专利名称：一种tbx5蛋白的表达方法
技术领域：
本发明涉及生物技术及生物医药制品领域，具体地说，涉及一种 TBX5蛋白的表达方法。
背景技术：
生物科技的迅猛发展，人们能利用DNA重组技术，将所需的编码蛋白的DNA序列克隆到表达载体上，实现目的蛋白的大量表达。使用细菌或者真核细胞表达外源蛋白的可行性在生物技术领域有巨大潜力，近十年来，利用基因工程手段生产商业化的蛋白质需求急剧增加。大肠埃希氏菌(E. coli)已经是世界上最广泛使用的用于蛋白表达系统。由于大肠埃希氏菌的遗传背景清楚，易于生长和控制，花费低廉，重组蛋白的表达效率高，因此长 期以来，大肠埃希氏菌是实验室和工业水平生产蛋白的最广泛的方法。目前有各种各样的大肠埃希氏菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。如PET系列，pGEX系列等。pET系统是在E. coli中克隆和表达重组蛋白的最广泛也最强大的系统。目的基因被克隆到PET质粒载体后，受噬菌体T7强转录及可选择的翻译信号控制，宿主细胞提供表达所需要的17 RNA聚合酶。通过加入诱导剂IPTG诱导目的基因表达。表达载体除具有蛋白表达所需要的启动子外，在终止子前有6个His编码序列，便于蛋白的亲和层析纯化。外源蛋白在E. coli中的表达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下，更容易形成包涵体。对于可溶性蛋白和包涵体，均可用BugBuster等蛋白抽提试剂或超声裂解的方法裂解菌体抽提蛋白。近年来随着生物技术的进步，特别是基因工程的突飞猛进，表达蛋白已经变得很容易，相对而言，纯化却是一个非常繁杂的工作，所以越来越多的研究者把需要表达的目标蛋白和亲和纯化用的标签融合表达，这样纯化相对得比较容易，即使如此，由于蛋白的多样性，纯化依然是比较复杂而专业的工作，尤其对于不熟悉纯化的研究者而言，它成为一个项目的瓶颈。蛋白纯化的方法取决于多目的蛋白的属性，细胞内形成的区域与形式，PET载体，宿主菌背景及表达蛋白的应用。通常纯化蛋白使用的是亲和层析的方法。亲和层析是蛋白质或生物大分子与结合在介质上的配基特异结合，如采用结合有镍的琼脂糖在变性或非变性条件下对融合蛋白进行分离纯化。镍对6XHis-tag蛋白具有特异吸附能力，能够高效一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统(如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌)中的His标签蛋白，均有很好的纯化效果。但在研究过程中，经常遇到蛋白保留在层析柱中难洗脱的现象，采用更强的洗脱条件如500mM咪唑，仍不能洗脱，直接用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱，也有一大部分目的蛋白仍然吸附在亲和柱上。所以，对于那些用这些常用方法难于洗脱的蛋白，找到一种能够充分洗脱的方法具有重要意义。TBX5基因于1997年在Holt-Oram综合征(HOS)中被鉴别并克隆，是近年来发现的、在心脏发育过程中起重要作用的一个转录因子。人TBX5基因定位于12q24. 1，属于T-box转录因子家族，编码518个氨基酸，在胚胎心脏和发育中的肢体组织中表达。TBX5基因在脊椎动物进化过程中高度保守。在心脏发育，尤其是房室腔初始分化过程中起着十分关键的作用。在心脏发育早期，TBX5在整个心脏均匀表达；当线性心管形成时，TBX5表达呈梯度方式，后部最强，向前渐弱；当心管环化时，TBX5表达不均匀的情况愈加明显，只在未来左心室区域表达，在未来右心室和流出道区域不表达，直到心脏发育成熟，这种表达方式都保持不变。TBX5基因在早期心脏发育中的这种动态的表达方式对于心脏的正常发育，尤其是心房和左心室的正常发育是必须的。而TBX5基因表达受到精确调控，TBX5基因表达量过低或过高都将导致心脏和手畸形的发生。TBX5与另两个转录因子NKX2. 5、GATA4之
间存在着复杂的相互作用，在心脏发育中起主要作用，共同调控许多下游基因的表达。尤其最近的研究发现，采用TBX5，GATA4和MEF2C这三个转录因子可以把成纤维细胞转分化为心肌细胞，从而用于心脏再生医学的治疗与研究。但其具体的作用机制及作用途径仍不清楚。因此，为了更透切地研究TBX5的基因功能，需要得到高浓度和高纯度的TBX5蛋白。以往采用的蛋白表达系统所获得的蛋白浓度低，不能满足研究及以后临床应用的需要，因此迫切需要建立一种高效表达及分离纯化TBX5蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效简便的生产高浓度、高纯度野生型TBX5蛋白的新方法，尤其是涉及此蛋白的分离纯化方法。本发明的野生型TBX5蛋白的表达方法，包括如下步骤
(1)诱导表达基于原核系统诱导表达，裂解菌体；
(2)分离纯化利用镍柱亲和层析来分离纯化所得菌体裂解上清中的TBX5蛋白。在上述表达方法中，所述的原核系统诱导表达是重组表达质粒转化感受态细菌后，加入LB培养液，37°C振荡培养过夜，然后按2:1或者3:1体积比，转换到minimal M9中并加入0. 5mM IPTG，诱导表达。在上述表达方法中，所述的原核系统诱导表达是重组表达质粒转化BL21后，加入LB培养液，37°C振荡培养过夜，然后加大LB体积37°C振荡培养至OD值到达I. 5以上后转入minimal M9，加入0.5mM IPTG，在18°C或37°C温度下诱导表达。在上述表达方法中，所述的重组表达质粒是pET-30aSH_TBX5，所述重组表达质粒pET-30aSH-TBX5是将克隆获得的TBX5基因PCR产物，经Nco I/Hind III双酶切后，与pET载体连接，然后转化大肠杆菌，再挑选阳性克隆进行鉴定。在上述表达方法中，所述裂解菌体为超声波机械破碎菌体。在上述表达方法中，所述的分离纯化是预装镍亲和层析柱，采用5倍柱体积蒸馏水洗柱，然后用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱，将离心得到的菌体上清过柱，收集流出液，然后用含和不含IOmM咪唑的洗涤缓冲液进行洗涤；最后用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白。在上述表达方法中，所述洗脱液的配方按质量百分数计算，含有10%甘油，2%SDS，余量为水。可以选择在常温或者37°C搅拌30分钟，加速蛋白的洗脱。本发明所述的TBX5 蛋白在 NCBI 网站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)的基因 ID为6910。
本发明中的各原料均可从生物化学试剂公司购买得到，可按照本领域常规方法配制而成，这些方法为本领域普通技术人员所通晓。与现有技术相比，本发明的有益效果是
本发明采用高浓度的蛋白诱导表达方法，提高了细菌中目的蛋白的产量，裂解菌体过程中没有进行包涵体的变性和复性，而是直接从超声裂解的上清中纯化蛋白，使得目的蛋白的回收率和活性得到了最大程度的保持，而且通过优化洗脱方案使得目的蛋白的获取量较之现有方法也有了较大的提高。本发明的TBX5与镍亲和柱的结合较牢固，不易被普通方法所洗脱。本发明的洗脱液配方中同时含有甘油和SDS，且两者以一定比例的混合， 使得结合牢固的TBX5蛋白容易被洗脱下来。
图I是TBX5在不同温度和不同时间梯度时的表达。图2是采用高浓度的方法来诱导TBX5蛋白的表达。图3是不同的洗脱方式对TBX5蛋白的洗脱效果。图4是TBX5分离纯化后的Dot blotting检测。
具体实施例方式 以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例I本发明所需溶液的制备
D10XTBE Tris base 108g MddH2O 600ml 充分溶解，加Boric acid 55g，0.5M EDTA(pH8. 0) 20ml，定容至 Ho2) 0. 7% 琼脂糖凝胶0. 7gAgarose，加 I X TBElOOml，微波煮沸。3)30%丙烯酰胺29g丙烯酰胺和Ig亚甲双丙烯酰胺溶于60ml水中，37°C加热至完全溶解，补加水至终体积100ml，查证该溶液pH值小于7. 0，置于棕色瓶中室温保存。4) 10%过硫酸胺Ig过硫酸胺溶解于IOmlddH2O中，4°C保存。5)1. 5mol/L Tris (pH8. 8)80ml ddH20 中加 18. 15g Tris base,加浓盐酸调节至pH8. 8，定容至 IOOmlo6) lmol/L Tris (pH6. 8) :80ml ddH20 中加 12. Ilg Tris base,加浓盐酸调节至pH6. 8，定容至 IOOmlo7) 5 X SDS 电泳缓冲液15. Ig Tris base，94g Glycine, 50ml 10%SDS，加水定容
到Ho8)4X SDS 上样缓冲液200mM Tris HCL (pH=6. 8) 4ml, SDS I. 6g，溴酚蓝 0. 08g，40%甘油8ml，加水定容至20ml
9) LB Medium 10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，IOgNaCl，加900ml水，调节pH至7. 5，定
容至IL后高温高压灭菌。10) 5XM9 Salts :Na2HP04*7H20 64g, KH2PO4 15g, NaCl 2. 5g, NH4Cl 5g，加水定容至1L,高温高压灭菌。11)M9 minimal medium 5XM9 Salts 200ml, IM MgSO4 2ml, 20% 葡萄糖 20ml, IMCaCl2 IOOul，IM卡那霉素lml，加水定容至至1L。12 )脱色液30%甲醇和10%冰乙酸
13) TPTG 2g IPTG溶于水中，定容至10ml，滤膜过虑后分装，-20°C保存。14)结合缓冲液=NaCl 29. 25g，Tris-HCl 3. 152g，尿素 360g,加水定容至 1L，pH7. 9。15)洗涤缓冲液结合缓冲液加imidazole至终浓度为10mM。16)洗脱液20%甘油和4%SDS按体积比I: I混合。实施例2重组TBX5蛋白诱导表达
重组表达质粒Pet-30aSH-TBX5转化BL21后，铺板，挑克隆到含卡那霉素的lml LB中37°C振荡培养过夜。次日将菌液全部倒入200ml含有卡那霉素的LB中，37°C，230rpm振荡培养，至OD值为I. 5时，转换培养液为M9 minimal medium继续振荡培养lh，至OD值达到2-2. 5，然后加入0. 5mM的IPTG，分别在37°C和18°C这两种不同的温度下进行诱导。在37°C诱导的蛋白，分别在3h，4h，5h，6h和7h取样进行SDS-PAGE分析表达情况。在18°C诱导的蛋白，于12-16h后检测OD值，并取样进行SDS-PAGE分析表达情况。结果显示TBX5蛋白在37°C的表达量远高于18°C时的表达量，并且蛋白在3h时已开始大量表达(图1)，M表示分子量marker，A表示诱导温度为37°C，B表示18°C诱导过夜表达。0h、3h、4h、5h、6h、7h分别代表37°C诱导下不同时间点取样的蛋白表达情况。-TPTG代表未加诱导剂的阴性对照。实施例3高浓度表达法
挑甘油菌到含卡那霉素的lml LB中37°C振荡培养过夜。次日将菌液全部倒入400ml含有卡那霉素的LB中，37°C，230rpm振荡培养，至OD值为I. 5时，按2:1转换培养液为M9minimal medium,再额外添加2倍的葡萄糖,继续振荡培养Ih,至OD值达到3. 5-4,然后加入
0.5mM的IPTG，在37°C下进行诱导。整个诱导过程始终检测培养液的pH值，应维持在6. 0以上。3h后取样进行SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。结果显示高浓度法获取的蛋白质量比普通诱导表达高(图2)。I表示未加IPTG作为阴性对照，2表示加入IPTG诱导3h的蛋白表达情况;A表示常规诱导方法，B表示高浓度诱导方法。实施例4细菌的裂解
7000rpm离心20分钟收集菌体。弃上清，尽量去除培养基。加入30ml结合缓冲液。将重悬菌液置于15ml离心管中，超声破碎。超声过程中保持菌液处于冰浴或盐冰浴中。超声条件依赖于所使用的超声仪功率、探头种类、容器的大小形状。避免连续超声导致的大量产热，分成短时间、多次超声，且始终保持在冰浴上进行超声。一般超声30s，间隔30s，共超声6-7次，离心收集上清，再次用结合缓冲液重悬沉淀，重复以上超声步骤，直至彻底重悬沉淀。实施例5重组TBX5蛋白的分离纯化
整个过程在4°C的冷库中进行。用结合缓冲液平衡好Ni亲和层析柱后，将超声裂解得到的菌体上清缓慢过柱，用10倍体积的结合缓冲液洗涤，然后再用含IOmM咪唑的洗涤缓冲液充分洗涤非特异性结合的杂蛋白。每一步都需收集样品进行SDS-PAGE电泳检测洗涤情况。最后用10%甘油和2%SDS配制成的洗脱液进行洗脱，收集特异性结合的目的蛋白。采用以下三种洗脱方式
(I)常温下，采用传统的500mM的imidazole洗脱液进行过柱洗脱(图3A)。
(I)常温下，用洗脱液溶解结合有目的蛋白的柱凝胶，温和搅拌30分钟，离心后取上清保存(图3B)。(2)在37°C用洗脱液溶解结合有目的蛋白的柱凝胶，温和搅拌30分钟，离心后取上清保存(图3C)。采用本发明的B和C两种洗脱方式，TBX5的蛋白洗脱量与传统的A方法相比，效率有较大提高。实施例6目的蛋白的Dot blotting检测
将各次分离纯化后的蛋白样品滴加到硝酸纤维素膜上，用鼠抗人TBX5单克隆抗体4°C孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗在室温孵育2h，加显色液后暗室显影冲片，得到特异性的蛋白点(图4)，A表示阴性对照，B、C、D表示不同批次分离纯化获取的TBX5样品。实施例7蛋白定量
采用LOWRY法进行蛋白定量。将100倍体积的试剂A与I倍体积的试剂B混合，吸取2. 5、5、10、20和40ii g标准蛋白BSA至终体积为330 的水中，取IOyl样品加水至330 u I0每管加入Iml试剂A和B的混合液,充分混匀后室温放置lOmin。每管加入IOOii I试剂C，立即混匀，室温下静置45min，在600nm波长检测吸光度值。制作标准曲线，根据标准曲线计算蛋白的浓度。在200mlLB诱导表达体系中，采用传统方法获得的TBX5蛋白总量为3. 58mg，而采用本发明的诱导表达及分离纯化方法得到的蛋白总量为12mg。权利要求
1.一种TBX5蛋白的表达方法，其特征在于包括如下步骤 (1)诱导表达基于原核系统诱导表达，裂解菌体； (2)分离纯化利用镍柱亲和层析来分离纯化所得菌体裂解上清中的TBX5蛋白。
2.如权利要求I所述的表达方法，其特征在于，所述的原核系统诱导表达是重组表达质粒转化感受态细菌后，加入LB培养液，37°C振荡培养过夜，然后按2:1或者3:1体积比，转换到minimal M9中并加入O. 5mM IPTG，诱导表达。
3.如权利要求2所述的表达方法，其特征在于，所述的原核系统诱导表达是重组表达质粒转化BL21后，加入LB培养液，37°C振荡培养过夜，然后加大LB体积37°C振荡培养至OD值到达I. 5以上后转入minimal M9，加入0.5mM IPTG，在18°C或37°C温度下诱导表达。
4.如权利要求2所述的表达方法，其特征在于，所述的重组表达质粒是pET-30aSH-TBX5，所述重组表达质粒pET-30aSH_TBX5是将克隆获得的TBX5基因PCR产物， 经Nco I/Hind III双酶切后，与pET载体连接，然后转化大肠杆菌，再挑选阳性克隆进行鉴定。
5.如权利要求I所述的表达方法，其特征在于，所述裂解菌体为超声波机械破碎菌体。
6.如权利要求I所述的表达方法，其特征在于，所述的分离纯化是预装镍亲和层析柱，采用5倍柱体积蒸馏水洗柱，然后用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱，将离心得到的菌体上清过柱，收集流出液，然后用含和不含IOmM咪唑的洗涤缓冲液进行洗涤；最后用洗脱液进行洗脱，收集目的蛋白。
7.如权利要求6所述的表达方法，其特征在于，所述洗脱液的配方按质量百分数计算，含有10%甘油，2%SDS，余量为水。
全文摘要
本发明公开了一种TBX5蛋白的表达方法。包括如下步骤(1)诱导表达基于原核系统诱导表达，裂解菌体；(2)分离纯化利用镍柱亲和层析来分离纯化所得菌体裂解上清中的TBX5蛋白。本发明采用高浓度的蛋白诱导表达方法，提高了细菌中目的蛋白的产量，裂解菌体过程中没有进行包涵体的变性和复性，而是直接从超声裂解的上清中纯化蛋白，使得目的蛋白的回收率和活性得到了最大程度的保持，而且通过优化洗脱方案使得目的蛋白的获取量较之现有方法也有了较大的提高。
文档编号C12N15/70GK102703492SQ201210219310
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者余细勇, 李倩倩, 李晓红, 王建军 申请人:广东省人民医院