自细胞的提取的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于释放细菌细胞的周质间隙的内含物的方法，所述方法包括在含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液中温育所述细菌细胞。本发明还提供了一种制备重组多肽的基本上纯的样品的方法。所述方法可应用于从细菌细胞回收物质如蛋白质。
【专利说明】自细胞的提取
[0001]本发明涉及用于改善从细胞回收物质的方法。
[0002]生物加工工业在生物治疗药物和生物【技术领域】已经历了巨大成长，并且在近年来，在使用这样的方法制备的生物医药产品(例如疫苗和单克隆抗体)的数量方面有很大增长。最近的数据显示了全部药物的约44%是生物医药产品。
[0003]生物加工的技术由多个步骤组成。制备可以合成目的生物药物产品的宿主细胞。在宿主细胞发酵(“生物反应器步骤”)后，产物通常从所述细胞分泌和/或提取，即“产物释放步骤”。接着具体产物需要通过下游加工纯化，如过滤、离心和各种色谱法步骤。这样的方法可以用来制备用于治疗应用的生物药物产品。所述产物释放步骤和随后的这样的产物的回收在生物加工技术中是关键阶段。
[0004]由于各种各样的原因，选择用于生产生物药物以及其他目的重组蛋白的宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性菌。这些细胞可以容易生长，并且含有相对简单的基因组。这些细胞的遗传学可以易于操控，这使得它们在微生物学、生物技术和生物加工领域中很重要。
[0005]像通常细胞膜一样，革兰氏阴性菌如大肠杆菌含有额外的外膜，该外膜含有脂多糖和脂蛋白以及磷脂和膜蛋白。脂多糖由连接于O-多糖的共价结合的脂质A分子组成，这给外膜提供强负电荷。在内膜和外膜之间存在间隙，称为周质间隙，其在革兰氏阴性菌中含有薄的肽聚糖基质层-已知其在细胞壁中提供结构功能。肽聚糖基质层由两种糖即N-乙酰胞壁酸和(β1_4)Ν-乙酰葡糖胺组成，这两种糖在所述层的结构中交替。所述N-乙酰胞壁酸单体含有具有由若干氨基酸残基构成的肽链的侧链。这种肽链具有结合另一个N-乙酰胞壁酸单体中的另一个肽链 的潜力，以致所述肽聚糖可以形成’网状’层。这种肽聚糖层还含有小孔或开口，这可以足够达以用于蛋白通过。
[0006]在有机体如大成杆菌中，一些蛋白可以运输到细胞质外和各种其他膜隔室中，包括周质间隙。预定从细胞质输出的蛋白含有“信号肽”，其是蛋白N-端的延伸。这些’信号肽’含有三个保守区域；N-端区域，核心区域和C-端区域。一旦所述蛋白已到达其需要的目的地，则信号肽可以通过称为信号肽酶的酶从成熟蛋白裂解，由此在细胞膜的指定隔室(例如周质)中释放成熟多肽。
[0007]蛋白至周质间隙的易位已由生物加工工业开发以有助于生物药物产品的回收。这是为了使从细胞质释放的污染物的量最小，并且还避免细胞的微粉化。
[0008]文献中有大量现有方法用于释放周质蛋白，但没有一个是理想的。使用去污剂(如Triton X-100)和氯仿对细菌细胞的化学处理导致外膜的透过性增大，而且还导致低的蛋白纯度，因此增加关于下游加工的成本。用阴离子表面活性剂处理大肠杆菌细胞也可以导致大量周质蛋白释放，包括青霉素酰化酶。外膜也可以通过用甘氨酸处理被透化以释放细菌的内含物，包括α -淀粉酶，获得这种蛋白的70-80%回收。渗透压休克的技术也已在从大肠杆菌细胞的周质释放青霉素酰化酶中显示前景。尽管这些方法在实验室的小规模上显示了相对成功，但是使这些技术在更大规模上可行的上升显示很少的前景。
[0009]迄今周质蛋白释放的最有效方法利用EDTA(乙二胺四乙酸)联合溶菌酶。EDTA导致二价阳离子如Ca2+的螯合，其引起膜去稳定化，从而允许溶菌酶接近而分解存在于周质中的肽聚糖基质。这允许释放更大量的周质蛋白，如α-淀粉酶。即使这种方法在小规模实验室实验期间导致增加的周质释放，但是当在工业上规模化以更大体积使用时，它已被证明是昂贵的方法。
[0010]因此，仍然需要开发有效而廉价的方法以释放革兰氏阴性菌的周质内含物。
[0011]本发明的发明人决定开发一种新的周质蛋白释放方法以实现提取靶向周质的治疗蛋白的更有效方式。他们已惊人地发现，苯乙烯马来酸(SMA)共聚物可以特异地破坏细菌细胞的外膜从而释放周质的内含物，同时不破坏内膜，由此避免来自细胞质的污染蛋白在蛋白样品中存在。
[0012]因此，本发明的第一方面提供一种用于释放细菌细胞的周质间隙的内含物的方法，所述方法包括在含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液中温育细菌细胞。 [0013]本发明的发明人决定研究苯乙烯马来酸(SMA)是否可以用来从细胞提取周质蛋白。他们已惊人地发现，SMA特异地破坏细菌细胞的外膜但不破坏内膜。因此，SMA可以用来选择性地提取周质蛋白同时不释放来自细胞质的污染蛋白。所述提取方法易于进行并且可以易于规模化至大规模生物加工过程。所述方法显著地降低了涉及的成本，因为在下游加工中有较少的纯化步骤。
[0014]虽然SMA之前已被用来分离和保存跨膜蛋白，以及用于递送治疗剂，但是直至本发明，还没有公开或启示SMA可以用来释放周质间隙的内含物。
[0015]实践中，本发明的方法可以易于用来选择性地将周质间隙的内含物释放到溶液中。周质间隙的具体组分，例如用于工业用途的重组蛋白，然后可以易于从所述溶液分离。因此，本发明具有明显有益的和工业的应用。
[0016]本发明第一方面的方法包括在含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液中温育细菌细胞。
[0017]细菌物种通常可以分成“革兰氏阳性”和“革兰氏阴性”物种，区别具体地可归因于取决于其细菌细胞壁的结构差异的特定染料的保持。
[0018]可以用于所述方法的细菌细胞可以是任何合适的细胞。优选地，所述细菌细胞是革兰氏阴性细菌物种，优选是大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属物种(Salmonella sp.)、荧光假单胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)、志贺氏菌属物种(Shigella sp.)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia sp.)或克雷伯氏菌属物种(Klebsiella sp.)。这样的细菌物种在本领域是熟知的。这些物种的细菌细胞可以易于获得，例如从商业供应商或生物学材料保藏中心如ATCC(http://www.lgcstandards-atcc.0rg/)。
[0019]如本领域熟知的，也已制备了这样的革兰氏阴性细菌物种的突变衍生物，其提高了产生的蛋白的量的质量和/或数量。它们因此也被认为是因此可以用于本发明的此方面的细菌细胞的实例。
[0020]制备用于本发明方法中的细菌细胞的方法在本领域是熟知的。如下面进一步概述的，在一些情形中，细菌细胞将含有重组多肽。在培养基中以足够时间并且在合适条件下培养上述这样的细胞以获得所述重组多肽的表达的方法在本领域是熟知的。本文在所附实施例部分中提供了一种这样的方法的一个实例。
[0021]本发明的第一方面的方法使用含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液。[0022]在一些实施方案中，提供苯乙烯和马来酸的共聚物包括提供苯乙烯和马来酸酐的共聚物，和将所述马来酸酐水解为马来酸。苯乙烯和马来酸酐的共聚物以商品名SMA?2000 和SMA? 3000 可获自 Sartomer Company Inc., Exton PA, USA。合适的水解方法在本领域中是已知的。
[0023]作为实例，可以使用以下方案来制备可以用于本发明第一方面的方法中的SMA的溶液。
[0024]将SMA2000P (获自Sartomer)和IM氢氧化钠(10%w/v)的溶液在室温在磁力搅拌子上在圆底烧瓶中温和地混合过夜(25g的SMA2000P溶解在250ml的NaOH中)。然后向圆底烧瓶中加入几个抗爆沸颗粒，然后将圆底烧瓶置于连接有冷凝器的加热套上。允许SM/NaOH溶液到达沸点。在沸腾后，关闭加热并且允许该溶液回流2小时，然后转移到冷室达2天。这些过程在通风橱中进行。在这个冷却期之后，测量体积并计算SMA的百分比含量，然后等分到50ml falcon管中并储存在_70°C。
[0025]当使用时，优选地，所述溶液含有50mM TRIS pH8.0、0.5M NaCl。
[0026]在一些实施方案中，提供其中苯乙烯:马来酸比为0.5:1至10:1的苯乙烯和马来酸的共聚物，包括提供其中苯乙烯:马来酸比为1:1至5:1的苯乙烯和马来酸的共聚物。在一些其他实施方案中，苯乙烯:马来酸比为1.5:1至4:1，或2:1至3:1。
[0027]应理解，由于聚合过程的特性，这样的单体比是大量平均值，并且不作为对具有指定的单体排布的特定分子结构的描述。然而，一般地预期单体类型遍布所述共聚物。
[0028]在一些实施方案中，提供苯乙烯和马来酸的共聚物包括提供分子量为3000Da至120000Da的苯乙烯和马来酸的共聚物。在一些其他实施方案中，所述共聚物的分子量为5000Da至15000Da。在一些其他实施方案中，所述共聚物的分子量为7000至lOOOODa。
[0029]本发明的发明人已研究了可以用来释放周质间隙内含物的SMA的浓度范围。他们已经证实，SMA在溶液中的至少约0.5-4.5%的范围可以成功地用于该目的。在一个实施方案中，SMA的浓度为约0.5%-10%、1%-7%或1.5%_5%。在另一个实施方案中，SMA的浓度为约2-2.5%。
[0030]本发明的发明人已研究了 SMA对释放周质间隙内含物的时间影响。他们已证实，至少约15分钟至6小时温育时间范围可以成功用于该目的。优选地，温育时间为约2小时。同样，优选地，所述细菌细胞在约37°C用SMA温育。
[0031]相应地，因此根据本文中提供的信息，本发明第一方面的一个优选实施方案是其中所述方法包括以下步骤:(i)制备细菌细胞的群；(?)将所述细菌细胞悬浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:马来酸比为约2:1并且浓度为约2-2.5%;和(ii)将所述细菌细胞在约37°C在所述溶液中温育约2小时。
[0032]本发明的发明人还注意到，在具有SMA的溶液中EDTA(ImM)的存在导致从周质间隙释放的材料的显著减少。因此，本发明方法的一个优选实施方案是其中所述溶液基本上不含有EDTA。
[0033]本发明的发明人还研究了渗透压休克对周质间隙的内含物的释放效率的作用。如在所附实施例中显示的，使用渗透压休克引起从周质间隙释放的材料增多。因此本发明的方法的一个优选实施方案是其中所述方法包括将细胞暴露于渗透压休克。优选地，渗透压休克在细胞用SMA溶液温育后进行。[0034] 本发明的方法可以用来释放周质间隙的内含物。周质的组成可以包括寡糖、氨基酸、肽和各种小分子。本发明的方法的操作者可以使用上述方法来从细胞释放这些组分，其随后可以使用本领域熟知的方法从所述溶液进一步纯化。
[0035]在本发明的一个优选实施方案中，细菌细胞表达靶向周质的重组多肽。将重组多肽引向周质的方法在本领域是熟知的。相应地，因此本发明的方法可以用作大规模生物加工过程的一部分以选择性地将周质的内含物(包括这样的重组多肽)释放到溶液中用于后
续纯化。
[0036]因此本发明的另一个实施方案是其中所述方法还包括从所述溶液回收周质间隙的一种组分的至少一部分。本发明的另一个实施方案是其中周质间隙含有重组多肽。本发明的另一个实施方案是其中所述方法还包括从所述溶液回收重组多肽的至少一部分。
[0037]重组多肽可以使用本领域已知的标准技术容易地从溶液分离，包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱法，磷酸纤维素色谱法，疏水相互作用色谱法，亲和色谱法，羟磷灰石色谱法和凝集素色谱法。
[0038]在需要分离已被遗传改造以包含纯化标签(如多个组氨酸残基，或谷胱甘肽S-转移酶)的具体重组多肽的情况中，这样的多肽可以通过适于所使用的特定纯化标签的任何方法进行纯化，如例如亲和色谱法。也可以使用本领域中熟知的其他蛋白纯化技术，如本领域技术人员容易理解的。
[0039]本发明的另一方面提供一种制备重组多肽的基本上纯的样品的方法，所述方法包括:(i)制备包含所述重组多肽的细菌细胞的群；(?)将所述细菌细胞悬浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:马来酸比为约2:1并且浓度为约2-2.5%;和(ii)在约37°C将所述细菌细胞在所述溶液中温育约2小时；(iv)从所述溶液回收所述重组多肽。
[0040]为了避免怀疑，本发明第一方面的实施方案还应用于本发明此方面的方法。
[0041]因此作为实例，以下方案可以用作本发明的方法一个实施方案。
[0042]细菌细胞的群在适当培养条件下生长。如果所述细菌细胞合成重组的靶向周质的多肽，则所述培养条件是这样的以促进这样的多肽的表达和积累。所述细胞然后使用实验室方法(例如离心)收获并悬浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:马来酸比为约2:1并且浓度为约2-2.5%。细胞悬浮液在约37°C温育2小时。然后使用标准实验室方法(例如离心)将所述细胞从所述溶液除去。所得的溶液含有周质间隙的内含物。然后可以使用例如本领域已知的亲和纯化手段分离周质间隙的具体组分。
[0043]本发明的另一方面提供苯乙烯马来酸共聚物(SMA)用于释放周质间隙的内含物的用途。
[0044]本发明的另一方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括:(i)含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液；和(ii)操作手册。优选地，所述试剂盒还包括一种或多种另外的部件，所述一种或多种另外的部件包括蛋白质纯化柱或树脂。
[0045]所述操作手册可以包括涉及例如如本文提供的优选的温育条件和反应程序的信息，以及根据需要的其他这样的信息。
[0046]本发明现在将参考以下的非限制性附图和实施例进行描述。
【专利附图】
【附图说明】[0047]图1:革兰氏阴性细菌的细胞壁结构
[0048]图2:苯乙烯马来酸(SMA)
[0049]图3:通过SMA形成脂质纳米盘(nanodisk)以保存和分离跨膜蛋白。
[0050]图4:各种条件对α -淀粉酶的周质释放的影响。
[0051]图5:自大肠杆菌细菌细胞的多种周质释放方法的效率。
[0052]图6:延长的37°C温育时间对通过SMA的α -淀粉酶的周质释放的影响。
[0053]图7:更长的温育时间对通过SMA的α -淀粉酶的周质释放的影响。
[0054]图8:自大肠杆菌的多种SMA周质释放方法的效率。
[0055]图9:增大的SMA脂质聚合物浓度对α -淀粉酶从周质释放的影响。
[0056]图10:变化的SMA脂质聚合物浓度对α -淀粉酶从周质释放的影响。
[0057]图11:自大肠杆菌的多种SMA周质释放方法的效率。
[0058]图12:温度变化对最佳TSLE释放方法的作用模式的影响。
[0059]图13:渗透压休克 对多种周质释放方法的影响。
[0060]图14 =EDTA对周质α -淀粉酶释放的各种处理的影响。
[0061]图15:检测β -半乳糖苷酶在这些大肠杆菌细胞中的存在的初始测定。
[0062]图16:各种条件对β -半乳糖苷酶的释放的影响。
[0063]图17:多种条件对从大肠杆菌细胞提取β -半乳糖苷酶的影响。
[0064]图18:牛血清清蛋白(BSA)样品的稀释系列的线性相应。
[0065]图19:显示大肠杆菌细胞的各种周质级分的SDS-PAGE凝胶。
[0066]图20:显示大肠杆菌细胞的各种周质级分的SDS-PAGE凝胶。
[0067]图21:提出的TSLE和SMA对大肠杆菌细菌细胞的作用模式。
[0068]图22 =FAB片段从大肠杆菌的周质的释放:⑷显示从用SMA处理的细胞释放的FAB片段的蛋白质印迹结果。(B)显示从使用渗透压休克处理的细胞释放的FAB片段的蛋白质印迹结果。(C)从使用渗透压休克处理的细胞释放的总蛋白的SDS PAGE。(D)从用SMA处理的细胞释放的总蛋白的SDS PAGE。
[0069]实施例1:SMA选择性地从周质释放蛋白的用途
[0070]概要
[0071]最近的发现，即苯乙烯马来酸(SMA)共聚物可以形成脂质/聚合物组装件(’脂质纳米盘’)以便分离和保存跨膜蛋白，在生物学的这个领域具有巨大突破。因此包括圆二色谱在内的技术已被用来表征这些跨膜蛋白以用于结构和功能分析(Knowles等，2009)。
[0072]数十年来，一直需要有效且廉价的处理以选择性地从大肠杆菌细菌细胞的周质间隙释放蛋白，所述处理可以在大型生物加工工业中规模化(细胞壁的结构参见图1)。在本研究期间，本发明的发明人使用SMA共聚物作为用于释放基于周质的治疗蛋白的方法。这种测定可以通过研究各种因素对蛋白释放效率的影响来开发；如改变SMA浓度，使温育时间不同，渗透压休克和添加EDTA。在所有实验中使用阳性对照-通过将这种新方法与使用Tris/蔗糖/溶菌酶/EDTA(TSLE)的最佳释放方法进行比较。周质蛋白释放的这种新方法使用三种生化测定(α -淀粉酶、β -半乳糖苷酶和BCA总蛋白测定)开发。
[0073]本发明的发明人发现，SMA共聚物可以有效且选择性地从大肠杆菌细胞的周质释放蛋白。他们发现，使用这种共聚物温育这些细胞的理想条件是浓度为2-2.5%(在37°C持续2小时)。因此这些新处理具有被规模化至大规模生物加工工业的巨大潜力。这将显著降低所涉及的成本-因为SMA相对廉价，并且在下游加工中需要更少的纯化步骤。
[0074]引言
[0075]本发明的发明人决定开发一种新的周质蛋白释放方法以实现提取靶向周质的治疗蛋白的更有效方式。最广泛使用的周质释放方法使用Tris/蔗糖/溶菌酶/EDTA(TSLE)缓冲液，并且因此在实验中被用作对照。使用这种TSLE释放方法，高比例的蛋白可以从周质释放，但这种方法极难规模化用于大规模工业过程，原因在于溶菌酶的量和成本。
[0076]近来的发现，即被称为SMA(苯乙烯马来酸；图2)的聚合物能够结合至脂质颗粒以形成SM/脂质颗粒(SMALP)在跨膜蛋白研究中是一个巨大突破(Knowles等，2009 ;图3)。
[0077]因此本发明的发明人决定研究SMA共聚物是否可以特异地破坏大肠杆菌细胞的外膜以选择性地提取周质蛋白同时不释放来自细胞质的污染蛋白。
[0078]方法和材料
[0079]用来确定总蛋白浓度的BCA ( 二喹啉甲酸)测定
[0080]这种测定基于成紫色的BCA-Cu+反应复合物的比色检测(在562nm)以确定样品中的蛋白总量。这种方案结合了在碱性介质中蛋白还原铜离子(Cu2+-->Cu+)(称为双缩脲反应)与单个Cu+离子能够与两个BCA分子螯合从而形成紫色反应复合物的能力。
[0081]
【权利要求】
1.一种用于释放细菌细胞的周质间隙的内含物的方法，所述方法包括在含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液中温育所述细菌细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中苯乙烯:马来酸比为约1:2至10:1.
3.根据权利要求2所述的方法，其中苯乙烯:马来酸比为约2:1。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述SMA的浓度为约0.5-4.5%。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述SMA浓度为约2-2.5%。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞用所述SMA温育约15分钟至6小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细菌细胞用所述SMA温育约2小时。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞在约37°C用所述SMA温育。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞是革兰氏阴性细菌物种。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌物种是大肠杆菌(E.coli),沙门氏菌属物种(Salmonella sp.)、突光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens)、志贺氏菌属物种(Shigella sp.)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia sp.)或克雷伯氏菌属物种(Klebsiella sp.)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤:(i)制备细菌细胞的群；(ii)将所述细菌细胞悬浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:马来酸比为约2:1并且浓度为约2-2.5% ;和(ii)在约37°C在所述溶液中将所述细菌细胞温育约2小时。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶液基本上不含有EDTA。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶液含有50mMTRIS pH8.00.5M NaCl。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述细胞暴露于渗透压休克。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述溶液回收所述周质间隙的一种组分的至少一部分。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述周质间隙含有重组多肽。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法包括从所述溶液回收重组多肽的至少一部分。
18.一种制备重组多肽的基本上纯的样品的方法，所述方法包括:(i)制备包含所述重组多肽的细菌细胞的群；(ii)将所述细菌细胞悬浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:马来酸比为约2:1并且浓度为约2-2.5% ;和(ii)在约37°C在所述溶液中将所述细菌细胞温育约2小时；(iv)从所述溶液回收所述重组多肽。
19.苯乙烯马来酸共聚物(SMA)用于释放周质间隙的内含物的用途。
20.一种试剂盒，所述试剂盒包括:(i)包含苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液；和(ii)操作手册。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，所述试剂盒还包括一个或多个另外的部件，所述一个或多个另外 的部件包括蛋白质纯化柱或树脂。
【文档编号】C12P21/00GK103649325SQ201280033450
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年5月9日 优先权日:2011年5月9日
【发明者】蒂莫西·达弗恩, 欧文·罗伯特·蒂里尼斯-托马斯 申请人:伯明翰大学