专利名称：布氏杆菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体及其包被的免疫磁珠和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，涉及布氏杆菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体及其包被的免疫磁珠和应用。
背景技术：
布氏杆菌病(Brucellosis)是重要的人兽共患细菌性传染病。布氏杆菌 (Brucella)感染多种家畜、野生动物引起的发热、流产、不孕不育、关节疾患、神经损害，由此造成家畜的使役性能、生产性能降低，导致了畜牧业巨大的经济损失；布氏杆菌还能感染人，造成人的急、慢性布氏杆菌病，该病已成为畜牧兽医从业人员、实验室相关病原研究人员、牲畜屠宰、乳肉品皮毛加工及动物饲养人员等最常见的职业性疾病，形成了严重的公共卫生问题。Brucella传统分离培养方法需要在预增菌培养液中连续培养6周，每周在固体选择性培养基上作继代培养，耗时长，并且每次继代培养的取样量较少，划线培养后，一些杂菌快速摄取培养基中的有效营养成分，严重干扰Brucella的分离培养，造成传统分离方法的敏感性和检出率降低；酶联免疫吸附试验(ELESA)、核酸探针杂交、聚合酶链式反应 (PCR)、实时定量PCR(Real-time PCR)等方法敏感、特异、且检出率较高，但存在一定的非特异性反应，不能区分活菌和死亡细菌。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种布氏杆菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽及其特异性抗体。本发明的另一目的是提供包被有该抗体的免疫磁珠。本发明的又一目的是提供该免疫磁珠的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现布氏杆菌异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽，是由人工分析布氏杆菌特异性表面蛋白的抗原表位，人工设计、改造、串联、表达后获得，其氨基酸序列为SEQ ID No. 1，编码所述含布氏杆菌特异性表面蛋白多抗原表位的核苷酸序列为SEQ ID
No. 2o一种布氏杆菌特异性抗体，该抗体是由所述的含布氏杆菌特异性表面蛋白多抗原表位的人工多肽免疫成年新西兰兔获得的布氏杆菌特异性抗体。由所述的布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠。一种利用所述的试剂盒富集检测布氏杆菌的方法，按如下步骤进行(I)样品的预增菌依据SN/T 1088-2010进行，样品加入预增菌培养液后，在微需氧条件(5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气)下，36±1°C培养7d;也可用等效的方法进行预增菌；
(2)取所述预增菌液20_30mL，加入所述的布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠 50μ L，37°C孵育 Ih ；(3)将其放于磁力架上，3min后弃去上清，加入30mL PBS缓慢重悬，磁力架吸下免疫磁珠后，弃去上清，如此重复洗涤3次；(4)吸附后的免疫磁珠直接铺于选择性平板(如双向选择Castaneda氏培养基) 上进行分离培养，或直接提取吸附后的免疫磁珠上的DNA用PCR或荧光PCR进行检测；为避免免疫磁珠上抗体影响菌落的生长状态，可以向吸附后的免疫磁珠中加入ImL 50mmol/L 甘氨酸溶液(PH2. O)，间断振荡洗脱Ih ;将离心管放于磁力架上，待免疫磁珠全部被吸附于管壁上时取出上清，用洗脱下的菌液直接铺于选择性平板上进行分离培养，或直接提取DNA 后用PCR或荧光PCR进行检测。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明选择布氏杆菌3个位于菌体表面的特异性蛋白各选取一个抗原性较强的表位，人工设计出一条布氏杆菌特异性多表位人工多肽，并利用纯化的多肽作为抗原免疫新西兰兔，获得的布氏杆菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体对布氏杆菌具有良好的特异性。与常规方法相比，本发明布氏杆菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体包被的免疫磁珠可以从体积较大的样品预增菌液中将布氏杆菌富集，极大地提高下一步分离培养或 PCR检测的敏感性；并且本发明布氏杆菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体包被的免疫磁珠能够特异性地吸附样品预增菌液中布氏杆菌，可排除其它杂菌对下一步的分离培养或 PCR检测的干扰，以提高布氏杆菌的检出率。由于磁珠包被有特异性抗体，富集效果及效率大大提高，磁珠与细菌结合是通过非共价键结合，不会影响布氏杆菌的生理和生化特性。利用该免疫磁珠或试剂盒能从样品预增菌液中将布氏杆菌富集，极大地提高下一步分离培养或PCR检测的敏感性和检出率，具有特异性好，灵敏度高，简单，方便，快速，适合大规模样品检测的优点。
具体实施例方式实施例II.布氏杆菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽(也称布氏杆菌多表位抗原，或称Brucella多表位抗原重组蛋白，下同)的设计、合成与克隆通过Epitope Conservancy Analysis软件预测3个位于菌体表面的特异性蛋白 (布氏杆菌外膜蛋白0mp25、0mp31和BCSP31)的抗原表位，从每个蛋白各选取一个抗原性较强的表位，人工设计出一条多肽，其编码的氨基酸序列为SEQ IDNo. 1，长度为88个氨基酸； 结合原核表达载体E. coli密码子的简并性，设计编码该人工多肽的核苷酸序列，在其上下游分别添加BamH I和Hind III酶切位点后，核苷酸序列为SEQ ID No. 2，长度为276bp。经人工合成并克隆至PMD19-T载体，获得克隆质粒pMD19-T-BMEA-A。2.布氏杆菌多表位抗原的质粒构建按照碱裂解法提取重组质粒pMD19-T-BMEA-A，BamH I和Hind III双酶切后电泳， 回收大小为276bp的特异性目的片段，与表达载体pET-32a(+)用T4DNA连接酶(TaKaRa 公司)按照说明书的条件进行连接，按照常规方法转化到感受态细胞E. coli BL2KDE3) 中，筛选到阳性表达质粒pET-32a-BMEA-A。对表达质粒pET_32a-BMEA_A进行PCR扩增、BamH I和Hind III双酶切，电泳后在大小约为276bp处均出现特异性条带。对表达质粒 pET-32a-BMEA-A进行测序，确定其核苷酸序列无误。3.布氏杆菌多表位抗原的表达及纯化将含有表达质粒pET-32a-BMEA-A的E. coli BL21 (DE3)于LB培养基中培养至对数生长期(OD6tltlnmSO. 6-0. 8)，加入IPTG至浓度为O. 4mM，37°C诱导4h后离心，菌体沉淀用PBS 缓冲液重悬，超声裂解后离心，上清用O. 45 μ m微孔滤膜过滤后,用His Bind Purification Kit (Novagen公司)按照说明书的方法纯化。纯化的重组蛋白用SDS-PAGE电泳分析,观察到约30kD的特异性蛋白条带，大小与预计相似，说明纯化的Brucella多表位抗原重组蛋白纯度较好。实施例2布氏杆菌多表位抗原的反应原性和免疫原性鉴定I.免疫转印将实施例I纯化的Brucella多表位抗原重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，凝胶用半干转印仪(Bio-Rad)电转印至PVNF膜(Osmonics公司)。将转印后的PVNF膜用1%牛血清白蛋白4°C过夜封闭，加入I 200稀释的牛抗Brucella全菌阳性血清，37°C作用I. 5h 后洗膜；加入I 8000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛IgG，37°C作用Ih后洗膜；用3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色5min后，显示单一的特异性条带，大小与重组蛋白相似，说明制备的Brucella多表位抗原重组蛋白具有良好的反应原性。2.兔免疫试验将实施例I纯化的Brucella多表位抗原重组蛋白加入等量的弗氏完全佐剂 (GIBC0公司)乳化，皮下多点注射成年新西兰兔，O. 5mg/只，2周后加入等量弗氏不完全佐剂乳化抗原进行二免，第5周和第8周时分别进行三免和四免，方法同二免，第10周时采血收集血清(下文称抗血清)，用ELISA方法鉴定血清抗体和重组蛋白。结果显示制备的抗血清与Brucella多表位抗原重组蛋白反应效价大于I : 512 000,与灭活牛布氏杆菌S19 菌体反应效价大于I : 6 400,Brucella多表位抗原重组蛋白与牛抗Brucella全菌血清反应效价大于I : I 600，说明制备的抗血清与菌体具有良好的反应性。鉴定好的抗血清用 Brucella多表位抗原重组蛋白偶联的凝胶做亲和层析，纯化后的抗体用紫外分光光度计测定蛋白浓度后分装，_20°C冻存备用，用于实施例3的免疫磁珠制备。ELISA反应程序为灭活的Brucella菌体或Brucella多表位抗原重组蛋白用 lmol/L的Tris-HCl (pH为7. 5)稀释，4°C包被过夜；I % BSA (质量浓度)4°C封闭过夜；预稀释好的抗血清或牛抗Brucella全菌血清、以及阴性对照血清倍比稀释，加入酶标板，每孔100 μ L，37°C作用I. Oh ;加入稀释好的HRP标记的羊抗兔二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗)，37°C作用I. Oh ;邻苯二胺(0PD)37°C避光显色15min ;用2mol/L H2SO4终止显色，测定OD49tlnm值，计算P/N值，以P/N彡2. 5的血清最高稀释度作为血清效价。3.重组蛋白抗血清特异性实验将牛布氏杆菌S19、空肠弯曲菌ATCC 29428、霍乱弧菌ATCC 51394、副溶血型弧菌 89001(中国药品生物制品检定所)、阪崎氏肠杆菌ATCC 29544、蜡样芽孢杆菌ATCC 63301、 沙门氏菌ATCC 14028、大肠埃希菌ATCC 25922、甲型溶血型链球菌CMCC 32205、痢疾志贺氏菌CMCC(B) 51105、单增李斯特菌CMCC(B) 54002、铜绿假单胞杆菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 25923这13种细菌灭活后包被ELISA板，兔抗重组蛋白阳性血清(即布氏杆菌多表位抗原的特异性抗体)以I : 50稀释后再做倍比稀释，间接ELISA确定发现除布氏杆菌(P/N为4. 69)以外，其它菌的P/N均小于2. 50，说明制备的抗血清(即布氏杆菌多表位抗原的特异性抗体)具有良好的特异性。实施例3布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠的制备I.取165 μ L磁珠悬浮液(含磁珠5mg)至离心管内，用磁力架将磁珠沉淀(以下简称磁力沉淀，其具体操作步骤是，将离心管放于磁力架上，待上层液体变澄清后弃掉上清，保留底部的磁珠，移开磁力架)；2.加入ImL磁珠偶联缓冲液，重悬磁珠后，磁力沉淀；3.先后加入75. 7 μ L磁珠偶联缓冲液和74. 3 μ L实施例2中制备的纯化布氏杆菌特异性抗体(含抗体100 μ g)混匀，再加入100 μ L处理液并混匀，置37°C摇床上孵育18h 后，磁力沉淀；4.加入ImL封闭液重悬磁珠，37°C摇床上孵育Ih后，磁力沉淀；5.加入ImL储备液,涡旋振荡5_10s后,磁力沉淀；重复该操作一次；加入240 μ L 储备液混匀，于4°C冰箱保存。磁珠偶联缓冲液lmol/L的硼酸盐缓冲液，其pH为7. 4 ;处理液组成是3mol/L的硫酸铵/lmol/L的硼酸盐缓冲液；封闭液组成是0. 5g牛血清白蛋白(BSA)溶于IOOmLPBS中，其pH为7. 4 ;储备液组成是0. Ig BSA溶于IOOmL PBS中，其pH为7. 4 ;PBS =Na2HPO4 2. 9g/L, KH2PO4 O. 2g/L, NaCl 8. Og/L, KCl O. 2g/L,其 pH 为 7. 4 ;实施例4利用实施例3制备的布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠富集检测布氏杆菌的具体步骤如下I.样品的预增菌依据SN/T 1088-2010进行，样品加入预增菌培养液(布氏肉汤， 含两性霉素终浓度1μ g/mL和万古霉素终浓度20μ g/mL)后，在微需氧条件(5%氧气、10% 二氧化碳、85%氮气)下，36±1°C培养7d ;也可用等效的方法进行预增菌；2.取所述预增菌液20_30mL，加入实施例3制备的布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠50 μ L，37°C孵育Ih ；3.将其放于磁力架上，3min后弃去上清，加入30mL PBS缓慢重悬，磁力架吸下免疫磁珠后,弃去上清,如此重复洗涤2 3次；4.吸附后的免疫磁珠直接铺于双向选择Castaneda氏培养基上进行分离培养，或直接提取DNA用PCR或荧光PCR进行检测；为避免免疫磁珠上抗体影响菌落的生长状态，可以向吸附后的免疫磁珠中加入ImL 50mmol/L甘氨酸溶液(pH2. O)，间断振荡洗脱Ih ;将离心管放于磁力架上，待免疫磁珠全部被吸附于管壁上时取出上清，用洗脱下的菌液直接铺于选择性平板上进行分离培养，或直接提取DNA后用PCR或荧光PCR进行检测。实施例5分别制备牛布氏杆菌S19和A544、羊布氏杆菌M5和M16、猪布氏杆菌S2和 S1330(均购自于中国兽医药品监察所)等6种布氏杆菌灭活菌液各25mL (菌液浓度为IO5/ mL)，加入实施例3制备的布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠，吸附后的免疫磁珠或洗脱下的菌液提取DNA，用荧光PCR鉴定，结果均为阳性。
分别制备实施例2中所述的12种非布氏杆菌菌液各25mL (菌液浓度为105/mL)， 添加牛布氏杆菌S19约IO2个，按照实施例4中的操作步骤进行。吸附后的免疫磁珠或洗脱下的菌液直接铺显色平板后培养，可观察到大量目标菌落，荧光PCR鉴定均为布氏杆菌。同时将吸附后的免疫磁珠或洗脱下的菌液提取DNA，用荧光PCR鉴定，结果均为阳性。用从市场采集样品中随机抽取鲜奶50份、牛肉和羊肉样品各20份。分别按照SN/ T1088-2010和以上免疫磁珠富集法进行检测，结果均为阴性。本实施例说明本发明利用布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠富集检测布氏杆菌的方法具有良好的特异性。
权利要求
1.布氏杆菌异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽，其特征在于编码所述人工多肽的核苷酸序列为SEQ ID No. 2、氨基酸序列为SEQ ID No. I。
2.一种布氏杆菌特异性抗体，其特征在于该抗体是由权利要求I所述的含布氏杆菌特异性表面蛋白多抗原表位的人工多肽免疫成年新西兰兔获得的布氏杆菌特异性抗体。
3.由权利要求2所述的布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠。
4.一种富集布氏杆菌的试剂盒，其特征在于含有权利要求3所述的布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠。
5.一种利用权利要求3所述的布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠富集检测布氏杆菌的方法，其特征在于按如下步骤进行(1)依据SN/T1088-2010进行样品的预增菌将样品加入预增菌培养液后，在5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气的条件下，以IOOrpm的振荡速度，36±1°C培养7d ;必要时测定增菌液的PH值并调整至7. 2±0. 2，42±1°〇继续培养2411-4811 ;亦或者用等效的方法进行预增菌；(2)取步骤(I)得到的预增菌液20-30mL，加入权利要求3所述的布氏杆菌特异性抗体包被的免疫磁珠50 μ L，37°C孵育Ih ；(3)将其放于磁力架上，3min后弃去上清，加入30mLPBS重悬，磁力架吸下免疫磁珠后，弃去上清，如此重复洗涤3次；(4)吸附后的免疫磁珠直接铺于选择性平板上进行分离培养，或直接提取吸附后的免疫磁珠上的DNA用PCR或荧光PCR进行检测；或者向吸附后的免疫磁珠中加入ImL 50mmol/ L甘氨酸溶液，间断振荡洗脱lh，将离心管放于磁力架上，待免疫磁珠全部被吸附于管壁上时取出上清，用洗脱下的菌液直接铺于显色平板上进行分离培养，或直接提取DNA后用PCR 或突光PCR进行检测。
全文摘要
本发明属于生物检测领域，公开了布氏杆菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体及其包被的免疫磁珠和应用。布氏杆菌特异性表面蛋白多抗原表位串联表达后制备的人工多肽，其氨基酸序列为SEQ ID No.1，编码所述含布氏杆菌特异性表面蛋白多抗原表位的核苷酸序列为SEQID No.2。一种富集布氏杆菌的试剂盒，含有包被布氏杆菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体的免疫磁珠。利用该免疫磁珠或试剂盒能从样品预增菌液中将布氏杆菌富集，极大地提高下一步分离培养或PCR检测的敏感性和检出率，具有特异性好，灵敏度高，简单，方便，快速，适合大规模样品检测的优点。
文档编号C12N15/31GK102584957SQ20121004596
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者唐泰山, 姜焱, 张常印, 张睿, 敖威华, 王凯民, 王海艳, 赵林立, 赵治国 申请人:内蒙古出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心