专利名称：一种将胞内蛋白基质表达的方法和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种将胞内蛋白基质表达的方法和其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
根据定位方式，基因工程表达外源蛋白一般分为两种形式胞内表达，目的蛋白在细胞质核糖体中合成后，在一系列伴侣因子帮助下仍定位于胞内；胞外表达，目的蛋白合成后借助蛋白本身的功能序列和宿主菌的加工运输体系分泌至胞外。胞外分泌型表达可大大简化下游纯化过程，节约成本，因此在大规模工业化生产中具有绝对优势。大肠杆菌(Escherichia coli)遗传背景清楚,培养周期短,操作简单,是目前应用最广泛、最成功的外源重组蛋白表达系统。大肠杆菌天然存在5种分泌途径，各种分泌途径均有其特定的转运蛋白和分泌机制，且对重组蛋白均有独特的要求，一般来讲，只有在天然状态下为胞外酶在重组表达时才有可能实现基质分泌型表达，而未见胞内蛋白通过宿主菌的分泌系统转运至细胞外的报道。大肠杆菌的细胞膜有两层，内膜由磷脂和膜蛋白组成，其中磷脂包括 70-80 % 的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl-ethanolamine)，15-20 % 的磷脂酰甘油 (phosphatidylglycerol)和低于5%的心磷脂(cardiolipin),外膜内侧富含饱和脂肪酸和磷脂酰乙醇胺，外侧主要为脂多糖。人为地增大细胞膜的通透性，可以加快胞内产物的排出速率，以利于目标蛋白在培养基中的积累。对细胞膜通透性进行调控的方法很多，从遗传学的角度来看，可以选育出细胞膜通透性突变株；从后期调控角度看，根据物质跨膜转运机制的不同，可以采取相应的方法。目前应用较为广泛的是化学法，在培养基中添加诸如青霉素、Mn2+、表面活性剂、Na+、甘露醇等，可在一定程度上破坏细胞膜的完整性，提高发酵产量。角质酶是一种多功能酶，可水解各种可溶性酯类、乳化的甘油三酯、不溶性脂肪酸酯、不溶性多聚体角质等，目前已有报道来源于F. solani的角质酶具有磷脂酰乙醇胺(大肠杆菌内膜磷脂的主要成分，外膜的组成部分)的水解活性。因此可通过角质酶对大肠杆菌细胞膜磷脂成分的水解作用提高细胞膜的通透性来使胞内目标蛋白基质表达。本发明选取两种重要的工业用酶半乳糖苷酶和异淀粉酶作为报告蛋白。 β-半乳糖苷酶是一种多功能酶，能作用于乳糖的β (I —4)糖苷键，形成半乳糖基-酶复合物，在该酶的水解活性下，复合物进一步水解，生成半乳糖；而在该酶的转苷活力作用下， 复合物进一步与单糖、二糖或三糖等结合，生成低聚半乳糖。β -半乳糖苷酶是工业酶法生产新型功能性低聚糖低聚半乳糖的主要用酶，市场需求大；异淀粉酶能够专一性地切开支链淀粉分支点中的α-1，6糖苷键，剪下整个侧枝，生成长短不一的直链淀粉。目前已广泛应用于淀粉糖浆、啤酒和酒精生产等多个淀粉深加工领域和医药领域。
发明内容
本发明提供了一种将胞内蛋白基质表达的方法，是将T.fusca角质酶基因(NCBI 编号AAZ54921)和胞内目标蛋白基因在宿主菌大肠杆菌中共表达，经发酵培养，收集发酵上清液。为解决上述技术问题，具体方法为I)将pETDuet-Ι质粒和Tfu_0883/pET20b (+)进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，得到重组质粒Tfu_0883/pETDuet-l ；2)将Tfu_0883/pETDuet-l和含有胞内目标蛋白基因的重组质粒pET20b (+)进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，得到含有目标蛋白基因的重组质粒 Tfu_0883/pETDuet-l ；3)将含有目标蛋白基因的重组质粒Tfu_0883/pETDuet_l导入宿主大肠杆菌；4)步骤3)构建的重组大肠杆菌发酵生产目标蛋白，收集发酵上清液。所述宿主菌可以为E.coli BL21(DE3)、Ε· coliW3110、Ε· coliJM109、 E. coliJM109(DE3)、E. coliDH5a 等，其中优选 E. coli BL21(DE3)。所述携带角质酶和目标蛋白的载体为pETDuet-1、pCOLADuet-1等双启动子载体； pUC系列，pET系列，pT7-7, pGEX等任--种。所述胞内目标蛋白是指目标蛋白在胞内表达，其在细胞质核糖体中合成后，在一系列伴侣因子帮助下仍定位于胞内；例如半乳糖苷酶(NCBI编号ΑΕ006641)和异淀粉酶(NCBI编号NC_007333)。β -半乳糖苷酶是一种多功能酶，能作用于乳糖的β (I — 4) 糖苷键，形成半乳糖基-酶复合物，在该酶的水解活性下，复合物进一步水解，生成半乳糖； 而在该酶的转苷活力作用下，复合物进一步与单糖、二糖或三糖等结合，生成低聚半乳糖。 β -半乳糖苷酶是工业酶法生产新型功能性低聚糖低聚半乳糖的主要用酶，市场需求大； 异淀粉酶能够专一性地切开支链淀粉分支点中的a -I，6糖苷键，剪下整个侧枝，生成长短不一的直链淀粉。目前已广泛应用于淀粉糖浆、啤酒和酒精生产等多个淀粉深加工领域和医药领域。含角质酶重组质粒的构建方法为将pETDuet-Ι质粒(购自Novagen公司)和Tfu 0883/pET20b (+)进行双酶切，用T4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，挑选转化子并提取质粒。所述Tfu_0883/pET20b (+) (Chen S，Tong X，Woodard Rff, Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterization of Bacterial Cutinase, The Journal of Biological Chemistry, 2008, 283 (28) 25854-25862)为含有 T. fusca 角质酶基因(NCBI 编号AAZ54921)的重组质粒。胞内目标蛋白的表达将上述含角质酶重组质粒与含胞内目标蛋白基因的重组质粒进行双酶切，连接酶连接，转化E. coli JM109感受态细胞，挑选转化子并提取重组质粒， 将其导入宿主菌，进行液体培养。本发明通过共表达T. fusca角质酶，大肠杆菌细胞通透性提高，目标蛋白在培养基中酶活可达到总酶活的80%以上,使胞内蛋白实现基质表达。
具体实施例方式实施例I :Tfu_0883/pETDuet-l重组质粒的构建将pETDuet-Ι质粒和实验室前期构建的 Tfu_0883/pET20b (+)进行NcoI和HandI 11双酶切，酶切产物割胶回收后，用T4连接酶16 °C连接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37°C培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养，然后提取质粒，得到重组质粒Tfu_0883/pETDuet-l。Tfu_0883/lacS/pETDuet-l 重组质粒的构建Tfu_0883/pETDuet_l 质粒和实验室前期构建的lacS/pET20b(+)(吴敬，陈晟，吴玉飞，陈坚，夏泽华一种β _半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用.201110247338. 3)进行NdeI和XhoI双酶切，酶切产物割胶回收后，再用Τ4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化Ε. coli JM109感受态细胞，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37°C培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养，然后提取质粒，得到重组质粒Tfu_0883/lacS/pETDuet-l。β -半乳糖苷酶的表达与制备将Tfu_0883/lacS/pETDuet-l转化E. coli BL21 (DE3)宿主菌，在含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上经37°C培养8_10h，挑选转化子在LB液体培养基中37°C培养8-10h，后以5%接种量接入TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L， 酵母膏 24g/L，K2HPO4 12. 54g/L，KH2PO4 2. 31g/L)发酵液体培养基(含 100 μ g/mL 氨苄青霉素)37°C培养2h后用ImM IPTG (异丙基硫代-β -D半乳糖苷)诱导约16h。发酵液于4°C，SOOOrpm离心lOmin，分别测定发酵液上清和细胞中的β-半乳糖苷酶酶活为102U/mL和17U/mL，胞外酶活占总酶活的85. 4%。实施例2 Tfu_0883/Tfu_1891/pETDuet-l 重组质粒的构建将 Tfu_0883/pETDuet_l 质粒和实验室前期构建的Tfu_1891/pET20b(+)(吴敬，陈晟，段绪果，陈坚一种酸性耐热异淀粉酶基因工程菌及其应用.201110459137. X)进行NdeI和XhoI双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37°C培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养，然后提取质粒，得到重组质粒Tfu_0883/Tfu_1891/ pETDuet-Ιο异淀粉酶的表达与制备将Tfu_0883/Tfu_1891/pETDuet_l 转化 E. coli BL21 (DE3)宿主菌，在含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上经37°C培养8_10h，挑选转化子在LB液体培养基中37°C培养8-10h，后以5%接种量接入TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L， 酵母膏 24g/L，K2HPO4 12. 54g/L，KH2PO4 2. 31g/L)发酵液体培养基(含 100 μ g/mL 氨苄青霉素)37°C培养2h后用ImM IPTG (异丙基硫代-β -D半乳糖苷)诱导约16h。发酵液于4°C，SOOOrpm离心lOmin，分别测定发酵液上清和细胞中的异淀粉酶酶活为733U/mL和142U/mL，胞外酶活占总酶活的83. 8%。
权利要求
1.一种将胞内蛋白基质表达的方法，其特征在于，将NCBI编号为AAZ54921的角质酶基因和胞内目标蛋白基因在宿主菌大肠杆菌中表达，发酵培养并收集发酵上清液，所述胞内目标蛋白为在细胞内表达的蛋白质。
2.权利要求I所述的方法，其特征在于，具体方法为1)将pETDuet-Ι质粒和Tfu_0883/pET20b(+)进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，得到重组质粒Tfu_0883/pETDuet-l 2)将Tfu_0883/pETDuet-l和含有胞内目标蛋白基因的重组质粒pET20b(+)进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，得到含有目标蛋白基因的重组质粒 Tfu_0883/pETDuet-l ；3)将含有目标蛋白基因的重组质粒Tfu_0883/pETDuet-l导入宿主大肠杆菌；4)步骤3)构建的重组大肠杆菌发酵生产目标蛋白，收集发酵上清液。
3.权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、 E.coli W3110.E. coli JM109、E.coli JM109 (DE3)、E. coli DH5 α 中任——种。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。
5.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述含有胞内目标蛋白基因的重组质粒 pET20b (+)为 lacS/pET20b (+)或 Tfu_1891/pET20b(+)。
6.—种权利要求I所述方法在表达胞内蛋白中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种将胞内蛋白基质表达的方法和其应用，属于生物工程技术领域。是将T.fusca角质酶和胞内目标蛋白在大肠杆菌中共表达，从而实现目的蛋白的胞外表达，发酵培养上清酶活可达到总酶活的80％以上，可简化后提取工艺，具有较高的学术意义和应用价值。
文档编号C12R1/19GK102586312SQ20121004596
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者吴敬, 宿玲恰, 陈坚, 陈晟 申请人:江南大学