样品制备是蛋白质组学研究的关键因素，样品制备的质量几乎直接决定下游分析的结果。理想的样品制备方法应当可以最大限度的溶解全部蛋白质，同时可以将蛋白质降解、修饰与非蛋白质类物质污染降低到最小，并具备良好的重复性。尤其是对于植物组织，其中不但富含大量细胞壁结构，富含蛋白酶与氧化酶，而且还含有大量多糖和次生代谢产物(例如脂类、酚类、淀粉等)，这些不利因素都导致难以获得无污染、无修饰、完整高质量的植物细胞蛋白质。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取植物总蛋白的方法，特备是一种提取番茄植株韧皮部总蛋白的方法。本发明提供的提取植物总蛋白的方法，包括如下步骤( I)取植物材料，加入PVPP和石英砂，用液氮研磨成粉末；(2)取步骤(I)得到的粉末，加入蛋白质提取缓冲液并振荡匀浆，然后加入Tris饱和酚进行提取，取有机相；(3)取步骤(2)得到的有机相，与蛋白质沉淀液混合后静置，然后离心收集沉淀；(4)取步骤(3)得到的沉淀，依次进行甲醇清洗、丙酮清洗和冷冻干燥，得到植物总蛋白。所述蛋白质提取缓冲液的制备方法具体如下将500mmol Tris_HCl、50mmolEDTA、700mmol蔗糖和IOOmmol KCl溶于水并用水定容至1L，调pH至8. 0，使用前加入β-巯基乙醇和各种蛋白酶，使得巯基乙醇的浓度为2% (体积百分含量)、糜蛋白酶的浓度为I. 5 μ g · ml'嗜热菌蛋白酶的浓度为O. 8g · ml'木瓜蛋白酶的浓度为Iyg · ml、链霉蛋白酶的浓度为I. 5μ g · ml'胰酶的浓度为15μ g · ml'胰蛋白酶的浓度为O. 2 μ g · ml'所述蛋白质沉淀液的制备方法具体如下将乙酸铵溶于甲醇，并用甲醇定容，使得乙酸铵的浓度为O. Imol · L'所述植物材料具体可为番茄韧皮部。每2g所述植物材料可加入O. 2g PVPP0所述步骤(2)的具体步骤可为取Ig步骤(I)得到的粉末，加入3mL所述蛋白质提取缓冲液并混匀，加入3mL Tris饱和酚并混匀，4°C放置30min(可间隔时间振荡，以充分反应)，然后4°C、IOOOOg离心15min，吸取有机相。所述步骤(2)的具体步骤可为取Ig步骤(I)得到的粉末，加入3mL所述蛋白质提取缓冲液并混匀，加入3mL Tris饱和酚并混匀，4°C放置30min(可间隔时间振荡，以充分反应)，然后4°C、IOOOOg离心15min，吸取出有机相后再加入3mL所述蛋白质提取缓冲液并混匀，加入3mL Tris饱和酚并混匀，4°C放置30min，然后4°C、IOOOOg离心15min，吸取有机相。所述步骤(3)的具体步骤可为每管加入250 μ L步骤(2)得到的有机相和ImL所述蛋白质沉淀液，漩涡混匀，-20°C静置10小时。所述甲醇清洗具体可进行三次，每次的步骤为每管得到的沉淀加入500 μ L 4°C预冷的甲醇，漩涡混匀，4°C、10000g离心lOmin，弃掉上清液；所述丙酮清洗进行三次，每次的步骤为每管得到的沉淀加入500 μ L 4 °C预冷的丙酮，漩涡混匀，4 °C、IOOOOg离心IOmin,弃掉上清液。以上任一所述的番爺具体可为番爺品种CM (Lycopersicon esculentumL.cvCastIemart)。
本发明提供的提取植物总蛋白的方法是对现有的酚-甲醇法的改进，主要改进点在于(I)在样品研磨破碎过程中添加PVPP (聚乙烯聚吡咯烷酮)来吸附酚类物质，，而不是常规使用的PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，PVP为可溶性物质，易溶于酚-甲醇提取法的水相，难以去除，从而会干扰第一相等点聚焦电泳，而PVPP为不溶性物质，在提取过程中吸附酚类物质后可以通过离心去除，不会干扰下游分析过程；(2)当植物细胞破碎的时候，细胞中的蛋白水解酶就会被释放出来并被激活，使得各个蛋白组分被降解掉，导致电泳结果复杂化并影响最终的结果分析，针对此问题，通过对蛋白水解酶的降解避免蛋白水解酶对各个蛋白组分的降解，将非正常的蛋白质降解或修饰降到最低水平，最大限度的保持植物材料中的蛋白质的活性与自然特性。
图I为实施例I中的电泳图。 图2为对比例I中的电泳图。图3为对比例2中的电泳图。图4为对比例3中的电泳图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。用于实施例的番爺品种为CM (Lycopersicon esculentum L. cv Castlemart);参考文献张立宁，程继鸿，杨瑞，孙中华，吴春霞，王绍辉。茉莉酸合成相关基因Spr2与LePrs在番茄抗根结线虫中的作用.中国农业科学，2011，44 (19) :4022-4028。糜蛋白酶(Chymotrypsin):美国sigma公司；Cat. No. :C1012。嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)美国 sigma 公司；Cat. No. :T7902。木瓜蛋白酶(Papain)美国 sigma公司；Cat. No. :76218。链霉蛋白酶(Pronase):美国 sigma 公司；Cat. No. :P4806。胰酶(Pancreatin):美国 sigma 公司；Cat. No. :P3292)。膜蛋白酶(Trypsin):美国 sigma 公司；Cat. No. :T9201。CHAPS，即3_[3_(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，购自美国sigma公司，货号为C9426。DTT即二硫苏糖醇，购自美国BIO-RAD公司，货号为161-0611。Bio-Lyte载体两性电解质，购自美国BIO-RAD公司，货号为163-1113。PVPP (聚乙烯聚吡咯烷酮):购自美国sigma公司，货号为P6755。PVP (聚乙烯吡咯烷酮)购自美国sigma公司，货号为PVP I。实施例I、番茄总蛋白的提取(本发明保护的改进的酚-甲醇法)蛋白质提取缓冲液的制备方法将500mmol Tris_HCl、50mmol EDTA、700mmol鹿糖和IOOmmol KCl溶于水并用水定容至1L，调节pH至8. 0，4°C保存，使用前加入β -巯基乙醇和各种蛋白酶，使得巯基乙醇的浓度为2% (体积百分含量)、糜蛋白酶的浓度为I. 5 μ g · ml'嗜热菌蛋白酶的浓度为O. 8g · πιΓ1、木瓜蛋白酶的浓度为I μ g · ml'链霉蛋白酶的浓度为I. 5μ g · ml'胰酶的浓度为15μ g · ml'胰蛋白酶的浓度为O. 2 μ g · ml'蛋白质沉淀液的制备方法将乙酸铵溶于甲醇，并用甲醇定容至 O.Imol · ΙΛ -20°C 保存。蛋白质裂解液的制备方法将6mol尿素、2mol硫脲、20mmol CHAPS和O. Olg溴酹蓝溶于水，并用水定容至1L，-20°C保存，使用前加入DTT和Bio-Lyte载体两性电解质，使得DTT的浓度为65mmol · L'Bio-Lyte载体两性电解质的浓度为O. 5g/100ml。一、番茄总蛋白的提取取番茄植株的韧皮部进行总蛋白的提取，具体步骤如下I、取2g番茄植株的韧皮部，加入O. 2g PVPP及少量石英砂，用液氮研磨成粉末，准确称取I. Og粉末，转入15mL Falcon管(Falcon管A)中。2、加入3mL蛋白质提取缓冲液，震荡使其充分混匀，加入3mL Tris饱和酚，旋涡混匀后，4°C放置30min (期间震荡两次)，然后4°C、IOOOOg离心15min，小心吸取两相提取液中含有酚的上层于新的Falcon管(Falcon管B)中(注意务必小心不要吸入中间的白色夹层)。3、在完成步骤2的Falcon管A中加入3mL Tris饱和酚，旋涡混匀后，4°C放置30min(期间震荡两次)，然后4°C、IOOOOg离心15min，小心吸取两相提取液中含有酚的上层于新的Falcon管(Falcon管C)中(注意务必小心不要吸入中间的白色夹层)。4、合并Falcon管B和Falcon管C中的液体，混勻后分装入I. 5mL的tube管中(250 μ L/tube 管)。5、向步骤4得到的每个tube管中加入ImL蛋白质沉淀液，漩涡混匀，_20°C静置10小时。6、将步骤5得到的tube管4°C、6000g离心5min，弃掉上清液；每管加入500 μ L4°C预冷的甲醇，漩涡混匀，4°C、10000g离心lOmin，弃掉上清液；每管加入500μ L 4°C预冷的甲醇，漩涡混匀，4°C、10000g离心lOmin，弃掉上清液；每管加入500yL 4°C预冷的甲醇，漩涡混匀，40C、IOOOOg离心lOmin，弃掉上清液。7、将步骤6得到的tube管中每管加入500 μ L 4°C预冷的丙酮，漩涡混匀，4°C、IOOOOg离心lOmin，弃掉上清液；每管加入500 μ L 4°C预冷的丙酮，漩涡混匀，4°C、IOOOOg离心lOmin，弃掉上清液；每管加入500 μ L 4°C预冷的丙酮，漩涡混匀，4°C、10000g离心IOmin,弃掉上清液。8、将步骤7得到的tube管中的沉淀用真空冷冻干燥机制成干粉，_70°C保存。
二、提取效果鉴定向步骤一的8得到的每个tube管加入100 μ L蛋白质裂解液，漩涡混匀多次，直到所有蛋白溶解，将所有tube管中的液体合并至一个离心管中，40C、IOOOOg离心20min，收集上清液并进行双向凝胶电泳，具体步骤如下I、等电聚焦电泳(I)取出冷冻保存的IPG预制胶条(17cm)，于室温下放置lOmin。(2)沿着聚焦盘的边缘线性加入样品1000 μ g0(3)当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘中后，用镊子去除预制IPG胶条上的保护层。
(4)将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。(5 )在每根胶条上覆盖2_3mL矿物油。(6)对好正、负极，盖上盖子。按表I设置等电聚焦程序并进行等电聚焦电泳。表117cm胶条等电聚焦程序设置
权利要求
1.一种提取植物总蛋白的方法，包括如下步骤 (1)取植物材料，加入PVPP和石英砂，用液氮研磨成粉末； (2)取步骤(I)得到的粉末，加入蛋白质提取缓冲液并振荡匀浆，然后加入Tris饱和酚进行提取，取有机相； (3)取步骤(2)得到的有机相，与蛋白质沉淀液混合后静置，然后离心收集沉淀； (4)取步骤(3)得到的沉淀，依次进行甲醇清洗、丙酮清洗和冷冻干燥，得到植物总蛋白。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述蛋白质提取缓冲液的制备方法如下将500mmol Tris-HCl、50mmol EDTA>700mmol 鹿糖和 IOOmmol KCl 溶于水并用水定容至 1L,调节PH至8.0，使用前加入β-巯基乙醇和各种蛋白酶，使得巯基乙醇的浓度为2%、糜蛋白酶的浓度为I. 5μ g · ml—1、嗜热菌蛋白酶的浓度为O. 8g · ml—1、木瓜蛋白酶的浓度为1μ g πιΓ1、链霉蛋白酶的浓度为I. 5μ g -ml'胰酶的浓度为15 μ g · ml'胰蛋白酶的浓度为 O. 2 μ g · HiF1O
3.如权利I或2所述的方法，其特征在于所述蛋白质沉淀液的制备方法如下将乙酸 >铵溶于甲醇，并用甲醇定容，使得乙酸铵的浓度为O. Imol · L'
4.如权利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述植物材料为番茄韧皮部。
5.如权利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于每2g所述植物材料加入O.2gPVPPo
6.如权利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(2)为取Ig步骤(I)得到的粉末，加入3mL所述蛋白质提取缓冲液并混匀，加入3mL Tris饱和酚并混匀，4°C放置30min，然后4°C、IOOOOg离心15min，吸取有机相。
7.如权利要求I至6中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(2)为取Ig步骤(I)得到的粉末，加入3mL所述蛋白质提取缓冲液并混匀，加入3mL Tris饱和酚并混匀，4°C放置30min，然后4°C、IOOOOg离心15min，吸取出有机相后再加入3mL所述蛋白质提取缓冲液并混匀，加入3mL Tris饱和酚并混匀，4°C放置30min，然后4°C、IOOOOg离心15min，吸取有机相。
8.如权利要求I至8中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(3)为每管加入250 μ L步骤(2)得到的有机相和ImL所述蛋白质沉淀液，漩涡混匀，_20°C静置10小时。
9.如权利要求I至7中任一所述的方法，其特征在于所述甲醇清洗进行三次，每次的步骤为加入500yL 4°C预冷的甲醇，漩涡混匀，4°C、10000g离心lOmin，弃掉上清液；所述丙酮清洗进行三次，每次的步骤为加入500μ L 4°C预冷的丙酮，漩涡混匀，4°C、10000g离心IOmin,弃掉上清液。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述甲醇清洗进行三次，每次的步骤为每管加入500yL 4°C预冷的甲醇，漩涡混匀，4°C、10000g离心lOmin，弃掉上清液；所述丙酮清洗进行三次，每次的步骤为每管加入500yL 4°C预冷的丙酮,镟涡混匀，4°C、10000g离心IOmin,弃掉上清液。
全文摘要
本发明公开了一种提取植物总蛋白的方法，特备是一种提取番茄植株韧皮部总蛋白的方法。本发明提供的方法包括如下步骤(1)取植物材料，加入PVPP和石英砂，用液氮研磨成粉末；(2)取粉末，加入蛋白质提取缓冲液并振荡匀浆，然后加入Tris饱和酚进行提取，取有机相；(3)取有机相，与蛋白质沉淀液混合后静置，然后离心收集沉淀；(4)取沉淀，依次进行甲醇清洗、丙酮清洗和冷冻干燥，得到植物总蛋白。本发明提供的方法主要改进点在于(1)在样品研磨破碎过程中添加PVPP来吸附酚类物质，在提取过程中吸附酚类物质后可以通过离心去除，不会干扰下游分析过程；(2)提取过程中添加多种蛋白酶，最大限度的保持植物材料中的蛋白质的活性与自然特性。
文档编号C07K1/30GK102924566SQ20121044742
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者王绍辉, 杨瑞, 郝敬虹, 邢佳毅 申请人:北京农学院