专利名称：从鱼类的精原细胞中提取dna的方法
技术领域：
本发明涉及从鱼类的精原细胞中大量提取脱氧核糖核酸(DNA)的方法。
脱氧核糖核酸(DNA)作为遗传信息密码的生物高分子，广泛存在于所有生命体中。DNA是由磷酸、4种碱基、脱氧核糖形成的生物高分子，因具有固有的物理化学和生物学特性，广泛用于生化实验材料、化妆品、医药、食品添加剂等。
另外，乌贼的精原细胞是加工乌贼过程中大量得到的副产物。乌贼捕获后，大部分加工成乌贼干或鱿鱼干等，在此过程中乌贼的内脏作为副产物产生。此外，乌贼的鱼子和精原细胞作为饭馆等的基本菜使用。乌贼的精原细胞中含有丰富的DNA，因此比其他原料更容易得到DNA。DNA以往从鲱鱼或大马哈鱼的精原细胞中提取，从明太鱼的精原细胞中用阴离子表面活性剂和氯化钠提取DNA方法记载在韩国专利第35973号中。
以往大量提取DNA的方法可举出使用苯酚的方法(美国专利第3838148号)、使用阴离子表面活性剂和高浓度氯化钠的方法(韩国专利第35972号)等。这些方法在提取过程中大量产生公害物质，而且这些公害物质处理费用高。本发明为解决这些问题，提供完全不产生公害物质，并且其废液可用作肥料的方法。
因此，本发明着眼于精原细胞大量含有DNA，发现用含有高浓度盐的碱性溶液，可以非常经济地精制DNA，由此完成本发明。本发明的目的是代替对人体有害的苯酚、阴离子表面活性剂SDS(十二烷基硫酸钠)、有害于土壤的氯化钠等环境污染物质，使用土壤复活改善剂物质，把从鱼类精原细胞中提取DNA工艺所产生的副产物全部用作植物营养源，该方法比以往方法简便且容易提取DNA。
另外，本发明的其他目的是将所述方法中的副产物作为液体氮肥。
为达到本发明所述目的，从鱼类的精原细胞中提取DNA的方法包括A)破碎、分离鱼类的精原细胞，得到乳白色的胶体；B)用含有1M以上的pH值为8～12的一价离子盐的碱性溶液处理所述胶体；C)向上述混合物中加入乙醇，沉淀DNA。
另外，本发明的从鱼类的加工副产物---精原细胞中提取DNA的方法，由A)将鱼类的精原细胞加入到含有1M以上的pH值为8～12的一价离子盐的碱性溶液中并进行破碎；B)在所述破碎溶液中加入酸酐进行酰化反应；C)在酰化反应的破碎溶液中加入乙醇沉淀DNA的步骤组成的。
本发明中可使用多种多样的鱼类精原细胞，但最好使用廉价并容易大量购得的乌贼、明太鱼的精原细胞。
将鱼类的精原细胞与蒸馏水一起在粉碎机中粉碎形成胶状，再用筛过滤，除去未粉碎的部分后，可加入含有高浓度盐的碱性溶液。另外，本发明的方法可在含有高浓度盐的碱性溶液中破碎鱼类的精原细胞，鱼类的精原细胞同蒸馏水一同破碎，并且该溶液用高浓度盐溶液处理后，再用pH值为8～12的碱性溶液处理。
本发明的方法也可增加酰化反应步骤，而所述酰化反应是在碱性溶液处理的破碎溶液中加入酸酐进行的。本发明的酸酐可使用乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐等。
本发明的方法中可使用的碱性化合物有硝酸钠、碳酸钠、磷酸钠等。
所述A)步骤后也可增加RNA分解步骤。RNA的分解采用碱处理或RNA酶(RNase)分解。
下面详细说明本发明。
如果破碎细胞，核酸结合蛋白质在高浓度盐中显示更强的正电性，弱化了与DNA的吸附状态，而与DNA分离。鱼精蛋白类的核酸蛋白质的蓖麻子白朊含量非常高。蓖麻子白朊基由于含有氨基，在高浓度盐中显示正电性。核酸结合蛋白质内显示正电性的氨基被碱性溶液脱正电性，而成为反应性极大的作用基与酸酐反应，因此失去与DNA的离子结合性亲和力(Roger L.Lundbland and Claudia M.Noyes.,Chemical Reagents for Protein Modification,Vol.I CRC Press,Inc.,1984,page 130～131；Riordan,J.F.And Vallee,B.L.,Acetylation,Meth.Enzymol.,11,page 565～570,1967)。另外，碱性溶液可以水解RNA。因此，不另外使用RNase也能分解RNA得到核酸。
所述脱正电性的氨基与酸酐反应，蛋白质的氨基和RNA的氨基被酰化，失去正电性，因此，即使碱性盐的浓度低，核酸结合蛋白质也不可能再次与DNA连接。然后，加入乙醇，DNA以纤维状态从溶液中分离，将其收集并用乙醇洗涤、干燥，得到白色DNA纤维。
为将得到的副产物作为肥料使用，加入与所用碱同当量的硝酸或磷酸，将pH调整到中性后，进行单纯蒸馏。此时回收的乙醇可再用于该工艺。蒸馏后残留的副产物含有90％以上的硝酸盐和各种有机物、磷酸盐等，因此可直接作为肥料使用。硝酸钠的氮含量为16％，可作为使土质变成弱碱性的土壤复活剂。因此，本发明完全不产生引起环境问题的污染物，能经济地提取DNA，并且残留的副产物可作为液体氮肥使用，非常经济。
本发明中精制DNA，如
图1至图4所示，有效地分离DNA，并用核糖核酸水解酶(RNAse A)和核酸水解酶(DNAseⅠ)分别处理后，用琼脂电泳凝胶确认结果，可确认是由纯DNA构成。
下面举实施例具体说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。实施例1在含有4M NaNO3、0.1M Na2CO3、20mM EDTA的溶液(溶液1，pH值约11)300ml和含有4M NaNO3、0.1M NaHCO3、20mM EDTA的溶液(溶液2，pH值约8.3)300ml中分别加入25g乌贼的精原细胞，用家庭用搅拌器粉碎5分钟，在冷藏室内粉碎1小时并过滤。在过滤液中加入2ml的乙酸酐，4℃酰化反应1小时。为选择性地除去蛋白质，在用乙酸酐处理的前或后，加入硫酸铵使其最终浓度为50％，进行沉淀反应。然后，添加乙醇至其最终浓度为20～80％，在4℃下搅拌混合30分钟，离心分离，回收DNA沉淀物。该物质再次用70％乙醇5ml洗涤两次后，真空下蒸出乙醇，得到DNA。所述回收的DNA溶解在TE(Tris-EDTA)缓冲液中，进行1.8％琼脂糖胶电泳，将TE溶液中DNA样品0.1ml加入到1.9ml的蒸馏水中，测定吸光度。其结果如
图1和表1所示。
图1中泳道1是使用溶液1得到的精原细胞提取物立即进行电泳的结果；泳道2同泳道1但使用溶液2的结果；泳道3是使用溶液1得到的精原细胞提取物以乙酸酐处理后，立即进行电泳的结果；泳道4同泳道3但使用溶液2的结果；泳道5是使用溶液1得到的精原细胞提取物以硫酸铵处理，沉淀蛋白质，残留的上清液用乙醇沉淀的结果；泳道6同泳道5使用溶液2的结果；泳道7是使用溶液1得到的精原细胞提取物用乙酸酐处理后，以硫酸铵沉淀，残留的上清液用乙醇沉淀的结果；泳道8同泳道7，但代替溶液1使用溶液2的结果；泳道9是使用溶液1得到的精原细胞提取物以乙酸酐处理后，用20％乙醇沉淀的结果；泳道10同泳道9但用40％乙醇沉淀的结果；泳道11同泳道9但用60％乙醇沉淀的结果；泳道12及15同泳道9但用80％乙醇沉淀的结果；泳道13是使用溶液1得到的精原细胞提取物不做乙酸酐处理，用乙醇沉淀的结果；泳道14同泳道13但使用溶液2的结果；泳道16同泳道15但使用溶液2的结果。
表1测定实施例1中分离的DNA的吸光度
如
图1所示，与未进行乙酸酐处理相比较，经乙酸酐处理的DNA分离更好；与用弱碱性(pH值8.3)溶液2处理相比，用高碱性溶液(pH值11)处理的实验结果，DNA的提取效率高。为沉淀蛋白质使用硫酸铵时，与未使用硫酸铵比较没有太大差异。观察表1的吸光度，发现与使用弱碱性pH值8.3溶液相比，高碱性pH值11的溶液1可得到高纯度DNA。实施例2在含有4MNaNO3、0.1MNa2CO3的溶液(溶液1、pH值约11)500ml和4M NaNO3、0.1M NaHCO3的溶液(溶液2、pH值约8.3)500ml中分别加入51g乌贼的精原细胞，用家庭用搅拌器粉碎5分钟，在冷藏室内用超声波粉碎器粉碎1小时并过滤。在过滤液中加入2ml的乙酸酐，4℃酰化反应1小时后，再加入2ml乙酸酐，用超声波粉碎器粉碎15分钟左右后，再次进行1小时酰化反应。然后，添加乙醇至其最终浓度为20％,30％,40％,50％,60％,70％，使其最终体积为20ml后(参照表2)，在4℃搅拌混合30分钟，离心分离，回收DNA沉淀物。进而将其用70％乙醇5ml洗涤2次在真空下蒸发出乙醇得到DNA。在所述回收的DNA中加入TE缓冲液(pH 8.0)5ml，待溶解后，进行1.8％琼脂糖胶电泳，TE溶液中DNA样品0.1ml加入到1.9ml的蒸馏水中，测定OD值。其结果如
图1和表3所示。
表2不同乙醇浓度的样品容量
图2中泳道1和泳道4是使用溶液1的结果；泳道2和泳道5是使用溶液2的结果；泳道3和泳道6是使用除去抑制核酸水解酶作用的20mM EDTA的溶液1的结果。
表3不同乙醇浓度时测定的吸光度
如图2和表3所示，乙醇浓度为20％,30％,40％时，虽纯度高但回收率低，乙醇浓度为40％,50％,60％时，纯度相对低，但回收率高。另外，细胞提取物立即进行电泳时(泳道1～3)，蛋白质成分和DNA凝结，留在穴内，进行酰化反应后，DNA能与蛋白质有效地分离。实施例3在所述实施例1和实施例2中，为确认DNA完全被提取和分离，进行DNase和RNase酶实验。所述实施例1和2中得到的DNA样品10μl、和10倍浓缩反应缓冲液(10mM Tris,pH 7.6,10mM MgCl2,50mMNaCl,1mM二硫苏糖醇DTT)10μl、酶(DNase或RNase)10μl、D.W.70μl混合，总体积为100μl后，在36.7℃下反应2小时30分钟，在低温箱中放置一夜后进行1.8％琼脂糖胶电泳。其结果如图3所示。如该图所示，用DNase处理结果，几乎没有留下推测存在DNA的谱带，用RNase处理时，DNA完全留在其中。实施例4在含有4M NaNO3、0.1M Na2CO3的溶液(PH值约11)300ml中加入25g明太鱼的精原细胞，用家庭用搅拌器粉碎，在冷藏室内用超声波粉碎器粉碎1小时并过滤。在过滤液中加入2ml的乙酸酐，4℃酰化反应1小时后，再加入2ml乙酸酐，4℃进行2小时酰化反应。然后，添加乙醇至其最终浓度为50～60％，在4℃搅拌混合30分钟，离心分离，回收DNA沉淀物。该沉淀物用70％乙醇洗涤一次后，蒸发乙醇，得到DNA。所述回收的DNA溶解在TE(PH8.0))缓冲液中。为确认得到的DNA纯粹提取和分离，进行DNase酶实验。上面得到的DNA样品10μl和10倍浓缩反应缓冲液(10mM Tris,pH7.6,10mMMgCl2,50mM NaCl,lmM DTT)10μl、蒸馏水70μl混合，总体积为100μl后，在36.7℃放置过夜(16小时)反应后，进行1.8％琼脂糖胶电泳。其结果如图4所示。如图4所示，用DNase处理结果，几乎没有留下推测存在DNA的谱带。在该图中，泳道1表示明太鱼的精原细胞提取的DNA，泳道2表示从所述明太鱼的精原细胞中提取的核酸，用DNase水解的结果。另外，测定吸光度结果，在常温进行酰化反应时，OD260/280=1.93,DNA的浓度(mg/ml)为1.15，而在低温进行酰化反应时，OD 260/280=1.96,DNA浓度(mg/ml)为1.05，证明低温酰化反应的提取率高。
如以上说明所述，本发明不使用污染物质，容易且有效地分离鱼类的DNA。另外，本发明方法的残留的副产物中含有硝酸盐、磷酸盐、各种有机物等，直接作为液体肥料成分使用，非常经济。
图2为不同乙醇浓度的琼脂糖胶电泳照片。
图3为用核酸分解酶处理的琼脂糖胶电泳动照片。
图4为从明太鱼的精原细胞分离的DNA的琼脂糖胶电泳动照片。
权利要求
1．从鱼类的精原细胞中提取核酸的方法，其特征是包括下列步骤A)破碎鱼类的精原细胞，得到乳白色的胶体；B)在所述胶体中加入含有1M以上的pH值为8～12的一价离子盐的碱性溶液；C)向上述步骤得到的混合溶液中加入乙醇，沉淀核酸。
2．权利要求1所述的从鱼类的精原细胞中提取核酸的方法，其特征是所述鱼类的精原细胞为乌贼的精原细胞或明太鱼的精原细胞。
3．权利要求1所述的从鱼类的精原细胞中提取核酸的方法，其特征是同时进行所述的步骤A)和步骤B)。
4．权利要求1或3所述的从鱼类的精原细胞中提取核酸的方法，其特征是在所述步骤B)中增加在制备的混合溶液中加入酰化反应物的步骤。
5．权利要求4所述的从鱼类的精原细胞中提取核酸的方法，其特征是所述酰化反应物是酸酐。
6．权利要求5所述的从鱼类的精原细胞中提取核酸的方法，其特征是所述酸酐是乙酸酐。
7．权利要求1所述的从鱼类的精原细胞中提取核酸的方法，其特征是所述盐选自由硝酸钠、碳酸钠、磷酸钠所组成的组中。
8．权利要求1所述的从鱼类的精原细胞中提取核酸的方法，其特征是用旋转叶片型粉碎器或超声波粉碎器破碎精原细胞。
9．权利要求1所述的从鱼类的精原细胞中提取核酸的方法，其特征是增加RNA分解的步骤。
10．权利要求9所述的从鱼类的精原细胞中提取核酸的方法，其特征是所述RNA分解步骤采用碱处理或RNA酶分解。
11．液体肥料，其特征是破碎鱼类的精原细胞，在其破碎液中加入pH值为8～12的碱性溶液得到制备溶液，从制备溶液中分离DNA，所残留的溶液为液体肥料。
全文摘要
本发明提供了一种不使用污染产生物质,从鱼类的精原细胞中方便且有效地得到DNA,并使其副产物作为液体氮肥使用的方法。该方法包括:A)破碎、分离鱼类的精原细胞,得到浮白色的胶体;B)将所述胶体用含有1M以上的pH值为8~12的一价离子盐碱性溶液处理;C)向所述混合物中加入乙醇,沉淀DNA。
文档编号C12N5/02GK1302810SQ0012998
公开日2001年7月11日 申请日期2000年10月23日 优先权日1999年10月23日
发明者朴韩浯, 李仁雨 申请人:株式会社百尼尔