在cho细胞内表达重组蛋白的方法

专利名称：在cho细胞内表达重组蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及在CHO细胞系内表达重组产物基因的方法，涉及重组CHO细胞系，还涉及新的表达载体构建物。
中国仓鼠卵巢细胞(CHO)哺乳动物表达系统被广泛用于生产重组蛋白。除了诸如杂交瘤细胞系等淋巴细胞系之外，它是极少数能够简单而有效地进行高密度动物细胞悬浮培养的细胞系之一。而且，它们的产品得率非常高，抗代谢压力能力较强，淋巴细胞则较难进行产业规模的培养。考虑到生产成本，这对于获得生物反应器每轮运行的蛋白最大得率来说至关重要。培养基组成的选择，生物反应器的设计和操作这些参数影响着得率，但其优化十分复杂。增强调控蛋白质表达的启动子的强度和转录活性更有可能提高得率。在静止期以106至107细胞/毫升的细胞密度进行基因表达的高密度或补料分批批培养中，单细胞表达水平的增长将转化为相当可观的得率增长。
US5,866,359描述了一种在CHO细胞和NSO细胞内通过弱启动子与腺病毒E1A的共表达来增强本已很强的hCMV启动子的表达。E1A是一种多功能转录因子，作用于细胞周期调节，同时具有独立转录活化结构域和抑制功能结构域。将E1A表达水平精调到较低水平是实现基因的反式激活和避免对细胞周期进展造成不利影响之间理想平衡的关键。除了需要仔细选择启动子驱动的E1A表达之外，该系统的缺点还在于部分抑制E1A表达细胞的蛋白质合成能力而不是目标重组蛋白的表达。
WO95/17516在B细胞系的淋巴细胞例如广泛使用的NSO骨髓瘤内用鼠免疫球蛋白γ2A基因座将表达载体构建物导向高活性基因座。NSO细胞是一种鼠浆细胞或B细胞肿瘤细胞系。唯有在B细胞内，还该免疫球蛋白基因座的染色质才处于完全活化且开放的状态，才允许整合于这些基因座中的天然免疫球蛋白启动子或重组表达构建物表现出高转录活性。
其缺点在于，由于同源重组原则，只有在含有该重组热点的γ2A导向序列相匹配的鼠细胞系内，导向序列才能有效定向；要获得高水平的表达，γ2A基因座区必需是一个基因转录活跃区，这限制了导向序列与B细胞类细胞同源重组的有效性。
本发明的目标在于提供一种适合CHO蛋白表达的表达系统，该系统能够增强标准启动子的表达。根据本发明，为CHO细胞的表达载体配备一段原用于在鼠B细胞内同源重组的基因导向序列出人意料地实现了这一目标。
附图显示了本发明几种可能的实施方式。其中

图1CHO-K1细胞瞬时转染中，hCMV启动子和hCMV启动子在IgG 2A热点序列存在下的绿荧光蛋白(GFP)相对表达水平。
图2稳定转染的CHO-K1细胞内，hCMV启动子和hCMV启动子在IgG 2A热点序列存在下的GFP相对表达水平。
图3带有IgG 2A导向序列的hCMV-MIE表达载体的质粒图谱。
根据本发明，一段用于在哺乳动物细胞内表达重组基因的DNA序列包含重组产物基因和调控该产物基因表达的启动子，以CMV启动子为佳，还包含能够增强启动子所调控表达的鼠免疫球蛋白γ2A基因座DNA序列或其片段或其序列变体。根据本发明，这样的DNA序列可用于构建在CHO细胞内表达重组产物的表达载体。
根据本发明，重组蛋白质的表达包括以下步骤a.培养以表达载体转染的CHO细胞，该表达载体含有能在CHO细胞内驱动重组蛋白表达的启动子和能够增强所述启动子活性的鼠IgG 2A基因座DNA或其序列变体或其片段，和b.收获产物蛋白。
本发明的重组产物指希望大量表达和收获的产物蛋白。它可以是各种感兴趣的蛋白质，例如白介素之类治疗用蛋白质，酶，或抗体等多聚体蛋白的亚基，或它们的片段。重组产物基因可包含一段信号序列，其编码的序列令表达的多肽向宿主生产细胞外分泌。本发明另一优选实施方式中，所述产物蛋白是分泌蛋白。更好的是，第一蛋白或产物蛋白是抗体或基因工程抗体或其片段，最好是免疫球蛋白G(IgG)抗体。
鼠免疫球蛋白γ2A基因座(IgG 2A)的DNA序列最早在WO95/17516中被设计用作基因组导向序列用于产生高表达重组产物的稳定重组B淋巴细胞系。B淋巴细胞或浆细胞一般以极高的水平表达Ig重链基因座的免疫球蛋白RNA，这可能是因为其细胞类型特异性启动子/转录因子活性和开放式染色质结构。本发明优选的鼠免疫球蛋白γ2A基因序列与WO95/17516所用的导向序列相同。这是一段5.1kb的BamHI基因组片段，包括除CH1外显子最5’部分之外全部的鼠Igγ 2A编码区(Yamawaki-Kataoka，Y.等，美国科学院学报(1982)792623-2627；Hall，B等，分子免疫学(1989)26819-826；Yamawaki-Kataoka，Y.等，核酸研究(1981)91365-1381)。根据本发明，促进定点同源重组不是相关的免疫球蛋白γ2A(IgG 2A)基因特性。因此，所述IgG 2A基因序列的各种变体或其片段或变体的片段，如果在CHO细胞内瞬时表达或稳定表达条件下都能够增强重组产物基因在启动子例如优选的hCMV启动子调控下的表达，则都在本发明范围之内。
这样，“功能性”变体包括例如碱基的插入、缺失或点突变，并可用本领域熟知的方法来产生，例如引物引导的PCR，“易错”PCR，“基因改组(gene-shuffling)”PCR即通过PCR将交叠的DNA片段进行重新组合，或者先对细菌克隆进行体内随机诱变然后在CHO细胞内进行基因库转染和功能选择。例如，随机诱变可按照Miller，J.，的《分子遗传学实验》(冷泉港，1972)所述用烷基化剂或UV-辐照进行。或者，还可以采用宿主菌的天然突变株。
在DNA序列中，这样的变体序列或序列片段与天然免疫球蛋白γ2A基因座相应部分的序列同源性至少为65％，至少75％为佳，至少90％最好。例如，可以在位于膜外显子2(M2)上游39bp处的天然StuI位点插入一个SalI限制位点作为鼠免疫球蛋白γ2A序列内一个独特的线性化位点；这样的序列变体最初被设计用于定点重组导向，但也可用于本发明目的。
“启动子”指引导RNA聚合酶与DNA结合并启动RNA合成的一段DNA序列。本发明的启动子是在CHO细胞内有活性的启动子。这样的启动子最好是强启动子。强启动子指在CHO-KI细胞内引发mRNA合成的频率等于或高于hCMV核心启动子/增强子片段(US5168062)的启动子。这样的启动子可以是例如US5589392所述的细胞类型依赖性启动子，但更好的是通用强启动子，尤其是组成型活性的病毒启动子，例如SV40病毒的早期或晚期启动子，人或鼠巨细胞病毒(mCMV或hCMV)的立即早期启动子，单纯性疱疹病毒的胸苷激酶(TK)启动子，Rous肉瘤病毒长末端重复启动子(RS-LTR)，尤其好的是US5,385,839和/或EP-323997-A1所述的呈2.1kb PstI片段的hCMV-MIE启动子。EP-323 997-A1所述的带有hCMV主要立即早期(MIE)基因的完整首个功能性内含子的hCMV启动子尤为本发明实施方式所优选。
用于本发明的hCMV启动子在其上游/增强子部分最好没有“调节子(modulator)”序列部分。已发现，“调节子”序列对hCMV启动子在CHO细胞内的活性不利，该序列从MIE转录起始位点-750bp处延伸至-1150bp(Meier等，1996，Intervirology39331-342，“hCMV立即早期基因表达的调控”)，在瞬时转染中尤其不利。没有调节子序列的IgG 2A热点序列(无调节子或缩写为mod-)对hCMV启动子的增强效应甚至更明显。
瞬时转染的特征在于不对载体所带的选择标记施加任何选择压力。瞬时转染所得的是一混合细胞群，其中既有摄取了外源DNA并能够表达的细胞也有没有摄取外源DNA的细胞。那些表达外源表达盒的细胞常常还没有将转染的DNA整合到基因组内，因而容易丢失外源DNA，而且其在瞬时转染细胞群培养物中的生长优于转染细胞。所以，刚转染后的表达最强，而后逐渐减弱。较好的是，将本发明所述的瞬时转染子理解为能够在转染后，在无选择压力的条件下，在细胞培养物中维持90小时的细胞。
较好的是，本发明的转染CHO宿主细胞是稳定转染的细胞，尤其是就前述hCMV启动子而言。稳定转染即新引入的外源DNA通过随机非同源重组被整合到基因组DNA内；就载体序列而言，本发明所述的稳定转染可能丢失与重组产物基因表达非直接相关的部分载体序列，例如在基因组整合后成为多余的细菌拷贝数控制区。转染细胞至少向基因组内整合了表达载体的一部分或多个不同部分。类似的，本发明所述的转染宿主细胞还包括用两个或数个DNA序列转染CHO细胞从而至少在体内形成本发明表达载体必需元件的功能性对等物，即合适的启动子和IgG 2A热点序列调控下的产物基因。关于DNA片段转染后功能性DNA序列的体内装配可参见例如WO99/53046。如果进一步受到为基因扩增而施加的选择压力，这样的稳定整合可能会在CHO细胞内形成双微染色体。这也属于本发明所述的“稳定”。本发明表达载体随机整合到CHO细胞基因组内后，导向序列将增强启动子促进重组产物蛋白表达的活性。这一效应是无法基于成熟鼠B细胞系例如浆细胞瘤(plasmacytoma)骨髓瘤细胞系内的同源基因定向所实现或预见的；在那样的定向中，IgG 2A导向序列的作用仅限于提高高得率同源整合子(integrants)的频率，因为IgG 2A基因座是一重组“热点”。如上所述，在合适的目标B细胞内，免疫球蛋白基因组区的染色质处于开放的高活性状态。
“表达载体”指转染后mRNA在合适的哺乳动物宿主细胞内转录和翻译所必需的DNA序列。正确构建的表达载体通常应包含至少一个可在动物细胞中表达的选择标记，用于插入重组产物基因的表达盒使其处于上游启动子区调控之下的数量有限的有用的限制位点。如果仅用于瞬时/游离型表达，表达载体还可以包含一个复制起点，例如Eppstein Barr病毒(EBV)或SV40病毒的复制起点，用于在真核细胞宿主内自我复制/游离型维持，但可以没有选择性标记。表达载体例如但不限于线性DNA片段，包含细胞核定向序列或针对与转染剂之间的相互作用而进行了优化的DNA片段，动物病毒或可以在细菌之间穿梭和复制的合适的质粒。可以采用各种常用选择标记，例如胸苷激酶(tk)，二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)。优选实施方式之一采用了可表达的GS选择标记(Bebbington等，1992，“以谷氨酰胺合成酶基因作为可扩增选择标记，重组抗体在骨髓瘤细胞中的高水平表达”，Bio/Technology10169-175；Cockett等，1990，“利用谷氨酰胺合成酶基因扩增，金属蛋白酶组织抑制剂在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内的高水平表达”，Bio/Technology8662-667)。GS系统是仅有的两种对治疗用蛋白质生产来说特别重要的系统之一。与二氢叶酸还原酶(DHFR)系统相比，GS系统在生长过程中具有很大的时间优势，因为该系统一般可由最初的转染子形成高产细胞系，这样就不必通过不断提高选择试剂浓度的多轮选择来实现基因扩增(Brown等，1992，“用谷氨酰胺合成酶(GS)系统生产重组抗体的方法的发展”，Cytotechnology9231-236)。不用说，与采用表达标记基因的第二转录单元等效的是利用例如常用的内部核糖体进入位点，一个表达单元可以用一个单顺反子表达盒同时表达产物基因和标记基因。反之，本发明的热点IgG 2A序列和包含启动子和/或标记盒的表达盒不一定要在同一表达载体上顺式运作；上述元件可以由共转染的不同载体或DNA片段携带，然后在染色体上唯一的串联整合位点进行整合。
本发明的另一目的是提供用本发明DNA序列转染的CHO宿主细胞。其它目的还包括转染此类宿主细胞的方法和在此类宿主细胞内表达重组产物基因的方法。本发明说明书中对优选实施方式的解说和引用同样适用于以上所述本发明的其它目的。需要指出的是，用本发明DNA序列或载体转染的宿主细胞应理解为瞬时转染或稳定转染的细胞系。本发明可根据宿主细胞类型选用各种转染技术，例如本领域熟知的电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、脂质转染等。
合适的宿主细胞系可以是各种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(Puck等，1958，试验医学杂质108945-955)。“宿主细胞”指能在培养物中生产并表达所需的重组蛋白质产物的细胞。合适的细胞系可以是例如CHO KI(ATCC CCL-61)，CHOpro-3，CHO DG44，CHO P12或dhfr-CHO细胞系DUK-BII(Chassin等，PNAS77，1980，4216-4220)或DUXB 11(Simonsen等，PNAS80，1983，2495-2499)。在CHO细胞中，免疫球蛋白基因的基因座是不活跃的，因而染色质处于紧密包装(packaged)或闭合状态。这样，由于染色质的这种特殊状态，整合到免疫球蛋白基因座内的任何基因构建物都不能高水平地表达重组蛋白，除非该构建物自带能够开启染色质中该表达盒两侧的旁侧基因座调控区。而且，免疫球蛋白基因序列，尤其是其内含子部分，表现出相当的种间差异，例如在小鼠和仓鼠之间的差异。免疫球蛋白基因座的启动子或增强子元件都是种特异性且组织特异性的，而且只在B细胞内具有活性。各种天然免疫球蛋白启动子可产物编码完整IgG重链的全长转录产物，本发明鼠IgG 2A序列即使没有这样的天然启动子存在仍然能够在CHO细胞内增强基因的表达。较好的是，本发明IgG 2A序列没有这样的启动子。出人意料的是，用本发明表达载体瞬时转染CHO细胞后，鼠IgG 2A导向序列甚至增强了CHO细胞内的基因表达(图1)；这样的瞬时表达是本发明方法的又一优选实施方式。一般发生在转染后20-50小时的瞬时表达试验中，转染载体一直是染色体外元件，没有整合到基因组内。
适合哺乳动物细胞系的培养基和培养方法是本领域众所周知的，可参见例如US5633162。用于实验室锥瓶培养或低密度细胞培养并根据不同细胞类型的需要而进行了改进的标准细胞培养基有例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(Morre，G.，美国医学协会杂志，199，p.519 f.1967)，L-15培养基(Leibovitz，A.等，美国卫生杂志，78，1p.173 ff.1963)，Dulbecco’s改进的Eagle’s培养基(DMEM)，Eagle’s基本必需培养基(MEM)，Ham’s F12培养基(Ham，R.等，美国科学院学报53，p288 ff.1965)或Iscoves’s改进的无白蛋白、运铁蛋白和卵磷脂的DMEM(Iscoves等，试验医学杂志1，p.923 ff.，1978)。例如，Hams’s F10或F12培养基是专门为CHO细胞培养设计的。其它适合CHO细胞的培养基可参见EP-481 791。已知，可在这样的培养基内补加胎牛血清(FBS，又称FCS)，从而提供激素和生长因子的充沛的天然来源。动物细胞培养现在已经是一种常规操作，在科教课本和手册中有详尽的描述，例如，在R.Ian Fresney，《动物细胞培养手册》第4版(Wiley-Liss/N.Y.，2000)有详细的记载。
较好的是，本发明的细胞培养基不含胎牛血清(FBS或FCS)，可称为“无血清”。在无血清培养基中，细胞一般需要胰岛素和运铁蛋白以达到最佳生长状态。至少部分运铁蛋白可以用非肽类螯合剂或WO94/02592所述的环庚三烯酚酮等铁载体取代，或通过提高某种有机铁的含量并最好配以抗氧化剂例如维生素C来取代。大多数细胞系需要一种或多种合成生长因子(包含重组多肽)，包括例如表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，胰岛素样生长因子I和II(IGFI，IGFII)等。可能需要的其它因子还包括前列腺素，转运和结合蛋白(例如血浆铜蓝蛋白，高密度和低密度载脂蛋白，牛血清白蛋白(BSA))，激素，包括甾体类激素，以及脂肪酸。多肽因子试验最好按步骤进行，即在已知促生长多肽存在下测试新的多肽因子。那些生长因子是合成或重组的。在动物培养方面有多种方法，其中之一如下所述。首先需确定细胞从加血清培养基中转移过来后能够存活和/或缓慢生长3-6天的条件。对大多数细胞类型来说，这至少部分取决于接种密度。一旦找到了最适的激素/生长因子/多肽补剂就可降低存活所需的接种密度。在一更好的实施方式中，细胞培养基不含蛋白质，即没有胎牛血清和各种蛋白质生长因子补剂或诸如重组运铁蛋白之类其它蛋白质。
本发明方法即重组蛋白表达和收获的一种可能的实施方式是动物宿主细胞在例如工业分批生物反应器内的高密度生长。然后可进行传统的下游加工。为此，必需采用高密度生长培养基。此类高密度生长培养基通常可补充以全氨基酸等营养素，前述含量的葡萄糖之类能源，无机盐，维生素，微量元素(即最终浓度以微摩尔计的无机化合物)，缓冲剂，四种核苷或相应的核苷酸，(还原态)谷胱苷肽、维生素C等抗氧化剂，以及其它重要成分，例如重要的膜脂类，例如胆固醇或磷酯酰胆碱，或脂类前体，例如胆碱或肌醇。高密度培养基中上述化合物中的大多数或全部被增浓(强化)，使得它们的含量高于前述标准培养基，将GB2251249与RPMI1640相比既可看出这一点，但是作为渗透压调节基准的无机盐没有被增浓。较好的是，本发明的高密度培养基中完全氨基酸除色氨酸外都被均衡强化，含量超过每升培养基75mg。较好的是，在达到氨基酸总体要求之外，谷氨酰胺和/或天冬酰胺的含量超过1g/L，超过2g/L更好。本发明中，高密度细胞培养物指动物细胞群中活细胞的即时密度至少为105个/毫升，至少106个/毫升更好，该集群由单细胞或低活细胞密度的接种物在恒量或递增量的培养基中连续配以而得。
更好的实施方式中，分批培养物是一个培养物系统，其中，如GB2251249所述，在通过分批补料来控制葡萄糖浓度之外，至少向细胞培养物中补加谷氨酰胺，或者还有一种或数种其它氨基酸(优选甘氨酸)以保持它们在培养基中的浓度。更好的是，将谷氨酰胺或许还有一种或数种其它氨基酸的补加与一种或多种能源例如葡萄糖的补加相结合，如EP-229809A所述。首次补料一般在培养开始后25-60小时；例如，可以在细胞密度达到106个/毫升左右时开始加料。众所周知，在培养的动物细胞中，“谷氨酰胺分解”(McKeehan等，1984，“动物细胞中的谷氨酰胺分解”，培养细胞中的糖代谢，M.J.Morgan编辑，Plenum出版社，纽约，pp.11-150)可能成为生长期的重要能源。补加谷氨酰胺和/或天冬酰胺(关于用天冬酰胺替代谷氨酰胺可参见Kurano，N等，1990，生物技术杂志15，113-128)的总量一般为0.5-10g/L培养物，以1-2g/L为佳；补料中可以包含的其它氨基酸的总补料量为10-300mg/L培养物，具体地说，甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的补料量可以相对较高，至少150-200mg。所述补料可以是间歇式添加(shot-addition)或连续泵送添加，优选几乎连续地向生物反应器泵送补料。不用说，在分批培养过程中，通过加碱或缓冲剂，生物反应器内的pH被精心调控为最适合给定细胞系的生理pH。用葡萄糖作为能源时，总葡萄糖补料量一般为1-10g/L培养物，以3-6g/L为佳。补料中除氨基酸外最好还含有少量例如5-20mg/L培养物的胆碱。更好的是，胆碱的补加与乙醇胺的补加相结合，就象US6048728所述，尤其是同时补加谷氨酰胺的时候。不用说，如果采用GS-标记系统，谷氨酰胺的需量低于非GS-标记系统，内源性产生的谷氨酰胺之外过量谷氨酰胺的累积会产生氨和中毒。对GS来说，培养基或补料中的谷氨酰胺一般可用它的对等物和/或前体代替，即用天冬酰胺和/或谷氨酸。
本发明的另一个目的在于设计一种表达载体，它包含至少一个(第一)产物基因转录单元，该单元在宿主细胞内表达后即产生蛋白质，而且该单元受小鼠巨细胞病毒启动子(mCMV启动子)调控，还包含一个第二转录单元，该单元包含谷氨酰胺合成酶(GS)标记基因。所述产物基因，或称之为感兴趣基因(GOI)，可以是例如免疫球蛋白编码序列。谷氨酰胺合成酶标记基因是编码具有酶活性的GS的序列，包括天然序列或其变体。前文关于“功能性变体”的定义，包括序列同源性优选范围，同样适用于此。较好的是，所述GS标记基因是一哺乳动物GS标记基因或其衍生物。出人意料的是，与第一转录单元中感兴趣基因受hCMV启动子调控的表达载体相比，这样的载体进入CHO细胞的转染率高得多。这并非因为mCMV启动子在CHO细胞内的转录活性比mCMV启动子高得多；通常认为，转染后，较高的代谢负荷会降低克隆的存活率，导致转染子较少。这样，不能简单地将这一效果与所表达蛋白质产物的量或意料之外的不利于转染子生长的毒性相关联。实际上，以上发现大大出乎本领域技术人员的预料。
本发明的其它目的包括以表达载体转染的动物宿主细胞尤其是CHO细胞和相关转染方法，所述载体可以保持处于染色体外，也可稳定地整合到基因组内。同样，用两个或更多个基因片段转染动物细胞尤其是CHO细胞，这多个基因片段体内形成作为本发明目标的转录单元的功能对等物，这也包括在转染的宿主细胞这一定义之中。较好的是，所述宿主细胞是稳定转染的细胞，即第一和第二转录单元都整合到染色体内。
本发明的另一目的是提供mCMV启动子用于提高在CHO细胞内转染率的用途，优选用如下表达载体进行的转染该表达载体包含至少一个第一产物基因转录单元，该单元在宿主细胞内表达后即产生蛋白质，而且该单元受小鼠巨细胞病毒启动子(mCMV启动子)调控，还包含一个第二转录单元，该单元包含谷氨酰胺合成酶(GS)标记基因。所述第一和第二表达序列由不同的载体携带，或者作为分处不同表达单元中的基因片段。而且，可以用带有mCMV的第一转录单元转染表达GS的已重组CHO细胞。根据本发明，“提高转染率”通过在相同转染条件和相同细胞培养条件下，对相同宿主细胞，将mCMV启动子和本发明表达载体存在下的转染率与相同表达载体中mCMV被换以US5658759所述和本发明SEQID NO3所示hCMV-第一内含子增强子/启动子构建物的转染率相比较来定义。对于给定的相同产物基因，该hCMV-内含子MIE-启动子构建物是测定转染率增强效果的参照标准。较好的是，mCMV可将转染率提高至少10倍。
以上定义都同样适用于本发明的各项目的。需要强调的是，鼠IgG 2A导向序列并不是实现本发明目标的前提。
鼠细胞巨噬病毒(mCMV)是高度多样性的疱疹病毒科的一员。即使是不同宿主的巨噬细胞病毒之间也可能存在显著差异。例如，mCMV与人巨噬细胞病毒(hCMV)在生物学特性、立即早期(IE)基因组织和总体核酸序列上都存在相当大的差异。而且，235kbp的mCMV没有hCMV特征性的内部重复序列和末端重复序列。所以，mCMV基因组没有异构体(Ebeling，A等，1983，病毒学杂志47，421-433；Mercer J.A.等，(1983)，病毒学129，94-126)。根据本发明，可以利用基本对应于US4968615所述约2.1kb PstI片段的启动子区或其功能性片段。更好的实施方式中，所用的cMCV启动子片段包含转录起始点(+0)至此前-500bp序列。出人意料的是，这一片段驱动的表达比自-500bp再向前多800bp的启动子盒更强。在最好的实施方式中使用的是启动子核心区，即自转录起始点至上游-150bp左右处的Xho I限制位点，甚至从天然转录起始点至上游-100bp的序列。不用说，为了包含合适的限制位点以便插入重组产物基因，可以人工改造转录起始点。
根据本发明，受mCMV启动子调控的第一转录单元可以包含至少一段内含子序列。这一做法是本领域的常识，是为了稳定RNA转录产物以提高由相应的mRNA合成蛋白质的效率。但是，为了蛋白质合成的效率，不考虑对转染率的影响，不建议在mCMV启动子构建物内包含mCVM的天然内含子。与hCMV启动子的情形(US5591639)相反，这样的mCMV第一内含子会降低mCMV启动子下重组基因的表达，所以不是优选实施方式。
序列表给出了GS标记基因盒的优选、可能实施方式。SEQ ID NO1(pEE15.1hCMV/GFP+热点)和SEQ ID NO2(pEE14.4 hCMV/GFP)是适宜的SV40(早、晚)启动子调控的GS基因盒范例，这是一个中等偏弱启动子，序列中还包含一个hCMV启动子调控下的GFP(绿荧光蛋白)表达盒。SEQ ID NO1是SV40早期启动子调控下的GS cDNA序列，有关其细节详见附图3。SEQ ID NO2一人造GS小基因盒，其中包含一个SV40晚期启动子调控下的内含子。CHO细胞不是天然谷氨酰胺营养缺陷型的，所以可以进行Cockett等所述的选择方案(1990，“利用谷氨酰胺合成酶基因扩增在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内高表达金属蛋白酶的组织抑制剂”，Bio/Technology8662-667)。该文献还例举了适合CHO细胞的转染方法例如，可以采用经典的磷酸钙沉淀法或较新的脂质转染技术。转染率一般定义为受转染细胞群中转染阳性细胞(瞬时转染)或克隆(选择期后的稳定转染)的数量。本发明的效果可以通过例如用脂质转染法(任意市售试剂和生产商的说明书)以包含SEQ ID NO3(pEE12.4 hCMV-GFP+SV 40早期启动子/GS cDNA)或SEQ IDNO4(pEE12.4 mCMV-GFP+SV 40早期启动子/GS cDNA)的质粒转染CHO-K1细胞来展现。可将转染后细胞培养在各种常规培养基中。这些培养基可以是前述含血清培养基或无血清培养基。较好的是含血清培养基，尤其是补充了至少1％(v/v)胎血清，最好是至少5％(v/v)胎血清，例如胎牛血清。另一优选实施方式采用电穿孔转染法。
实施例实验1包含热点序列的GFP载体在CHO-K1内的瞬时表达和稳定表达CHO-K1细胞(ATCC CCL-6)在含10％FCS的普通细胞培养基(GMEM-S)中适应和培养。为了进行GS选择，培养基必须完全不含谷氨酰胺，如后文表1所示；因此必需使用经透析FCS。培养均为36.5℃、125rpm的摇瓶培养。采用脂质转染(SuperfectinTM，Gibco，UK)，转染子细胞群的绿荧光在FACS中用488nm激发波长测定。对每一种GS/GFP载体构建物，各进行5次转染，所有数据都是分析5个独立细胞群所得的平均值。从转染后48小时的瞬时转染子开始，挑选细胞数vs.荧光度图中表达水平为最高值10％的活细胞来确定平均荧光度(图1)。通过在正向vs.侧向散射图(Forward vs.Sideward scatter diagram)中通过门控(gating)挑选出活细胞群。
为了产生稳定转染子，转染后24小时，在无谷氨酰胺培养基中添加25μMMSX(甲硫氨酸sulphoximine，Crockett等，ibd.)，继续培养且定期分割培养物，持续26天，如此选择GS标记。观察其它氨基酸水平的中值对于MSX选择强度的影响，参见Bebbington等，US5827739。然后如上所述进行荧光度分析(图2)。
以非转染细胞作为阴性对照。SEQ ID NO1展示了热点载体(pEE15.1’hCMV+热点)，它驱动GFP在hCMV启动子调控下的表达，该启动子含有完整的CMV第一内含子，该载体实际上就是图3所示的pEE15.1载体内多接头区的Eco RI限制位点插入了GFP序列。对应于SEQ ID NO3的pEE 12.4‘hCMV与pEE 15.1’hCMV+热点的区别仅在于不含内有IgG 2A序列的5.1kb的Bam H1片段。将pEE 12.4作为载体对照。另一个载体对照是pEE 12.4‘hCMV(Kozak-)’，是通过引物引导的诱变(Sambrook等，《分子克隆》，冷泉港，1983)将与翻译起始点重合的克隆位点的Kozak序列(GCCGCCACCATGG)移码突变为功能性Kozak序列(ACCATGGTCCATGG)而形成的，由此消除了原先的Kozak翻译起始点。SEQID NO1所示的载体被进一步删除hCMV增强子部分400bp的调节子区，删除转录起点上游-750bp处的增强子元件，由此形成pEE 15.1‘hCMV(mod-)/GS cDNA’。如图2所示，将pEE 15.1(图3)的GS cDNA盒换作SEQ ID NO2所示的pEE 14.4‘hCMV(mod-)/GFP的GS(小基因)，形成pEE 15.1‘hCMV(mod-)/GS小基因。这样，所有被转染细胞都含有包含GFP编码序列的质粒载体。GS小基因含有单个GS基因的第一内含子和一段约1kb的3’侧翼DNA，处于SV40晚期启动子调控下；据信，基因组GS DNA的3’部分可提高载体DNA的拷贝数，因而可提高被转染细胞内的GS含量(见US4770359，Bebbington等)。虽然本发明的所用的hCMV载体都表达GS cDNA序列中的GS标记基因，仍使用GS小基因作为又一对照来排除GS拷贝数和表达水平可能造成的影响。
为了分析稳定转染的GHO细胞的产生和表达，用线性化的热点载体pEE 15.1‘hCMV+热点’载体进行转染。Sal I线性化质粒在含IgG 2A的序列部分被切断，游离的DNA末端可能促进基因组区域的重组，所述基因组区域的两侧DNA需与所述末端具有一定程度同源性，由此可测试鼠IgG 2A在CHO细胞内可能具有的定向效果。Pvu I切断在细菌内酰胺酶标记基因内，因而能够促进异源随机重组。实际上，Pvu I线性化转染子内的荧光度较高，说明载体线性化有一定的影响，而且CHO细胞内向免疫球蛋白基因座的定向不能解释本发明的效果。此外，在瞬时转染细胞群中也一样观察到启动子活性增强与各个载体构建物的相对强度密切相关。显然，在转染早期没有发生基因组整合。
图3显示了约12830bp的载体pEE 15.1。有关GS标记和hCMV-p/内含子表达盒的详细描述可参见US5827739和US5591639。pEE 15.1是本发明表达载体的一种可能实施方式，但其多接头位点中没有插入编码重组产物蛋白的DNA序列。SEQ ID NO1展示了含有GFP的pEE 15.1构建物全部13535bp的序列其中，GFP编码序列插在读码框内的Eco RI限制位点，该位点位于中部的12814碱基处；该独特限制位点含有ATG起始密码并优化了起始密码的Kozak序列环境，其详述可参见US5591639。这样，GFP蛋白表达就处于hCMV-重要立即早期基因启动子(hCMF-MIE或简写为hCMV)调控下，其后则紧接hCMV-MIE基因的第一内含子，再后面是Nco I位点(见US5591639)。多接头区下游的SV40聚A位点确保了聚腺苷酸化的完成。pEE 15.1还含有一段编码仓鼠谷氨酰胺合成酶(GS)的cDNA序列，该序列受SV40早期启动子调控，其后是SV40内含子+聚A序列。IgG 2A基因座或“热点”序列(阴影框CH1，Hi，CH2，CH3，M1和M2代表重链恒区，铰链区，细胞膜锚定区)即WO9517516及其参考文献中所述的鼠IgG 2A基因座的5.1kb BamH I片段。图中显示了独特的Pvu I和Sal I限制位点。
实验2用电穿孔法以mCMV p12.4-GFP构建物(SEQ ID NO4)转染CHO细胞将附壁CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)培养在EP-48791所述含2mM谷氨酰胺并补加了10％FCS的Iscoves’s DMEM培养基中。可选的是，在如实验1所述进行GS标记选择之前，可用表1所示含2mM谷氨酰胺的G-MEM培养基。使细胞脱壁，沉淀，然后在无血清培养基中重悬两次，最后配成每毫升5.3×106个细胞的密度。每批750μl，总共4×106个细胞接受电穿孔。如《分子生物学方法》，JA Nickoloff编，Humana出版社，1995，Vol.48/Chap.8“动物细胞电穿孔和电融合方法”所述进行电穿孔。将p12.4mCMV-GFP载体DNA(SEQ ID NO4)线性化。将50μl(20μg)DNA加入电穿孔小杯内的750μl细胞中，进行300V/750μFD，约12-14毫秒的电穿孔。然后，将800μl细胞转移到T75锥形瓶中的25ml改进型Glasgow-MEM(GMEM，Gibco)培养基(含10％胎血清，但不含谷氨酰胺，详见表1)中进行GS选择。将12.9ml分入第二T75锥形瓶，37℃和10％CO2中培养过夜。
次日，加入补充了10％FBS+33.3μM MSX的GS选择GMEM培养基。这样，MSX的最终浓度约为25μM。继续培养26天后，计点每瓶中的菌落数亦即转染子数。用标准倒置显微镜对每一培养瓶进行显微镜检，阳性克隆发出亮绿的光，因而很容易计点。
SEQ ID NO4所示的mCMV构建物产生的菌落数比SEQ ID NO3所示hCMV构建物转染的细胞多20倍。这两种载体构建物的区别仅在于驱动GFP表达的CMV启动子不同，载体的其余部分是一样的(包括GS标记；p12.4的cDNA GS-标记盒)。如果在转染后立即将细胞稀释并加入96格培养板，mCMV细胞形成的菌落(＞400个)仍比hCMV转染的细胞(约45个)多。
表1GS选择培养基A.储备液
1.双蒸水高压灭菌，每份400ml2.10×Glasgow MEM(GMEM)培养基，不含谷氨酰胺(GIBCO042-2541，在UK)。4℃保存。
3.7.5％碳酸氢钠(GIBCO043-05080，在UK；670-5080，在US)。4℃保存。
4.100×非必需氨基酸(NEAA)(GIBCO043-01140，在UK；320-1140，在US)。4℃保存。
5.100×谷氨酸+天冬酰胺(G+A)加600mg谷氨酸和600mg天冬酰胺(Sigma)。用蒸馏水配制成100ml，经2μm滤膜(Nalgene)过滤除菌。4℃保存。
6.100mM丙酮酸钠(GIBCO043-01360，在UK；320-1360，在US)7.50×核苷35mg腺苷35mg鸟苷35mg胞苷35mg尿苷12mg胸苷都购自Sigma。用水配制成100ml溶液，过滤除菌，分成每份10ml于-20℃保存。
8.经透析FCS(GIBCO014-06300)。在56℃热灭活30分钟，-20℃保存。采用GS选择时，必需使用经透析FCS。
9.每毫升5000单位的青霉素-链霉素(P/SGIBCO043-05070，在UK；600-5070，在US)。
10.100mM L.MSX(Sigma)配成18mg/ml的PBS溶液。过滤除菌，-20℃保存。
B.培养基的制备以无菌操作按以下顺序依次加入以下物质，配制成GMEM-S培养基。
1.水400ml2.10×GMEM 50ml3.碳酸氢钠 18.1ml4.NEAA 5ml5.G+A 5ml6.丙酮酸钠 5ml7.核苷 10ml
8.经透析FCS 50ml9.青霉素-链霉素 5mlGMEM-S培养基含有非必需氨基酸，丙氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，脯氨酸和丝氨酸(100μM)，谷氨酸和天冬酰胺(500μM)，腺苷，鸟苷，胞苷和尿苷(30μM)，以及胸苷(10μM)。
序列表<110>英国龙沙生物医药股份有限公司<120>在CHO细胞内表达重组蛋白的方法<130>049369<150>GB0216648.6<151>2002-07-19<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6679<212>DNA<213>仓鼠(Hamster sp.)<220>
<221>misc_feature<223>Seq.ID.No.4环形质粒GS载体p12.4短mCMV-GFP/克隆3<400>1gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg420
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<221>misc_feature<223>Seq.ID.No.3环形质粒GS载体p12.4 hCMVp-6FP/克隆13<400>2gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg420cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct480gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt540tcaacaggtc cagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca600ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca660gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcgg gcatcaccgg720
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<211>10369<212>DNA<213>仓鼠(Hamster sp.)<220>
<221>misc_feature<223>Seq.ID.No.2环形质粒GS-小基因载体p14.4 Delta调节子(mod-)hCMVp-GFP/克隆6<400>3gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg420cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct480gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt540tcaacaggtc cagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca600ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca660gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcgg gcatcaccgg720cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc780tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc840cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa900cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg960acctcgggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 1020aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 1080tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 1140gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 1200cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 1260cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 1320
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<221>misc_feature<223>Seq.ID.No.1环形质粒GS+IgG 2A热点导向载体pEE 15.1 hCMVp-GFP/克隆11<400>4gaattcattg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 60cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 120gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 180agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 240tgtctggcgg ccgcgacctg caggcgcaga actggtaggt atggaagatc cctcgagatc 300cattgtgctg gcggtaggcg agcagcgcct gcctgaagct gcgggcattc ccagtcagaa 360atgagcgcca gtcgtcgtcg gctctcggca ccgaagtgct atgattctcc gccagcatgg 420cttcggccag tgcgtcgagc agcgcccgct tgttcctgaa gtgccagtaa agcgccggct 480gctgaacccc caaccgttcc gccagtttgc gtgtcgtcag accgtctacg ccgacctcgt 540tcaacaggtc tagggcggca cggatcactg tattcggctg caactttgtc atgcttgaca 600ctttatcact gataaacata atatgtccac caacttatca gtgataaaga atccgcgcca 660gcacaatgga tctcgaggtc gagggatctc tagaggatcc atattcgcga atatgccggc 720atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa 780gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc 840ccgtggccgg gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg 900tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag 960agcgtcgagt cctccgtgtt cgaagcgatc cctgtccagt ggtgtgcaca ccttcccagc1020tgtcctgcag tctgacctct acaccctcag cagctcagtg actgtaacct cgagcacctg1080gcccagccag tccatcacct gcaatgtggc ccacccggca agcagcacca aggtggacaa1140gaaaattggt gaggaaaaca aggggagtag aggttcacaa gtgattagtc taaggcctta1200gcctagctag accagccagg atcagcagcc atcaccaaaa atgggaactt ggcccagaag1260agaaggagat actgactgtg actccctctt ggaaacttct aactatgacc acctaccttc1320aaggtcatga tcctctagga tagatgtcct tggtcatttc caggatcatc ctgacctaag1380gccataccca gggacaaagt ccctggtttg gtgccttttc tccttcaaac ttgagtaacc1440cccagccttc tctctgcaga gcccagaggg cccacaatca agccctgtcc tccatgcaaa1500tgcccaggta agtcactaga ccagagctcc acccgggaga atggtaagtg ctgtaaacat1560ccctgcacta gaggataagc catgtacaga tccatttcca tctctcctca tcagcaccta1620acctcttggg tggaccatcc gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga1680tctccctgag ccccatagtc acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagatg1740
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1.一种以表达载体转染的CHO细胞，所述表达载体包含在CHO细胞内具有活性并驱动重组产物蛋白表达的启动子和鼠IgG 2A基因座DNA内增强所述启动子活性部分。
2.如权利要求1所述的CHO细胞，所述载体还包含编码选择标记的转录单元，所述选择标记以谷氨酰胺合成酶标记为佳。
3.如权利要求1或2所述的CHO细胞，所述CHO细胞被稳定转染。
4.一种表达重组蛋白的方法，包括以下步骤c.培养以表达载体转染的CHO细胞，所述表达载体包含在CHO细胞内具有活性并驱动重组产物蛋白表达的启动子和鼠IgG 2A基因座DNA内增强所述启动子的活性的部分；d.收获产物蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，所述启动子是强病毒启动子，以hCMV启动子为佳。
6.如权利要求4或5所述的方法，所述IgG 2A基因座部分没有天然免疫球蛋白启动子。
7.一种哺乳动物表达载体，至少包括包含产物基因并受mCMV启动子调控的第一转录单元，还包括包含谷氨酰胺合成酶标记基因的第二转录单元。
8.用权利要求7所述载体转染的CHO细胞。
全文摘要
一种用包含鼠IgG 2A基因座的表达载体在CHO细胞内表达重组蛋白的方法。
文档编号C12N15/87GK1668749SQ03816914
公开日2005年9月14日 申请日期2003年7月21日 优先权日2002年7月18日
发明者R·卡利迈耶, R·盖伊 申请人:英国龙沙生物医药股份有限公司