专利名称：提取细胞内环核苷酸的方法
技术领域：
本发明是关于小分子物质的提取方法，特别是关于提取细胞内环核苷酸的方法。
环核苷酸在细胞功能调节中起重要作用，是一项不可缺少的分子学指标。目前，对提取细胞内环核苷酸，常采用的是冻融裂解法、超声波破膜法和低渗破膜法。
冻融裂解法是通过将细胞反复冻融，使细胞膜破裂而释放出环核苷酸，采用此法时必须在细胞悬液中加磷酸二酯酶抑制剂(EDTA)，以防止环磷酸腺苷(CAMP)和环磷酸乌苷(CGMP)被磷酸二酯酶(PDE)水解。由于酶抑制剂的存在，使细胞内其他酶类未被灭活，易受冻融温度和EDTA的交互影响，从而影响细胞内环核苷酸的含量，特别是对CGMP的影响，使其含量偏高。
超声波破膜法是通过超声波发生器机械性破细胞膜，释放出环核苷酸。该法需用三氯醋酸或高氯酸终止酶反应，但细胞的膜蛋白经酸固定后会影响破膜率，并且在破膜后须用水饱和乙醚提取三氯醋酸或用碱中和高氯酸。整个提取过程操作步骤多而复杂，易造成实验误差大，并且受到仪器设备限制，不易推广应用。
低渗破膜法采用细胞悬液中加水低渗、破膜，然后加热和加酸去蛋白，由于终止酶反应前细胞受到低渗刺激，影响环核苷酸的含量，加之须除去膜蛋白和提取酸，否则环核苷酸含量偏高。
用上述各方法提取细胞内环核苷酸，均须经过破膜，并且要加一定的试剂。膜蛋白和试剂的存在，以及温度的变化，影响了环核苷酸的含量。由于提取过程操作步骤多而复杂，易造成实验系统误差大，而且所需仪器设备要求高，不易推广应用。
本发明的目的是建立一种操作简单，易推广，不受温度和试剂影响的提取细胞内环核苷酸的稳定方法。
本发明采用加热提取细胞内环核苷酸的方法，是将自然沉降的血浆，用等渗离子液做基质进行细胞分离处理，处理后的细胞悬液置于80°～100℃水浴加热5～40分钟，立即冰浴冷却，经离心后的上清液即含环核苷酸。
本发明是在加热终止酶反应的同时，提取细胞内的环核苷酸，提取时不需要加EDTA和其它试剂，可以消除酶抑制剂等试剂和温度变化对细胞内环核苷酸含量的影响;并且采用等渗离子液为基质以提高细胞存活率，特别是不经过破膜，其可溶性蛋白小于100微克/107细胞，因此不需要除蛋白。整个操作简便，结果稳定，可以减少实验的系统误差，提高结果准确性，易于推广。并且还适用于提取血小板内的环核苷酸，以及作体外抗炎、免疫、药理等实验研究。
本发明的实施例是这样的抗凝血置室温下自然沉降30～40秒，吸出富有白细胞的血浆，根据标准要求分别分离白细胞、淋巴细胞、血小板等。若处理白细胞、淋巴细胞，则分别取富有白细胞的血浆沉淀物和淋巴细胞分离后的沉淀物，用少量生理盐水悬浮，加四倍体积的蒸馏水低渗30秒～2分钟(视标本对象而定)，立即加3.6%氯化钠恢复等渗，再离心，取沉淀物加0.1%葡萄糖等渗离子液洗2次，取其细胞悬液分装试管内，置80°～100℃水浴，加热5～40分钟，取出试管，放入冰浴冷却，然后经3000rpm离心10分钟，上清液即含环核苷酸。可直接定量吸取上清液，加上一定量的氚标抗原和一定稀释量的抗体，作放射免疫竞争反应，测定环核苷酸的含量。也可以将上清液定量吸入小烧杯中，置65℃水浴蒸干，放入冰箱保存，待测环核苷酸，保存期可达2～3个月。
进行细胞分离处理所用的0.1%葡萄糖离子液的组成是138mMNaCl2.7mMKCl8.1mM Na2HPO41.5mM KH2PO41mM MgCl20.6mM CaCl20.1%葡萄糖液，PH7.4。
用该离子液做基质，可以提高细胞存活率。
权利要求
1.一种提取细胞内环核苷酸的方法，是将自然沉降的血浆经细胞分离处理后的细胞悬液，其特征在于该自然沉降的血浆用等渗离子液做基质进行细胞分离处理，将处理后的细胞悬液置80°～100℃水浴加热5～40分钟后，经冰浴冷却，离心后的上清液即含环核苷酸。
2.按权利要求1所述的提取细胞内环核苷酸的方法，其特征在于等渗离子液组成为138mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，1mM MgCl2，06mM CaCl2，0.1%葡萄液，PH7.4。
全文摘要
一种提取细胞内环核苷酸的方法，不需要破膜，也不受温度和试剂的影响，而是通过加热，在终止酶反应的同时提取细胞内的环核苷酸，操作简便快速，提取结果准确，易于推广应用。
文档编号G01N33/50GK1032032SQ8710620
公开日1989年3月29日 申请日期1987年9月5日 优先权日1987年9月5日
发明者楼兰花 申请人:浙江中医学院