本发明涉及益生菌研究和检测领域，更特别地，涉及一种检测细菌对肠道黏附性的方法。
背景技术：
益生菌能有效调节动物肠道微生态平衡，对肠道疾病具有防治作用，是替代抗生素的理想绿色添加剂。在养殖业中，益生菌例如乳酸杆菌等常常被用作饲料添加剂，以促进动物生长，维持动物健康。特别是在家禽或家畜的幼龄阶段，适当添加一些有效的益生菌可有效预防家禽家畜的消化不良、腹泻等疾病。因此，对益生菌筛选和检测是养殖业研究的重要课题。
良好的黏附定植能力是理想的益生菌株的基本特性。益生菌在肠道内黏附定植是决定其实际应用效果的重要前提。高黏附的益生菌不仅能够在肠道内停留较长时间，还可通过竞争性占位定植形成生物屏障，从而更有效的发挥益生作用。
现有技术中，已有一些评价益生菌对肠道黏附情况的方法。
直接测定法采用体外构建模型的方式来评价益生菌对黏蛋白或上皮细胞的黏附情况，通常采用caco-2、ht-29和hela细胞系等细胞模型来进行，但是这些细胞系是由肠道癌组织诱导而来，细胞表面没有肠道中广泛存在的黏液层。而益生菌与肠道的黏附更多的取决于菌体与肠道黏液层的作用。还有研究者用氨甲叶酸处理ht-29细胞，使之分化成黏液蛋白分泌细胞，并用于益生菌肠道黏附评价，然而该方法诱导的黏液蛋白并不能完全模拟肠道内的黏液环境。间接评价法通过测定益生菌表面的疏水性或自聚合力来评价其对肠道的黏附力。然而，已经有很多实验证实，细菌的表面疏水性与其对肠道的黏附性并不相关。
此外，无论对于家禽还是家畜而言，大肠和小肠都分为不同的肠段，例如对于哺乳动物而言，小肠分为十二指肠、空肠、回肠，大肠包括盲肠、结肠和直肠。而以上方法都不能用来评价益生菌对特定的肠段区域的黏附能力。
因此，需要一种便于检测益生菌对肠道黏黏附性以及对各肠段的偏好和倾向性的试剂盒及方法。
技术实现要素：
为解决以上问题，本发明提供了一种用于检测细菌对肠道黏黏附性的试剂盒，其包括细菌黏附板和细菌释放溶液，所述细菌黏附板上设置有多个细菌黏附孔，每个所述细菌黏附孔表面覆盖有小肠(十二指肠、空肠、回肠)和/或大肠(盲肠、结肠)的一个或多个肠段中的黏液蛋白。通过使用本发明的试剂盒，可方便快速地检测细菌对肠道的黏附能力，以及细菌对在各肠段定植的喜好和倾向性。
在一个优选实施方案中，每个细菌黏附板上包括表面上分别覆盖有小肠和大肠的所有肠段中的一个肠段中的黏液蛋白的细菌黏附孔至少各一个。从而可在一个细菌黏附板上检测细菌对各肠段的粘附能力。
进一步地，所述细菌黏附孔通过以下方法制备：
s1：从大肠或小肠的一个或多个肠段的内表面刮取黏液，得到黏液蛋白混合物；
s2：从所述黏液蛋白混合物提取黏液蛋白溶液；
s3：用所述黏液蛋白溶液孵育将用于黏附细菌的孔，使所述黏液蛋白溶液中的黏液蛋白固定于所述孔的表面上，形成所述细菌黏附孔。
刮取黏液的肠段可来自家禽或家畜。
在一个优选实施方案中，s2包括以下步骤：
s21：将所述黏液蛋白混合物用ph7.4的pbs缓冲液混匀，得到混悬液；
s22：所述混悬液于4℃、10000-12000r/min下离心10-20min；
s23：取离心后的上清，将黏液蛋白浓度调整为0.5-2mg/ml，即得到所述黏液蛋白溶液。
在一个优选实施方案中，s3包括以下步骤：
s31：将所述黏液蛋白溶液加入所述孔中，覆盖所述孔的表面，于4℃下孵育过夜；
s32：去除所述黏液蛋白溶液，使用ph7.4的pbs缓冲液洗涤所述孔，去除未固定的黏液蛋白，即得到所述细菌黏附孔。
在一个优选实施方案中，所述细菌释放溶液为质量分数0.1-0.5％的tritonx-100溶液。
本发明还提供了一种检测细菌对肠道黏附性的方法，使用上述试剂盒进行检测，包括以下步骤：
1)将待检测的细菌制备成细菌悬液，计算初始细菌数量；
2)将所述细菌悬液加入所述细菌黏附孔中孵育；
3)移除所述菌悬液，洗涤已经用所述菌悬液孵育过的细菌黏附孔，去除未被黏附的细菌；
4)向所述细菌黏附孔中加入所述细菌释放溶液，释放黏附的细菌，经梯度稀释后涂布于相应琼脂平板，进行活菌计数，得到黏附后细菌数量，计算黏附率。计算公式为：
黏附率(％)＝黏附后的细菌数量/初始细菌数量×100％。
在一个优选实施方案中，步骤2)中，所述细菌悬液在所述细菌黏附孔中于37℃孵育1h。
在一个优选实施方案中，步骤4)中，所述释放溶液在所述细菌黏附孔中于37℃下孵育30min。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.肠黏液蛋白溶液的制备
1)从来自健康的成年鸭的小肠肠段内表面刮取黏液，得到黏液蛋白混合物；
2)用pbs缓冲液混匀，于4℃，12000r/min离心15min，收集上清；
3)用bca(bicinchoninicacid，二喹啉甲酸)法测定黏蛋白浓度，用1mg/ml的牛血清蛋白(bsa)作为标准，将黏液蛋白浓度调整为1.0mg/ml左右，分装后-80℃冷冻保存备用。
2.制备细菌黏附板
取出黏液蛋白溶液解冻以后，在96孔细胞培养板中加入调整好浓度的黏液蛋白100μl/孔，置于4℃下过夜，使蛋白固定在细胞培养板上。吸取ph7.4pbs缓冲液200μl洗涤96孔板3次，以除去未固定的黏液蛋白。
3.检测细菌对肠道的黏附性
1)将乳杆菌接种于新鲜配制的mrs液体培养基中，37℃厌氧培养16-18h；
2)于4℃下6000r/min离心10min，收集菌体，弃上清；
3)用无菌ph7.4pbs洗涤菌体2次，然后重悬于pbs中，调整菌液浓度为108cfu/ml，形成细菌悬液，4℃保存备用；
4)向细菌黏附板的每个细菌黏附孔中加入100μl细菌悬液，于37℃孵育1h，然后用ph7.4pbs缓冲液反复冲洗3次；
5)加入200μl0.1％的tritonx-100裂解液，释放黏附的细菌，37℃孵育30min；
6)梯度稀释后涂布于mrs琼脂平板，37℃厌氧培养48h后进行活菌计数，计算黏附率。黏附率(％)＝黏附后的细菌数量/初始细菌数量×100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。