作为胃癌的责任因子的新型融合基因的制作方法

作为胃癌的责任因子的新型融合基因的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种鉴定在胃癌等癌中能够成为预测药剂治疗的有效性的指标的突变、检测该突变的手段、基于该突变鉴定将具有该突变的基因或其编码的蛋白质作为靶标的药剂能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的受试者的手段等。一种作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测方法，其包括：检测来自受试者的分离得到的试样中的ATG3?EPHB1融合多核苷酸、TNIK?RNF123融合多核苷酸或SLC12A2?NRG2融合多核苷酸中的任一种融合多核苷酸或由其编码的多肽的工序。
【专利说明】
作为胃癌的责任因子的新型融合基因
技术领域
[0001] 本发明涉及一种鉴定抑制作为癌的责任突变的基因融合的检测方法、鉴定抑制由 该基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的 癌患者或存在患癌风险的受试者的方法等。
【背景技术】
[0002] 癌在日本是处于死亡原因的第一位的疾病。已知癌细胞根据基因的变化而恶化。 在癌的类型中鉴定特征基因的变化，这不仅能够期待对致癌机制的阐明有贡献，而且能够 期待对癌的诊断及预后预测、癌的治疗法的开发和选择等也有贡献。
[0003] 迄今为止，报道有癌相关的许多基因。
[0004] 例如，报道了 EPHB1基因编码与神经系统等的产生相关的受体酪氨酸激酶，其蛋白 质表达的缺失或降低与胃癌中的浸润和转移(非专利文献1)、结肠直肠癌中的浸润(非专利 文献2)等相关。
[0005] 报道了TNIK(Traf2_and Nck-interacting kinase)基因是结肠直肠癌的增殖所 必需的(非专利文献3)，有可能影响到乳癌细胞的增殖(非专利文献4)等。
[0006] SLC12A2基因也被称为NKCCl(Na-K-Cl协同转运蛋白1)，暗示其调节神经胶质瘤细 胞的移动(migration)(非专利文献5) 〇
[0007] NRG2基因编码经由与ERBB家族受体的相互作用来控制细胞增殖和分化的神经调 节蛋白家族的蛋白质，其高表达显示与肿瘤的侵袭性关联(非专利文献6)。
[0008] 另外，近年来，对于癌进行了分子靶标药的开发，针对参与癌化相关的信号转导通 路的构成因子(例如激酶）的分子靶标疗法的成功案例也在增加。例如，显示：以ALK蛋白质 为靶标的酪氨酸激酶抑制剂(例如克唑替尼(Crizotinib))对具有EML4-ALK融合基因的肺 癌患者的治疗有效，以由BCR-ABL融合基因所编码的蛋白质为靶标的酪氨酸激酶抑制剂(例 如伊马替尼（Imatinib))对具有该融合基因的白血病患者的治疗有效等。
[0009] 已知在胃癌的患病率的国际比较中，在包括日本的东亚各国和南美较高。在日本， 由癌导致的死者数的部位不同的比较中，男女中胃癌导致的死者数均为第2位。在胃癌的分 子治疗中，已知有HER2等数种靶标。
[0010]现有技术文献
[0011] 非专利文献
[0012] 非专利文献l:Wang JD et al.，0ncology，2007,73(3-4),238-45.
[0013] 非专利文献2:Sheng Z et al.，Pathobiology,2008,75(5) ,274-80.
[0014] 非专利文献3:Shitashige M et al. ,Cancer Res,2010,70(12) ,5024-33.
[0015] 非专利文献4:Jiao X et al·，BMC Genomics,2013,14,165.
[0016] 非专利文献 5:Garzon-Muvdi T et al·，PLoS Biol ,2012,10(5)，e100 1320.
[0017] 非专利文献 6:Revillion F et al·，Ann Oncol ,2008,19(1) ,73-80.

【发明内容】

[0018] 发明所要解决的课题
[0019] 胃癌等癌中的突变的鉴定仍不能说是充分的，现状是期望进一步鉴定能够成为治 疗靶标、而且能够成为预测药剂引起的治疗的有效性的指标的突变。
[0020] 因此，本发明的目的在于提供一种鉴定在胃癌等癌中能够成为预测药剂治疗的有 效性的指标的突变、检测该突变的手段、基于该突变鉴定将具有该突变的基因或其编码的 蛋白质作为靶标的药剂能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的受试者的手段等。
[0021 ]用于解决课题的技术方案
[0022]本发明的发明人为了实现上述目的，重复进行了深入研究，结果发现了作为胃癌 中的新型的基因组异常的激酶融合基因(ATG3-EPHB1和TNIK-RNF123)及激酶相关分子融合 基因（SLC12A2-NRG2)。这些融合基因在正常胃粘膜组织中没有表达，另外，在检测到这些融 合基因的病例中，没有检测到作为公知的胃癌的原因基因突变的KRAS突变、NRAS突变和 BRAF突变，因此，可以认为这些融合基因为癌的责任突变(驱动突变）。
[0023] 关于ATG3-EPHB1和TNIK-RNF123融合基因，可以认为分别通过将EPHB1激酶和TNIK 激酶稳定激活而参与癌化。对于这些基因融合阳性癌，可以认为EPHB1激酶和TNIK激酶的抑 制药等分别能带来治疗效果。
[0024]另外，关于SLC12A2-NRG2融合基因，细胞增殖因子NRG2是作为胃癌的治疗靶标已 知的HER2的配体，因此，可以认为通过与HER2突变同样的分子机理而参与胃癌的发生。对于 该基因融合阳性癌，可以认为针对NRG2的抗体药或针对作为其受体的HER蛋白质群的抗体 药或激酶抑制药等能带来治疗效果。
[0025]本发明的发明人基于这些见解，进一步重复进行了研究，从而完成了本发明。
[0026] 即，本发明如下所述。
[0027] [1]-种作为癌的责任突变(驱动突变）的基因融合的检测方法，其包括检测来自 受试者的分离得到的试样中的下述(a)~(c)中的任一种融合多核苷酸或由其编码的多肽 的工序：
[0028] (a)ATG3-EPHBl融合多核苷酸，其编码包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的 多肽；
[0029] (b)TNIK-RNF123融合多核苷酸，其编码包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结 构域和环指(RING Finger)结构域、且具有激酶活性的多肽;和
[0030] (C)SLC12A2-NRG2融合多核苷酸，其编码包括SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的 多肽。
[0031] [2]如[1]所述的方法，其中，融合多核苷酸为下述(a)~(c)中的任一种：
[0032] (a)编码下述的多肽的ATG3-EPHB1融合多核苷酸：
[0033] (i)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽，
[0034] (ii)由在序列号2所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺失、取代或者添加 1个或多 个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽，或
[0035] (iii)由与序列号2所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列 构成、且具有激酶活性的多肽；
[0036] (b)编码下述的多肽的TNIK-RNF123融合多核苷酸：
[0037] (i)由序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列构成的多肽，
[0038] (ii)由在序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺 失、取代或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽，或 [0039] (iii)由与序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列具有80%以上的序 列同一性的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽;和 [0040] (C)编码下述的多肽的SLC12A2-NRG2融合多核苷酸：
[00411 (i)由序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列构成的多肽，
[0042] (^)由在序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺失、取代 或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽， 或
[0043] (iii)由与序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一 性的氨基酸序列构成、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽。
[0044] [3]如[1]或[2]所述的方法，其中，融合多核苷酸为下述(a)~(c)中的任一种：
[0045] (a)(i)由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸，
[0046] (ii)与由与序列号1所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多 核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸，
[0047] (iii)由在序列号1所示的碱基序列所构成的多核苷酸中缺失、取代或者添加 1个 或多个核苷酸的碱基序列构成、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸，或
[0048] (iv)与由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80%以上的序列同一性、 且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸；
[0049] (b)(i)由序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列构成的多核苷酸，
[0050] (ii)与由与序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列所构成的多核苷酸互 补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷 酸，
[0051] (iii)由在序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列所构成的多核苷酸中缺 失、取代或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列构成、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷 酸，或
[0052] (iv)与由序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列构成的多核苷酸具有 80%以上的序列同一性、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸;和
[0053] (c)(i)由序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列构成的多核苷酸，
[0054] (ii)与由与序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的 碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多 肽的多核苷酸，
[0055] (iii)由在序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列所构成的多核苷酸中缺失、 取代或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列构成、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸， 或
[0056] (iv)与由序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80%以 上的序列同一性、且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸。
[0057] [4]如[1]~[3]中任一项所述的方法，其中，癌为胃癌。
[0058] [5]-种鉴定癌患者或存在患癌风险的受试者的方法，上述癌患者或存在患癌风 险的受试者是抑制由作为癌的责任突变(驱动突变）的基因融合产生的融合多核苷酸所编 码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的受试者，上 述方法包括下述的工序：
[0059] (1)检测来自受试者的分离得到的试样中的下述(a)~(c)中的任一种融合多核苷 酸或由其编码的多肽的工序：
[0060] (a)ATG3-EPHBl融合多核苷酸，其编码包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的 多肽；
[0061 ] (b)TNIK-RNF123融合多核苷酸，其编码包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结 构域和环指结构域、且具有激酶活性的多肽;和
[0062] (c)SLC12A2-NRG2融合多核苷酸，其编码包括SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的 多肽;和
[0063] (2)在检测到上述融合多核苷酸或由其编码的多肽的情况下，判定为抑制上述多 肽的表达和/或活性的物质在上述受试者中能带来治疗效果的工序。
[0064] [6] -种作为癌的责任突变(驱动突变）的基因融合的检测用试剂盒，其包括下述 (A)~(C)中的任一种或它们的组合：
[0065] (A)作为探针的多核苷酸，该探针设计为特异性识别ATG3-EPHB1融合多核苷酸、 TNIK-RNF123融合多核苷酸、或SLC12A2-NRG2融合多核苷酸；
[0066] (B)作为一对引物的多核苷酸，该一对引物设计为能够特异性扩增ATG3-EPHB1融 合多核苷酸、TNIK-RNF123融合多核苷酸、或SLC12A2-NRG2融合多核苷酸;和 [0067] (C)特异性识别ATG3-EPHB1融合多肽、TNIK-RNF123融合多肽、或SLC12A2-NRG2融 合多肽的抗体。
[0068] [ 7 ]包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的、分离得到的ATG3-EPHB1融合多肽 或其片段。
[0069] [ 8 ]包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结构域和环指结构域、且具有激酶活性 的、分离得到的TNIK-RNF123融合多肽或其片段。
[0070] [9]包括SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神经调节蛋白 家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的、分离得到的SLC12A2-NRG2融合多肽 或其片段。
[0071] [10]编码[7]~[9]中任一项所述的融合多肽或其片段的多核苷酸。
[0072] [11]一种4了634?邢1、了见1(-1?吧123或51^：1242-顺62基因融合阳性癌的治疗剂。
[0073] [12]如[11]所述的治疗剂，其含有抑制下述的融合多肽的表达和/或活性的物质 作为有效成分，上述融合多肽为:包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的ATG3-EPHB1融 合多肽;包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结构域和环指结构域、且具有激酶活性的 TNIK-RNF123融合多肽；或包括SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神 经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的SLC12A2-NRG2融合多肽。
[0074] [13]如[11]或[12]所述的治疗剂，其中，癌为胃癌。
[0075] [14] -种用于癌治疗的药剂，其含有抑制下述的融合多肽的表达和/或活性的物 质作为有效成分，上述融合多肽为:包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的ATG3-EPHB1 融合多肽;包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结构域和环指结构域、且具有激酶活性的 TNIK-RNF123融合多肽；或包括SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神 经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的SLC12A2-NRG2融合多肽。
[0076] [15]如[14]所述的药剂，其中，癌为ATG3-EPHB1、TNIK-RNF123或SLC12A2-NRG2基 因融合阳性癌。
[0077] [16]如[14]或[15]所述的药剂，其中，癌为胃癌。
[0078] [17]-种癌的治疗方法，其包括对受试者投予在治疗上有效量的、抑制下述融合 多肽的表达和/或活性的物质，上述融合多肽为:包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性 的ATG3-EPHB1融合多肽;包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结构域和环指结构域、且具 有激酶活性的TNIK-RNF123融合多肽；或包括SLC12A2的AA_permease_N super family结构 域和NRG2的神经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的SLC12A2-NRG2融合多肽。
[0079] [18]如[17]所述的方法，其中，受试者为ATG3-EPHB1、TNIK-RNF123或SLC12A2-NRG2基因融合阳性癌患者。
[0080] [19]如[17]所述的方法，其中，受试者为胃癌患者。
[0081] [20]-种癌治疗剂的筛选方法，其包括下述的工序：
[0082] (1)使受试物质与表达下述的融合多肽的细胞接触的工序，其中，上述融合多肽 为:包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的ATG3-EPHB1融合多肽;包括TNIK的激酶结构 域、RNF123的SPRY结构域和环指结构域、且具有激酶活性的TNIK-RNF123融合多肽;或包括 SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神经调节蛋白家族保守区域、且 具有增强细胞内信号转导的活性的SLC12A2-NRG2融合多肽；
[0083] (2)确定是否抑制上述融合多肽的表达和/或活性的工序;和
[0084] (3)将确定为抑制上述融合多肽的表达和/或活性的物质选择作为癌治疗剂的工 序。
[0085]发明效果
[0086]根据本发明，能够检测由本申请发明首次明确的特定的癌的未知的责任突变，能 够基于该责任突变的存在鉴定癌治疗能带来效果的癌患者或存在患癌风险的受试者，进而 能够对该癌患者进行治疗。即，本发明提供一种用于癌的个体化医疗的层化生物标记物，同 时提供一种癌的分子靶标治疗中的新的靶标。
【附图说明】
[0087] 图1是表示ATG3和EPHB1的基因组结构、以及ATG3 -EPHB1融合多肽（序列号2)的结 构域结构的一例的概略图。
[0088] 图2是表示TNIK和RNF123的基因组结构、以及TNIK-RNF123融合多肽(序列号4)的 结构域结构的一例的概略图。
[0089] 图3是表示SLC12A2和NRG2的基因组结构、以及SLC12A2-NRG2融合多肽(序列号28) 的结构域结构的一例的概略图。
[0090] 图4是表示SLC12A2和NRG2的基因组结构、以及SLC12A2-NRG2融合多肽(序列号20) 的结构域结构的一例的概略图。
【具体实施方式】
[0091] 如后述的实施例所示，本发明的发明人首次发现了在癌组织中作为癌的责任突变 (驱动突变）的3种基因融合、即ATG3-EPHB1基因融合、TNIK-RNF123基因融合和SLC12A2-NRG2基因融合。本发明基于这样的见解，提供一种该基因融合的检测方法、基于该责任突变 的存在鉴定癌治疗能带来效果的癌患者或存在患癌风险的受试者的方法、癌的治疗方法及 癌治疗剂、癌治疗剂的筛选方法等。
[0092] 本发明中，所谓"癌的责任突变"，是与驱动突变可以互换使用的词语，是指存在于 癌组织的、对细胞具有癌化能力的突变。典型而言，在发现了某种突变的癌组织中，已知的 癌基因突变均不存在时（即，该突变与上述已知的癌基因突变互斥地存在时），该突变能够 称为癌的责任突变。
[0093] <具体的癌的责任突变>
[0094] 以下，对各基因融合进行说明。其中，本说明书中，融合多核苷酸中的"融合点"是 指5'侧的基因部分与3'侧的基因部分连接的边界，这是2个核苷酸残基之间的边界。另外， 融合多肽中的"融合点"是指N末端侧的多肽与C末端侧的多肽连接的边界，这是2个氨基酸 残基之间的边界，或者基因融合在1个密码子内产生时，为由该密码子编码的1个氨基酸残 基自身。
[0095] (1)ATG3-EPHB1 基因融合
[0096]本基因融合为产生ATG3蛋白质和EPHB1蛋白质的融合蛋白质（以下，也称为ATG3-EPHB1融合多肽）的表达的突变，是在人类染色体中由在3ql3.2和3q21_q23的区域内具有切 断点的倒位(inv3)产生的突变。
[0097] ATG3蛋白质为在人类中存在于3ql3.2的基因所编码的蛋白质，典型而言，为由序 列号30所示的氨基酸序列(NCBI登录号NP_071933.2(29-Sep-2013)构成的蛋白质。ATG3蛋 白质为自吞中所需的E2样的结合酶（Human Apg3p/Autlp homologue is an authentic E2enzyme for multiple substrates，GATE_16，GABARAP，and MAP-LC3，and facilitates the conjugation of hApgl2p to hApg5p.Tanida I，Tanida-Miyake E，Komatsu M，Ueno T，Kominami E.J Biol Chem.2002 Apr 19;277(16):13739-44.)〇
[0098] EPHB1蛋白质为在人类中存在于3q21_q23的基因所编码的蛋白质，典型而言，为由 序列号32所示的氨基酸序列(NCBI登录号NP_004432.1(25-Aug-2013)构成的蛋白质。EPHB1 蛋白质为属于受体酪氨酸激酶家族的跨膜型Ephrin受体蛋白质（EphBlrecruits c-Src and p52Shc to activate MAPK/ERK and promote chemotaxis.Vindis C,Cerretti DP, Daniel TO,Huynh-Do U.J Cell Biol.2003Aug 18;162(4):661-71.)<^卩冊1 蛋白质的特征 在于具有激酶结构域（图1)，该结构域例如在人类中相当于序列号32所示的氨基酸序列的 619~878位的氨基酸序列。
[0099]另外，在EPHB1蛋白质中，在激酶结构域的C末端侧存在SAM结构域(例如序列号32 所示的氨基酸序列的908~975位）。
[0100] ATG3-EPHB1融合多肽为包括EPHB1蛋白质的激酶结构域、且具有激酶活性的多肽。 [0101] ATG3-EPHB1融合多肽中，可以包括EPHB1蛋白质的激酶结构域的全部，只要ATG3-EPHB1融合多肽具有激酶活性，也可以包括激酶结构域的一部分。
[0102] ATG3-EPHB1融合多肽"具有激酶活性的"是指具有作为由来自EPHB1蛋白质的激酶 结构域引起的将酪氨酸磷酸化的酶的活性。ATG3-EPHB1融合多肽的激酶活性能够通过常规 方法测定，通常，在适合的条件下与底物(合成肽底物等)和ATP-起进行孵育之后，检测底 物的磷酸化酪氨酸。另外，也能够使用市售的测定试剂盒进行测定。
[0103] 另外，对ATG3-EPHB1融合多肽中所含的ATG3蛋白质由来的序列没有特别限制。 [0104] 在本发明中，编码ATG3-EPHB1融合多肽的多核苷酸（以下，也称为ATG3-EPHB1融合 多核苷酸）为编码包括Ε Ρ Η B1蛋白质的激酶结构域且具有激酶活性的多肽的多核苷酸。 ATG3-EPHB1融合多核苷酸可以为mRNA、cDNA和基因组DNA的任一种。
[0105] 本发明中的ATG3-EPHB1融合多核苷酸例如可以为编码下述的多肽的ATG3-EPHB1 融合多核苷酸：
[0106] (i)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽，
[0107] (ii)由在序列号2所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺失、取代或者添加1个或多 个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽，或
[0108] (iii)由与序列号2所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列 构成、且具有激酶活性的多肽。
[0109] 序列号2所示的氨基酸序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中 发现的ATG3-EPHB1融合多核苷酸所编码的氨基酸序列。
[0110]在上述（ii)中，"1个或多个氨基酸"通常是指1~50个、优选为1~30个、更优选为1 ~10个、更进一步优选为1~数个(例如1~5个、1~4个、1~3个、1个或2个、或1个）的氨基 酸。
[0111] 上述（iii)中，"80%以上的序列同一性"是指优选为85%以上、更优选为90%以 上、95%以上、更进一步优选为97%以上、98%以上、99%以上的序列同一性。氨基酸序列的 同一性能够利用基于Karlin和Arthur的算法BLAST(Proc .Natl .Acad. Sci .USA 87 : 2264-2268，1990、Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)的称为BLASTX或BLASTP的程序 (Altschul SF，et al:J Mol Biol 215:403,1990)来确定。使用BLASTX进行氨基酸序列的 解析时，参数例如设为score = 50、wordlength = 3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用 各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法为本领域技术人员所熟悉的（例如http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
[0112] 另外，本发明中的ATG3-EPHB1融合多核苷酸例如可以为下述的任一种多核苷酸：
[0113] (i)由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸，
[0114] (ii)与由与序列号1所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多 核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸，
[0115] (iii)由在序列号1所示的碱基序列所构成的多核苷酸中缺失、取代或者添加 1个 或多个核苷酸的碱基序列构成、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸，或
[0116] (iv)与由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80%以上的序列同一性、 且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸。
[0117] 序列号1所示的碱基序列如后述的实施例所示，为在来自人类癌组织的样品中发 现的ATG3-EPHB1融合多核苷酸的碱基序列。
[0118] 在上述(ii)中，所谓"严格条件下"，除了特别记载的情况之外，是指中程度或高程 度的严格条件。
[0119] 中程度的严格条件，例如，只要是本领域技术人员，就能够基于作为对象的多核苷 酸的长度容易地设计。基本的条件如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第3版、第6~7章 、Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 所不。典型而言， 中程度的严格条件包括对硝基纤维素过滤膜，5 X SSC、0.5%SDS、1. OmM EDTA(pH8.0)的前 清洗条件;约40~50 °C下的、约50 %甲酰胺、2~6 X SSC(或者，约42 °C下的、约50 %甲酰胺中 的Stark's solution等其它同样的杂交溶液）的杂交条件;和约40°C~60°C、0.5~6XSSC、 0.1 %SDS的清洗条件。中程度的严格条件优选包括约50°C、6 X SSC的杂交条件，也可以包括 上述的清洗条件和/或清洗条件。
[0120] 高程度的严格条件(高严格条件），例如，只要是本领域技术人员，就能够基于作为 对象的多核苷酸的长度容易地设计。高严格条件包括比中程度的严格条件高的温度和/或 低的盐浓度。典型而言，包括约65 °C、0.2~6 X SSC、优选为6 X SSC、更优选为2 X SSC、进一步 优选为〇. 2 X SSC的杂交条件。任一种情况下，优选包括约65~68°C、0.2 X SSC、0.1 % SDS的 清洗条件。
[0121] 任一种情况下，作为用于杂交、前清洗和清洗的缓冲液，均能够代替SSC(1XSSC为 0.15M NaCl和 15mM柠檬酸钠。）而使用SSPE(1XSSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2P〇4和 1.25mM EDTA、pH7.4。）。任一种情况下，清洗均能够在杂交结束后进行约15分钟。
[0122] 上述（iii)中，"1个或多个核苷酸"通常是指1~50个、优选为1~30个、更优选为1 ~10个、更进一步优选为1~数个(例如1~5个、1~4个、1~3个、1个或2个、或1个）的核苷 酸。
[0123] 上述（iv)中，"80%以上的序列同一性"是指优选为85%以上、更优选为90%以上、 95%以上、更进一步优选为97%以上、98%以上、99%以上的序列同一性。碱基序列的同一 性能够利用基于所述算法BLAST的称为BLASTN的程序(Altschul SF，et al:J Mol Biol 215 :403,1990)来确定。使用BLASTN进行碱基序列的解析时，参数例如设为SC〇re = 100、 wordlength = 12。
[0124] (2)TNIK-RNF123 基因融合
[0125] 本基因融合为产生TNIK蛋白质和RNF123蛋白质的融合蛋白质（以下，也称为TNIK-RNF123融合多肽）的表达的突变，是在人类染色体中由在3q26.31和3p24.3的区域内具有切 断点的倒位(inv3)产生的突变。
[0126] TNIK蛋白质为在人类中存在于3q26.31的基因所编码的蛋白质，典型而言，为由序 列号34、36、38、40、42、44、46或48所示的氨基酸序列（％81登录号即_055843.1(174口『-2013)、ΝΡ_001155032·1(17-Apr-2013)、ΝΡ_001155033·1(17-Apr-2013)、ΝΡ_001155034·1 (17-Apr-2013)、NP_001155035·1(17-Apr-2013)、NP_001155036·1(17-Apr-2013)、NP_ 001155037.l(17-Apr-2013)、或NP_001155038. l(17-Apr-2013))构成的蛋白质。已知TNIK 蛋白质在N末端具有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，在C末端具有CNH(GCK)结构域（图2)，参与 细胞骨架的控制（TNIK，a novel member of the germinal center kinase family that activates the c_Jun N-terminal kinase pathway and regulates the cytoskeleton.Fu CA，Shen M, Huang BC,Lasaga J,Payan DG, Luo Y.J Biol Chem.l9990ct 22;274(43):30729-37.)、Wnt信号转导的激活（The kinase TNIK is an essential activator of ffnt target genes.Mahmoudi T，Li VS，Ng SS,Taouatas N， Vries RG，Mohammed S，Heck AJ，Clevers H.EMBO J.2009Nov 4;28(21):3329-40.)等。激 酶结构域例如在人类中相当于序列号34所示的氨基酸序列的25~289位的氨基酸序列XNH 结构域例如在人类中相当于序列号34所示的氨基酸序列的1042~1340位的氨基酸序列。
[0127] RNF123蛋白质为在人类中存在于3p24.3的基因所编码的蛋白质，典型而言，为由 序列号50所示的氨基酸序列（NCBI登录号NP_071347.2(26-Aug-2013))构成的蛋白质。 RNF123蛋白质为E3泛素连接酶，将细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂lB(CDKNlB = p27，Kipl) 进行泛素化（Cytoplasmic ubiquitin ligase KPC regulates proteolysis of p27 (Kipl)at G1phase.Kamura T,Hara T，Matsumoto M,Ishida N，0kumura F，Hatakeyama S, Yoshida M,Nakayama K,Nakayama KI.Nat Cell Biol.2004Dec；6(12):1229-35.)〇RNF123 蛋白质的特征在于具有SPRY结构域和环指结构域（图2KSPRY结构域在人类中相当于序列 号50所示的氨基酸序列的132~251位的氨基酸序列。环指结构域在人类中相当于序列号50 所示的氨基酸序列的1254~1295位的氨基酸序列。
[0128] TNIK-RNF123融合多肽为包括TNIK蛋白质的激酶结构域、RNF123的SPRY结构域和 环指结构域、且具有激酶活性的多肽。
[0129] TNIK-RNF123融合多肽中，可以包括TNIK蛋白质的激酶结构域的全部，只要TNIK-RNF123融合多肽具有激酶活性，也可以包括激酶结构域的一部分。
[0130] TNIK-RNF123融合多肽"具有激酶活性"是指具有作为由来自TNIK蛋白质的激酶结 构域引起的将丝氨酸或苏氨酸磷酸化的酶的活性。TNIK-RNF123融合多肽的激酶活性能够 通过常规方法测定，通常，在适合的条件下与底物(合成肽底物等)和ATP-起进行孵育后， 检测底物的磷酸化丝氨酸或苏氨酸。另外，也能够使用市售的测定试剂盒进行测定。
[0131] TNIK-RNF123融合多肽中，可以包括RNF123蛋白质的SPRY结构域和环指结构域的 全部，只要能够保持RNF123蛋白质中的其本来的功能，也可以包括SPRY结构域和环指结构 域的一部分。SPRY结构域和环指结构域的一部分保持RNF123蛋白质中的其本来的功能，是 指作为SPRY结构域和环指结构域所具有该一部分的RNF123蛋白质具有E3活性。E3活性利用 Kamura，T.et al.，Nature Cell Biology,2004,6(12) ,1229-35中所记载的方法等进行测 定即可。
[0132] 本发明中，编码TNIK-RNF123融合多肽的多核苷酸（以下，也称为TNIK-RNF123融合 多核苷酸)为编码包括TNIK蛋白质的激酶结构域\RNF123的SPRY结构域和环指结构域、且具 有激酶活性的多肽的多核苷酸。TNIK-RNF123融合多核苷酸可以为mRNA、cDNA和基因组DNA 的任一种。
[0133] 本发明中的TNIK-RNF123融合多核苷酸例如可以为编码下述的多肽的TNIK-RNF123融合多核苷酸：
[0134] (i)由序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列构成的多肽，
[0135] (ii)由在序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺 失、取代或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽，或
[0136] (iii)由与序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列具有80%以上的序 列同一性的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽。
[0137] 序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列如后述的实施例所示，为包括 在来自人类癌组织的样品中发现的部分序列的TNIK-RNF123融合多核苷酸所编码的氨基酸 序列。
[0138] 上述（ii)中的"1个或多个氨基酸"和上述（iii)中的"80%以上的序列同一性"的 意思如上述"(1)ATG3-EPHB1基因融合"所述。
[0139] 另外，本发明中的TNIK-RNF123融合多核苷酸例如可以为下述的任一种多核苷酸：
[0140] (i)由序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列构成的多核苷酸，
[0141] (ii)与由与序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列所构成的多核苷酸互 补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷 酸，
[0142] (iii)由在序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列所构成的多核苷酸中缺 失、取代或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列构成、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷 酸，或
[0143] (iv)与由序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列构成的多核苷酸具有 80%以上的序列同一性、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸。
[0144] 序列号3所示的碱基序列如后述的实施例所示，为包括在来自人类癌组织的样品 中发现的部分序列的TNIK-RNF123融合多核苷酸的碱基序列。
[0145] 上述(ii)中的"严格条件下"、上述(iii)中的"1个或多个核苷酸"和上述(iv)中的 "80 %以上的序列同一性"的意思如上述"(1)ATG3-EPHB1基因融合"所述。
[0146] (3)SLC12A2-NRG2 基因融合
[0147] 本基因融合为产生SLC12A2蛋白质和NRG2蛋白质的融合蛋白质（以下，也称为 SLC12A2-NRG2融合多肽）的表达的突变，是在人类染色体中由在5q23.3和5q23_q33的区域 内具有切断点的倒位(inv5)产生的突变。
[0148] SLC12A2蛋白质为在人类中存在于5q23.3的基因所编码的蛋白质，典型而言，为由 序列号52或54所示的氨基酸序列（NCBI登录号NP_001037. 1 (22-Sep-2013)或NP_ 001243390.1(28-Sep-2013))构成的蛋白质。SLC12A2蛋白质为作为Na-K-Cl协同转运蛋白 起作用的膜蛋白质（Loop diuretic and ion-binding residues revealed by scanning mutagenesis of transmembrane helix 3(TM3)of Na-K-Cl cotransporter(NKCC1) .Somasekharan S,Tanis J,Forbush B.J Biol Chem.2012May 18；287(21):17308-17.), 在N末端具有AA_permease_N super family结构域（图1)。该结构域例如在人类中相当于序 列号52所示的氨基酸序列的210~267位的氨基酸序列。
[0149] NRG2蛋白质为在人类中存在于5q23_q33的基因所编码的蛋白质，典型而言，为由 序列号56、58、60、62、或64所示的氨基酸序列(从^1登录号即_004874.1(25-4呢-2013)、即_ 053584·1(25-Aug-2013)、ΝΡ_053585·1(25-Aug-2013)、ΝΡ_053586·1(25-Aug-2013)、或NP_ 001171864.1(25-Aug-2013))构成的蛋白质。NRG2蛋白质为属于通过与ERBB家族受体的相 互作用来控制细胞增殖和分化的神经调节蛋白家族的蛋白质（Ligands for ErbB-family receptors encoded by a neuregulin-like gene.Chang H,Riese DJ 2nd,Gilbert ff, Stern DF,McMahan UJ.Nature .1997May 29；387(6632):509-12；Neuregulin-2,a new ligand of ErbB3/ErbB4-receptor tyrosine kinases .Carraway KL 3rd,Weber JL, Unger MJ,Ledesma J,Yu N,Gassmann M,Lai C.Nature.1997 May 29；387(6632):512-6； Neuregulin isoforms exhibit distinct patterns of ErbB family receptor activation.Hobbs SS,Coffing SL,Le AT,Cameron EM,Williams EE,Andrew M,R1ommel EN,Hammer RP,Chang H,Riese DJ 2nd.Oncogene .2002Dec 5；21(55):8442-52；The N-terminal region of NTAK/neuregulin-2isoforms has an inhibitory activity on angiogenesis.Nakano N,Higashiyama S,0hmoto H,Ishiguro H,Taniguchi N,ffada Y.J Biol Chem. 2004Mar 19; 279( 12): 11465-70.) ARG2蛋白质的特征在于具有神经调节蛋白 家族保守区域（图1)。该结构域例如在人类中相当于序列号56所示的氨基酸序列的398~ 718位的氨基酸序列。
[0150] 另外，NRG2蛋白质中，在神经调节蛋白家族保守区域的N末端侧存在I-set结构域 (例如序列号56所示的氨基酸序列的239~328位）。另外，在I-set结构域和神经调节蛋白家 族保守区域之间也存在具有EGF结构域(例如序列号56所示的氨基酸序列的353~381位)的 同源异构体。
[0151] SLC12A2-NRG2融合多肽为包括SLC12A2蛋白质的AA_permease_N super family结 构域和NRG2蛋白质的神经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的多 肽。
[0152] SLC12A2-NRG2融合多肽中，可以包括SLC12A2蛋白质的AA_permease_N super family结构域的全部，只要SLC12A2-NRG2融合多肽具有增强细胞内信号转导的活性，也可 以包括AA_permease_N super family结构域的一部分。
[0153] SLC12A2-NRG2融合多肽中，可以包括NRG2蛋白质的神经调节蛋白家族保守区域的 全部，只要SLC12A2-NRG2融合多肽具有增强细胞内信号转导的活性，也可以包括神经调节 蛋白家族保守区域的一部分。
[0154] SLC12A2-NRG2融合多肽"具有增强细胞内信号转导的活性"是指具有由来自NRG2 蛋白质来自的神经调节蛋白家族保守区域引起的增强细胞内信号转导的活性。该活性能够 通过町13〇11，1'.1?.6七31.，〇311〇61'〇611，2011，20，158-172中所记载的以下方法进行测定。
[0155] 在以除去血清的状态培养的EFM-19细胞(DSMZ，N〇.ACC-231)中添加受试物质，进 行30分钟处理之后，将EFM-19细胞裂解，提取蛋白质。通过蛋白质免疫印迹分析，研究EGFR、 ERBB2、ERBB3或ERBB4的磷酸化状态，当与不添加受试物质的情况相比磷酸化上升时，确定 为受试物质具有增强细胞内信号转导的活性。其中，作为受试物质，可以使用SLC12A2-NRG2 融合多肽整体，但考虑裂解性等，也可以使用缺失跨膜结构域、且包括神经调节蛋白家族保 守区域的片段。
[0156] SLC12A2-NRG2融合多肽只要具有增强细胞内信号转导的活性，可以包括NRG2蛋白 质的I-set结构域的全部或一部分。
[0157] SLC12A2-NRG2融合多肽只要具有增强细胞内信号转导的活性，可以包括NRG2蛋白 质的EGF结构域的全部或一部分。
[0158] 本发明中，编码SLC12A2-NRG2融合多肽的多核苷酸（以下，也称为SLC12A2-NRG2融 合多核苷酸）为编码包括SLC12A2蛋白质的AA_permease_N super family结构域和NRG2蛋 白质的神经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷 酸。SLC12A2-NRG2融合多核苷酸可以为mRNA、cDNA和基因组DNA的任一种。
[0159] 本发明中的SLC12A2-NRG2融合多核苷酸例如可以为编码下述的多肽的SLC12A2-NRG2融合多核苷酸：
[0160] (i)由序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列构成的多肽，
[0161] (^)由在序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺失、取代 或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽， 或
[0162] (iii)由与序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一 性的氨基酸序列构成、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽。
[0163] 序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列如后述的实施例所示，为包括在来自 人类癌组织的样品中发现的部分序列的SLC12A2-NRG2融合多核苷酸所编码的氨基酸序列。
[0164] 上述（ii)中的"1个或多个氨基酸"和上述（iii)中的"80%以上的序列同一性"的 意思如上述"(1)ATG3-EPHB1基因融合"所述。
[0165] 另外，本发明中的SLC12A2-NRG2融合多核苷酸例如可以为下述的任一种多核苷 酸：
[0166] (i)由序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列构成的多核苷酸，
[0167] (ii)与由与序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的 碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多 肽的多核苷酸，
[0168] (iii)由在序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列所构成的多核苷酸中缺失、 取代或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列构成、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸， 或
[0169] (iv)与由序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80%以 上的序列同一性、且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸。
[0170] 序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列如后述的实施例所示，为包括在来自人 类癌组织的样品中发现的部分序列的SLC12A2-NRG2融合多核苷酸的碱基序列。
[0171] 上述(ii)中的"严格条件下"、上述(iii)中的"1个或多个核苷酸"和上述(iv)中的 "80 %以上的序列同一性"的意思如上述"(1)ATG3-EPHB1基因融合"所述。
[0172] <作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测方法>
[0173] 本发明提供一种上述3种基因融合的检测方法（以下，也称为本发明的检测方法）。 本发明的检测方法包括检测来自受试者的分离得到的试样中的上述任一种融合多核苷酸 或由其编码的多肽的工序。
[0174] 本发明的检测方法中，受试者只要是哺乳动物即可，没有特别限定。作为哺乳动 物，例如，可以列举小鼠、大鼠、仓鼠、花鼠、豚鼠等啮齿类、兔、猪、牛、山羊、马、绵羊、水貂、 狗、猫、人类、猴子、食蟹猴、罗猴、绒猴、猩猩、黑猩猩等灵长类等，优选人类。
[0175] 受试者不仅可以是患有癌的受试者，也可以是怀疑患有癌的受试者、或存在将来 患癌的风险的受试者。作为适用本发明的检测方法的对象的"癌"，只要是可以检测到上述3 种基因融合中的任一种的癌即可，没有特别限定，优选为胃癌，进一步优选为特殊型胃癌、 未分化型胃癌、或中分化型胃癌。
[0176] 来自受试者的"分离得到的试样"不仅包括生物体试样(例如，细胞、组织、脏器(例 如小肠、脾脏、肾脏、肝脏、胃、肺、肾上腺、心脏、脑、胰腺、大动脉等）、体液(例如血液、淋巴 液、骨髄液等）、消化液、痰、肺胞-支气管清洗液、尿、便），也包括由这些生物体试样得到的 核酸提取物(基因组DNA提取物、mRNA提取物、由mRNA提取物制备的cDNA制备物或cRNA制备 物等）、蛋白质提取物。基因组DNA、mRNA、cDNA或蛋白质对于本领域技术人员来说，能够考虑 上述试样的种类和状态等，选择对其适用的公知方法来制备。另外，也可以对上述试样实施 福尔马林固定处理、醇固定处理、冻干处理或石蜡包埋处理。
[0177] 另外，"分离得到的试样"优选为来自存在或怀疑存在上述癌的脏器，更优选为来 自存在或怀疑存在上述癌的胃。作为这样的"分离得到的试样"，例如，可以列举胃癌(优选 特殊型胃癌、未分化型胃癌、或中分化型胃癌）患者或怀疑患有胃癌的受试者的胃组织、从 该胃组织提取得到的总RNA等。
[0178] 本发明的检测方法中，融合多核苷酸或由其编码的多肽的检测能够使用自身公知 的方法来进行。
[0179] 将来自基因组DNA的转录产物(mRNA或由mRNA制备的cDNA)作为对象时，例如，能够 利用RT-PCR法、测序、TaqMan探针法、RNA印迹(Northern Blotting)、点杂交法、cDNA微阵列 解析等检测作为mRNA或cDNA的融合多核苷酸。
[0180] 另外，将基因组DNA作为对象时，例如，可以利用原位杂交（ISH)、基因组PCR法、测 序、TaqMan探针法、DNA印迹（Southern Blotting)、基因组微阵列解析等检测作为基因组 DNA的融合多核苷酸。
[0181] 这些方法能够分别单独利用，也能够组合利用。例如，上述3种基因融合可以认为 通过表达融合多肽参与癌化，因此，在检测作为基因组DNA的融合多核苷酸时（例如通过原 位杂交等），也优选进一步确认转录产物或蛋白质的生成（例如利用RT-PCR、免疫染色法 等)。
[0182] 在利用杂交技术(例如TaqMan探针法、RNA印迹、DNA印迹、点杂交法、微阵列分析、 原位杂交(ISH)等)检测融合多核苷酸时，能够使用作为设计为特异性识别上述融合多核苷 酸的探针的多核苷酸。这里，"特异性识别融合多核苷酸"是指:在严格条件下，从包括来自 从该融合多核苷酸的融合点至5'末端侧和3'末端侧的部分的野生型基因的、该融合多核苷 酸以外的多核苷酸识别并辨认出该融合多核苷酸。
[0183] 本发明的检测方法中，在治疗或诊断的过程中得到的生物体试样(生物体检测样 品等)大多进行福尔马林固定，因此，作为检测对象的基因组DNA在福尔马林固定下也是稳 定的，从检测灵敏度高的观点考虑，优选使用原位杂交。
[0184] 在原位杂交中，对上述生物体试样能够通过使作为设计为特异性识别融合多核苷 酸的探针的多核苷酸具有至少15个碱基的链长的下述(a)或(b)中所述的多核苷酸杂交，来 检测编码融合多肽的基因组DNA(融合多核苷酸）。
[0185] (a)对于各融合基因，作为选自与5'侧融合伙伴基因(ATG3、TNIK、或SLC12A2基因） 的碱基序列杂交的探针和与3'侧融合伙伴基因(EPHB1、RNF123、或NRG2基因）的碱基序列杂 交的探针中的至少一个探针的多核苷酸，
[0186] (b)对于各融合基因，作为与包括5'侧融合伙伴基因和3'侧融合伙伴基因的融合 点的碱基序列杂交的探针的多核苷酸。
[0187] 本发明中的ATG3基因只要是来自人类的基因即可，典型而言，为由Genbank登录号 NC_000003.11所规定的基因组的序列中从第112251354号到第112280810号的DNA序列（互 补链所编码的)构成的基因。
[0188] 本发明中的TNIK基因只要是来自人类的基因即可，典型而言，为由Genbank登录号 NC_000003.11所规定的基因组的序列中从第170780292号到第171178197号的DNA序列（互 补链所编码的)构成的基因。
[0189] 本发明中的SLC12A2基因只要是来自人类的基因即可，典型而言，为由Genbank登 录号NC_000005.9所规定的基因组的序列中从第127419483号到第127525380号的DNA序列 构成的基因。
[0190]本发明中的EPHB1基因只要是来自人类的基因即可，典型而言，为由Genbank登录 号NC_000003.11所规定的基因组的序列中从第134514099号到第134979309号的DNA序列构 成的基因。
[0191] 本发明中的RNF123基因只要是来自人类的基因即可，典型而言，为由Genbank登录 号NC_000003.11所规定的基因组的序列中从第49726950号到第49758962号的DNA序列构成 的基因。
[0192] 另外，本发明中的NRG2基因只要是来自人类的基因即可，典型而言，为由Genbank 登录号NC_000005.9所规定的基因组的序列中从第139226364号到第139422884号的DNA序 列(互补链所编码的）构成的基因。
[0193] 但是，基因的DNA序列由于其突变等在自然界（即非人工地)发生变化。因此，这种 天然的突变体也可以作为本发明的对象（以下同样）。
[0194] 本发明的(a)所述的多核苷酸，只要通过与作为该多核苷酸的靶标碱基序列的、5' 侧融合伙伴基因(ATG3、TNIK、或SLC12A2基因）的碱基序列和/或3'侧融合伙伴基因（EPHB1、 RNF123、或NRG2基因）的碱基序列杂交而能够检测编码上述生物体试样中的融合多肽的基 因组DNA的存在即可，优选为下述(al)~(a3)所述的多核苷酸：
[0195] (al)与比5'侧融合伙伴基因的切断点更靠5'侧的上游区域的碱基序列杂交的多 核苷酸（以下，也称为"5'融合伙伴基因探针Γ)和与比3'侧融合伙伴基因的切断点更靠3' 侧的下游区域的碱基序列杂交的多核苷酸（以下，也称为"3'融合伙伴基因探针Γ)的组合；
[0196] (a2)与比5'侧融合伙伴基因的切断点更靠5'侧的上游区域的碱基序列杂交的多 核苷酸（以下，也称为"5'融合伙伴基因探针Γ)和与比5'侧融合伙伴基因的切断点更靠3' 侧的下游区域的碱基序列杂交的多核苷酸（以下，也称为"5'融合伙伴基因探针2"）的组合；
[0197] (a3)与比3'侧融合伙伴基因的切断点更靠5'侧的上游区域的碱基序列杂交的多 核苷酸（以下，也称为"3'融合伙伴基因探针2"）和与比3'侧融合伙伴基因的切断点更靠3' 侧的下游区域的碱基序列杂交的多核苷酸（以下，也称为"3'融合伙伴基因探针Γ)的组合。
[0198] 在上述(a 1)~(a3)中，5M则融合伙伴基因为ATG3基因时，在比该基因的切断点更 靠5'侧的上游区域的碱基序列中，典型而言，包含ATG3基因的外显子2(在序列号29所示的 碱基序列中为508-549位)及其上游区域。
[0199] 在上述(a 1)~(a3)中，3'侧融合伙伴基因为EPHB1基因时，在比该基因的切断点更 靠3'侧的下游区域的碱基序列中，典型而言，包含EPHB1基因的外显子7(在序列号31所示的 碱基序列中为1798-1960位)及其下游区域。
[0200] 在上述(al)~(a3)中，5M则融合伙伴基因为TNIK基因时，在比该基因的切断点更 靠5'侧的上游区域的碱基序列中，典型而言，包含TNIK基因的外显子32(在序列号33所示的 碱基序列中为4205-4344位)及其上游区域。
[0201] 在上述(al)~(a3)中，3M则融合伙伴基因为RNF123基因时，在比该基因的切断点 更靠3'侧的下游区域的碱基序列中，典型而言，包含RNF123基因的外显子6(在序列号49所 示的碱基序列中为469-523位)及其下游区域。
[0202] 在上述(al)~(a3)中，5M则融合伙伴基因为SLC12A2基因时，在比该基因的切断点 更靠5'侧的上游区域的碱基序列中，典型而言，包含SLC12A2基因的外显子4(在序列号51所 示的碱基序列中为1117-1212位)及其上游区域。
[0203]在上述(al)~(a3)中，3'侧融合伙伴基因为NRG2基因时，在比该基因的切断点更 靠3'侧的下游区域的碱基序列中，典型而言，包含NRG2基因的外显子2(在序列号55所示的 碱基序列中为931-1102位)及其下游区域。
[0204]作为上述(al)所述的多核苷酸，例如，可以列举以下的（al-Ι)~(al-3)的多核苷 酸的组合：
[0205] (al-Ι)与ATG3基因的外显子2杂交的多核苷酸和与EPHB1基因的外显子7杂交的多 核苷酸的组合，
[0206] (al-2)与TNIK基因的外显子32杂交的多核苷酸和与RNF123基因的外显子6杂交的 多核苷酸的组合，和
[0207] (al-3)与SLC12A2基因的外显子4杂交的多核苷酸和与NRG2基因的外显子2杂交的 多核苷酸的组合。
[0208] 在本发明中，作为用于原位杂交的上述(a)所述的多核苷酸所杂交的区域(靶标碱 基序列），从对于靶标碱基序列的特异性和检测的灵敏度的观点考虑，优选为从5'侧融合伙 伴基因（ATG3、TNIK、或SLC12A2基因）和3'侧融合伙伴基因（EPHB1、RNF123、或NRG2基因）的 融合点至1000000个碱基以内的区域。
[0209] 另外，在本发明中，用于原位杂交的上述(b)所述的多核苷酸，只要能够通过与作 为该多核苷酸的靶标碱基序列的、包括5'侧融合伙伴基因和3'侧融合伙伴基因的融合点的 碱基序列杂交而检测编码上述生物体试样中的融合多肽的基因组DNA的存在即可，作为典 型例，为与包括序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、或27所示的碱基序列中的融 合点的碱基序列杂交的多核苷酸。
[0210] 另外，在本发明中，用于原位杂交的上述(a)或(b)中记载的多核苷酸，从对于靶标 碱基序列的特异性和检测的灵敏度的观点考虑，优选为能够覆盖上述靶标碱基序列整体 的，包括多种多核苷酸的集合。此时，构成该集合的多核苷酸的长度至少为15个碱基，优选 为100~1000个碱基。
[0211] 为了检测，优选利用荧光色素等标记用于原位杂交的上述(a)或(b)所述的多核苷 酸。作为这样的荧光色素，例如，可以列举DEAC、FITC、R6G、TexRed、Cy5，但并不限于这些。另 外，除荧光色素以外，也可以利用放射性同位元素(例如: 1251、1311、311、14(：、3￥、 3￥等）、酶(例 如:β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等）、发光物质 (例如:鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、光泽精、3,3^二氨基联苯胺(DAB)等)来标记上述多 核苷酸。
[0212] 在原位杂交中，使用5'侧融合伙伴基因探针1和3'侧融合伙伴基因探针1时、使用 5'侧融合伙伴基因探针1和5'侧融合伙伴基因2时、或使用3'融合伙伴基因探针2和3'融合 伙伴基因探针1时，优选用相互不同的色素标记这些探针。这样，使用这样以不同的色素标 记的探针的组合进行原位杂交时，在观察到5'侧融合伙伴基因探针1的标记发出的信号(例 如荧光)和3'侧融合伙伴基因探针1的标记发出的信号的重合时，能够判定为能够检测编码 融合多肽的基因组DNA。另一方面，在观察到5'侧融合伙伴基因探针1的标记发出的信号和 5'侧融合伙伴基因探针2的标记发出的信号的分离、3'侧融合伙伴基因探针2的标记发出的 信号和3'侧融合伙伴基因探针1的标记发出的信号的分离时，能够判定为能够检测编码融 合多肽的基因组DNA。
[0213] 此外，多核苷酸的标记能够利用公知的方法进行。例如，能够利用切口平移法、随 机引物法，使由荧光色素等标记的底物碱基插入多核苷酸中，从而标记该多核苷酸。
[0214] 在原位杂交中，使上述(a)或(b)所述的多核苷酸与上述生物体试样杂交时的条件 可以根据该多核苷酸的长度等各种要因而变动，作为高严格杂交的条件，例如，可以列举 0.2父33(：、65°(：的条件，作为低严格杂交的条件，例如，可以列举2.0\33(：、50°(：的条件。此 外，只要是本领域技术人员，除盐浓度(SSC的稀释率等)和温度之外，例如，还能够通过适当 选择表面活性剂(NP-40等）的浓度、甲酰胺的浓度、pH等各种条件，实现与上述条件同样的 严格杂交的条件。
[0215] 作为使用上述(a)或(b)所述的多核苷酸检测编码融合多肽的基因组DNA的方法， 除上述原位杂交以外，还可以列举DNA印迹、RNA印迹和点杂交。在这些方法中，通过使上述 (a)或(b)所述的多核苷酸与转印有由上述生物体试样得到的核酸提取物的膜杂交，检测上 述融合基因。使用上述(a)的多核苷酸时，与5'侧融合伙伴基因的碱基序列杂交的多核苷酸 和与3'侧融合伙伴基因的碱基序列杂交的多核苷酸识别在膜上展开的相一条带时，能够判 定为能够检测编码融合多肽的基因组DNA。
[0216] 作为使用上述(b)的多核苷酸检测编码融合多肽的基因组DNA的方法，可以进一步 列举基因组微阵列解析或DNA微阵列解析。在这些方法中，制作将上述(b)的多核苷酸固定 于基板的阵列，使上述生物体试样与该阵列上的多核苷酸接触，由此检测该基因组DNA。作 为基板，只要是能够使寡核苷酸或者多核苷酸固相化即可，没有特别限定，例如，能够列举 玻璃板、尼龙膜、微珠、硅片、毛细管等。
[0217] 在本发明的检测方法中，也优选利用PCR检测融合多核苷酸。
[0218] 在PCR中，能够使用以由上述生物体试样制备的DNA(基因组DNA、cDNA)或RNA作为 模板、设计为能够特异性扩增融合多核苷酸的作为一对引物的多核苷酸。这里，"能够特异 性扩增融合多核苷酸"是指:不扩增来自从该融合多核苷酸的融合点至5'末端侧和3'末端 侧的部分的野生型基因，能够仅扩增该融合多核苷酸，可以扩增该融合多核苷酸的全部，也 可以扩增包括融合点的该融合多核苷酸的一部分。
[0219] PCR等中所利用的"作为一对引物的多核苷酸"包括特异性扩增作为靶标的融合多 核苷酸的正义引物(正向引物)和反义引物(反向引物），正义引物由从该融合多核苷酸的融 合点至5'末端侧的碱基序列设计，反义引物由从该融合多核苷酸的融合点至3'末端侧的碱 基序列设计。另外，从利用PCR法的检测的精度和灵敏度的观点考虑，这些引物通常设计为 PCR产物为5kb以下。引物的设计能够利用公知的方法适当进行，例如，能够利用Primer Express(注册商标)软件(Applied Biosystems)。这些多核苷酸的长度通常为15个碱基以 上(优选16、17、18、19或20个碱基以上，更优选21个碱基以上），为100个碱基以下（优选90、 80、70、60、50或40个碱基以下，更优选30个碱基以下）。
[0220] 作为"作为一对引物的多核苷酸"的优选例，可以列举对于ATG3-EPHB1融合多核苷 酸的、包括由序列号65所示的碱基序列构成的多核苷酸和由序列号66所示的碱基序列构成 的多核苷酸的引物组;对于TNIK-RNF123融合多核苷酸的、包括由序列号67所示的碱基序列 构成的多核苷酸和由序列号68所示的碱基序列构成的多核苷酸的引物组;和对于SLC12A2-NRG2融合多核苷酸的、包括由序列号69所示的碱基序列构成的多核苷酸和由序列号70所示 的碱基序列构成的多核苷酸的引物组(参照后述的表1)。
[0221] 利用PCR检测融合多核苷酸时，通过以PCR产物作为对象进行直接测序，确定包括 融合点的碱基序列，由此，能够确认5'侧的基因部分和3'侧的基因部分在框内连接和/或包 括融合多核苷酸中规定的结构域。测序能够利用公知的方法进行，能够根据操作说明书，使 用测序仪（例如，ABI-PRISM 310Genetic Analyzer(Applied Biosystems Inc.)等）简单地 实施。
[0222] 另外，利用PCR检测融合多核苷酸时，能够利用TaqMan探针法确认5'侧的基因部分 和3'侧的基因部分在框内连接和/或包括融合多核苷酸中规定的结构域。作为在TaqMan探 针法中使用的探针，例如，可以列举上述(a)或(b)所述的多核苷酸。探针可以用报告染料 (例如FAM、FITC、VIC等)和猝灭基团（例如
[0223] 上述引物和探针可以为DNA，也可以为RNA，或者也可以为DNA/RNA嵌合，优选为 DNA。另外，其一部分或全部中，也可以利用PNA(polyamide nucleic acid，肽核酸）、LNA(注 册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸）、ENA(注册商标，2'-0,4，-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸）、 TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸代替核苷酸。另外，上述引物和探针可 以为双链也可以为单链，优选为单链。
[0224] 另外，上述引物和探针只要能够与靶标序列特异杂交即可，也可以包括1个或多个 核苷酸的错配，相对于靶标序列的互补序列，通常具有80%以上、优选90、91、92、93、94%以 上、更优选95、96、97、98、99%以上的同一性，最优选具有100%的同一性。
[0225] 上述引物和探针例如能够基于本说明书中所记载的碱基序列的信息，使用DNA/ RNA自动合成机，按照常规方法进行合成。
[0226] 在本发明的检测方法中，可以通过全转录组测序(RNA测序）或者基因组测序检测 融合多核苷酸。这些方法，例如，能够使用新一代的测序仪（例如，基因组分析仪I lx (111 umina 公司）、HiSeq测序仪（HiSeq2000、111 umina 公司）基因组测序仪 FLX System (Roche公司）等)根据制造商的说明书来进行。RNA测序例如能够使用市售的试剂盒(例如， mRNA-Seq样品制备试剂盒（Illumina公司）等），根据制造商的说明书从总RNA制备cDNA文 库，将其供给使用新一代的测序仪的测序，由此来进行。
[0227] 在本发明的检测方法中，以融合多核苷酸的翻译产物（即融合多肽)作为对象时， 例如，能够利用免疫染色法、蛋白质免疫印迹法、RIA法、ELI SA法、流式细胞法、免疫沉淀法、 抗体阵列解析等检测该翻译产物。这些方法中，使用特异性识别融合多肽的抗体。这里"特 异性识别融合多肽"是指不识别包括来自从该融合多肽的融合点到N末端侧和C末端侧的部 分的野生型蛋白质的、该融合多肽以外的蛋白质，而仅识别该融合多肽。本发明的检测方法 中所使用的"特异性识别融合多肽"的抗体可以为1个抗体，也可以为2个以上的抗体的组 合。
[0228] 作为"特异性识别融合多肽的抗体"，可以列举包括融合多肽的融合点的多肽的特 异性抗体(以下，也称为"融合点特异性抗体"）。这里，"融合点特异性抗体"是指与包括上述 融合点的多肽特异性结合，但是不与来自N末端侧和C末端侧的部分的野生型蛋白质结合的 抗体。
[0229] 另外，作为"特异性识别融合多肽的抗体"，可以列举与包括从融合多肽的融合点 到N末端侧的区域的多肽结合的抗体和与包括从融合多肽的融合点到C末端侧的区域的多 肽结合的抗体的组合。通过使用这2种抗体进行三明治ELISA、免疫染色法、免疫沉淀法、蛋 白质免疫印迹法等，能够检测融合多肽。
[0230] 本发明中，抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)等天然型抗体、使用基因重组 技术制造的嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、和它们的结合性片段，但不限定于这些。结合 性片段是指具有特异的结合活性的上述抗体的一部分区域，具体而言，例如，可以列举Fab、 Fab'、F(ab'）2、Fv、和单链抗体等。抗体型（〇]^88)没有特别限定，可以为具有]^、]^、]^、 IgD或者IgE等的任一种同种型（isotype)的抗体，考虑精制的容易性等，更优选为IgG。
[0231] "特异性识别融合多肽的抗体"，对于本领域技术人员而言，能够选择适当公知的 方法来制备。作为这样的公知的方法，可以例举将包括上述融合多肽的融合点的多肽、包括 从上述融合多肽的融合点到N末端侧的区域的多肽、或者包括从上述融合多肽的融合点到C 末端侧的区域的多肽对免疫动物接种，使该动物的免疫系统激活后，回收该动物的血清(多 克隆抗体）的方法、杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法等单克隆抗体的制作方法。也可以 利用市售的抗体。另外，如果使用结合有标记物质的抗体，能够通过检测该标记而直接检测 靶标蛋白质。作为标记物质，能够与抗体结合且能够检测即可，没有特别限制，例如，可以列 举过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素 (FITC)、异硫氰酸罗丹明（RITC)、碱性磷酸酶、生物素和放射性物质等。另外，除了使用结合 有标记物质的抗体直接检测靶标蛋白质的方法以外，也能够利用使用结合有标记物质的二 次抗体、蛋白G或者蛋白A等间接检测靶标蛋白质的方法。
[0232] <作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测用试剂盒>
[0233] 如上所述，能够使用上述引物、探针、或抗体、或者这些的组合来检测由作为癌的 责任突变的基因融合所产生的融合多核苷酸或由其编码的多肽，由此能够检测该基因融 合。因此，本发明提供包括下述的任一种或它们的组合的、作为癌的责任突变的基因融合的 检测用试剂盒（以下，也称为本发明的试剂盒）：
[0234] (A)作为探针的多核苷酸，该探针设计为特异性识别ATG3-EPHB1融合多核苷酸、 TNIK-RNF123融合多核苷酸、或SLC12A2-NRG2融合多核苷酸；
[0235] (B)作为一对引物的多核苷酸，该一对引物设计为能够特异性扩增ATG3-EPHB1融 合多核苷酸、TNIK-RNF123融合多核苷酸、或SLC12A2-NRG2融合多核苷酸;和
[0236] (C)特异性识别ATG3-EPHB1融合多肽、TNIK-RNF123融合多肽、或SLC12A2-NRG2融 合多肽的抗体。
[0237] 在本发明的试剂盒中，除多核苷酸、抗体之外，还能够适当包括多核苷酸、抗体中 附加的标记的检测所必需的底物、阳性对照（例如ATG3-EPHB1融合多核苷酸、TNIK-RNF123 融合多核苷酸、或SLC12A2-NRG2融合多核苷酸、ATG3-EPHB1融合多肽、TNIK-RNF123融合多 肽、或SLC12A2-NRG2融合多肽、或保持这些的细胞等）、阴性对照、PCR用试剂、原位杂交等中 所使用的对比染色用试剂(DAPI等）、抗体的检测中所必需的分子(例如二次抗体、蛋白质G、 蛋白质A)、用于试样的稀释或清洗的缓冲液等。在本发明的试剂盒中，也能够包括使用说明 书。通过使用本发明的试剂盒，能够容易地实施上述本发明的检测方法。
[0238] 本发明的检测方法和检测用试剂盒能够检测作为癌的责任突变新发现的基因融 合，如后所述，在鉴定该基因融合的阳性例并应用个体化医疗方面是非常有用的。
[0239] <鉴定癌患者或存在患癌风险的受试者的方法>
[0240]上述3种基因融合为癌的责任突变，可以认为，分别通过EPHB1激酶活性的稳定激 活、TNIK激酶活性的稳定激活和NRG2的作为细胞增殖因子的功能的增强来参与癌的恶化 等。因此，在检测这种基因融合的癌患者中，利用抑制由该基因融合产生的融合多核苷酸所 编码的多妝的表达和/或活性的物质进彳丁治疗，有效的可能性尚。
[0241] 因此，本发明提供一种鉴定癌患者或存在患癌风险的受试者的方法（以下，也称为 本发明的鉴定方法），其中，上述癌患者或存在患癌风险的受试者是抑制由作为癌的责任突 变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带 来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的受试者。
[0242] 本发明的鉴定方法包括下述的工序：
[0243] (1)(1)检测来自受试者的分离得到的试样中的下述(a)~（c)中的任一种融合多 核苷酸或由其编码的多肽的工序：
[0244] (a)ATG3_EPHBl融合多核苷酸，其编码包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的 多肽；
[0245] (b)TNIK-RNF123融合多核苷酸，其编码包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结 构域和环指结构域、且具有激酶活性的多肽;和
[0246] (c)SLC12A2-NRG2融合多核苷酸，其编码包括SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的 多肽;和
[0247] (2)在检测到上述融合多核苷酸或由其编码的多肽的情况下，判定为抑制上述多 肽的表达和/或活性的物质在上述受试者中能带来治疗效果的工序。
[0248] 本发明的鉴定方法中，"癌患者或存在患癌风险的受试者"为患有癌的、或怀疑患 有癌的哺乳动物，优选为人类。作为应用本发明的鉴定方法的对象的"癌"，只要是能够检测 到上述3种基因融合中的任一种的癌即可，没有特别限定，优选为胃癌，进一步优选为特殊 型胃癌、未分化型胃癌、或中分化型胃癌。
[0249] 本发明的鉴定方法中，"治疗效果"是指癌治疗的效果，只要是对患者有益的效果 即可，没有特别限定，例如，可以列举肿瘤缩小效果、无恶化生存时间延长效果、生命延长效 果等。
[0250]本发明的鉴定方法中，关于ATG3-EPHB1基因融合，作为评价癌治疗的有效性的对 象的"抑制由作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽 的表达和/或活性的物质"（以下，也称为本发明的鉴定方法中的对象物质），只要是直接或 间接地抑制ATG3-EPHB1融合多肽的表达和/或其功能的物质即可，没有特别限定。
[0251] 作为抑制ATG3-EPHB1融合多肽的表达的物质，例如，可以列举抑制ATG3-EPHB1融 合多肽的表达的siRNA(small interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)、miRNA (micro RNA)、反义核酸、可以表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。
[0252] 作为抑制ATG3-EPHB1融合多肽的功能的物质，例如，可以列举抑制EPHB1激酶活性 的物质（例如低分子化合物等）、与ATG3-EPHB1融合多肽结合的抗体等。
[0253] 这些物质可以为特异性抑制ATG3-EPHB1融合多肽的表达和/或活性的物质，也可 以为还抑制野生型EPHB1蛋白质的表达和/或活性的物质。作为这种物质的具体例，可以列 举达沙替尼（(1&8&1:;[11；[13)、？0-173955、;1^0161:;[11；[13、伯舒替尼（1308111:;[11；[13)、克唑替尼 (c;rizotinib)、AST-487、staurosporine、凡德他尼（vandetanib)、MLN-8054、TAE 684、尼洛 替尼（nilotinib)、dorsomorphin、Cdkl/2抑制剂III、IKK-2抑制剂IV、GSK_30抑制剂XII、 PP1 类似物II等（参照Ephrin receptor family:EPH receptor B1 .Last modified on 26/ 03/2013.Accessed on 10/12/2013.IUPHAR database(IUPHAR-DB),http://www.iuphar-db·org/DATABAS E/ObjectDisplayForward?objectld = 1830 ·)0
[0254]这些物质能够基于本说明书中所公开的ATG3-EPHB1融合多核苷酸和/或ATG3-EPHB1融合多肽的序列信息等、利用自身公知的方法来制备。另外，也可以利用市售的物质。
[0255] 在来自受试者的分离得到的试样中检测到ATG3-EPHB1融合多核苷酸或由其编码 的多肽的情况下，这些物质作为癌治疗剂对于该受试者是有效的。
[0256] 关于TNIK-RNF123基因融合，作为本发明的鉴定方法中的对象物质，只要是直接或 间接地抑制TNIK-RNF123融合多肽的表达和/或其功能的物质即可，没有特别限定。
[0257] 作为抑制TNIK-RNF123融合多肽的表达的物质，例如，可以列举抑制TNIK-RNF123 融合多肽的表达的siRNA(small interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)、miRNA (micro RNA)、反义核酸、可以表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。
[0258] 作为抑制TNIK-RNF123融合多肽的功能的物质，例如，可以列举抑制TNIK激酶活性 的物质(例如低分子化合物等）、与TNIK-RNF123融合多肽结合的抗体等。
[0259] 这些物质可以为特异性抑制TNIK-RNF123融合多肽的表达和/或活性的物质，也可 以为还抑制野生型TNIK蛋白质的表达和/或活性的物质。作为这种物质的具体例，可以列举 氨基噻唑衍生物(参照W0/2010/064111 )、4-苯基-2-苯基氨基吡啶碱的化合物(参照Ho KK et al.，Bioorg Med Chem Lett，2013,23(2):569_73(Epub 2012Nov 16))等。
[0260] 这些物质能够基于本说明书中所公开的TNIK-RNF123融合多核苷酸和/或TNIK-RNF123融合多肽的序列信息等、利用自身公知的方法来制备。另外，也可以利用市售的物 质。
[0261] 在来自受试者的分离得到的试样中检测到TNIK-RNF123融合多核苷酸或由其编码 的多肽的情况下，这些物质作为癌治疗剂对于该受试者是有效的。
[0262] 关于SLC12A2-NRG2基因融合，作为本发明的鉴定方法中的对象物质，只要是直接 或间接地抑制SLC12A2-NRG2融合多肽的表达和/或其功能的物质即可，没有特别限定。
[0263] 作为抑制SLC12A2-NRG2融合多肽的表达的物质，例如，可以列举抑制SLC12A2-NRG2融合多肽的表达的siRNA(small interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)、 miRNA(micro RNA)、反义核酸、可以表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。
[0264] 作为抑制SLC12A2-NRG2融合多肽的功能的物质，例如，可以列举抑制NRG2的增强 细胞内信号转导的活性的物质(例如低分子化合物等）、与SLC12A2-NRG2融合多肽结合的抗 体等。
[0265] 这些物质可以为特异性抑制SLC12A2-NRG2融合多肽的表达和/或活性的物质，也 可以为还抑制野生型NRG2蛋白质的表达和/或活性的物质。
[0266] 这些物质能够基于本说明书中所公开的SLC12A2-NRG2融合多核苷酸和/或 SLC12A2-NRG2融合多肽的序列信息等、利用自身公知的方法来制备。另外，也可以利用市售 的物质。
[0267] 另外，认为野生型NRG2蛋白质通过作为其受体的属于HER蛋白质群的蛋白质而增 强细胞内信号转导，因此，作为本发明的鉴定方法中的对象物质，也可以列举直接或间接地 抑制HER蛋白质的表达和/或其功能的物质。这里，HER蛋白质群为酪氨酸激酶型受体的一 组，含有HER1 (ErbB 1)、HER2 (ErbB2)、HER3 (ErbB3)和HER4(ErbB4)这4种蛋白质。
[0268] 作为抑制HER蛋白质的表达的物质，例如，可以列举抑制HER蛋白质的表达的siRNA (small interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)、miRNA(micro RNA)、反义核酸、可 以表达这些多核苷酸的表达载体、低分子化合物等。
[0269]作为抑制HER蛋白的功能的物质，例如，可以列举抑制HER蛋白的激酶活性的物质 (例如，低分子化合物等）、与HER蛋白结合的抗体等。作为这样的物质的具体例，可以列举阿 帕替尼（rapatinib)、阿法替尼（afatinib)、达克替尼（dacomitinib)、曲妥单抗 (trastuzumab)等。
[0270] 这些物质能够基于公知的序列信息等、利用自身公知的方法来制备。另外，也可以 利用市售的物质。
[0271] 在来自受试者的分离得到的试样中检测到SLC12A2-NRG2融合多核苷酸或由其编 码的多肽的情况下，这些物质作为癌治疗剂对于该受试者是有效的。
[0272] 本发明的鉴定方法中的工序（1)能够与上述本发明的检测方法中所包括的工序同 样地实施。
[0273] 本发明的鉴定方法中的工序(2)中，在以工序（1)在来自受试者（即癌患者或存在 患癌风险的受试者）的分离得到的试样中检测到融合多核苷酸或由其编码的多肽的情况 下，判定为本发明的鉴定方法中的对象物质在上述受试者中能带来治疗效果，另一方面，在 没有检测到融合多核苷酸或由其编码的多肽的情况下，判定为本发明的鉴定方法中的对象 物质在上述受试者中能带来治疗效果的可能性低。
[0274] 根据本发明的鉴定方法，从癌患者或存在患癌风险的受试者中检测到作为癌的责 任突变的新发现的基因融合的阳性例，能够鉴定抑制由该基因融合产生的融合多核苷酸所 编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的受试者， 本发明在能够进行适于这样的对象的治疗这一点上是有用的。
[0275] <癌的治疗方法和癌治疗剂>
[0276] 如上所述，通过本发明的鉴定方法，能够鉴定抑制由通过上述3种基因融合的任一 种产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者。 因此，通过对癌患者中保持该融合基因的患者选择性地投予该物质，能够高效地进行癌的 治疗。因此，本发明提供一种癌的治疗方法，其包括对受试者投予该物质的工序（以下，也称 为本发明的治疗方法）。
[0277] 本发明的治疗方法中，受试者典型而言为ATG3-EPHB1、TNIK-RNF123或SLC12A2-NRG2基因融合阳性癌患者。癌没有特别限定，优选为胃癌，进一步优选为特殊型胃癌、未分 化型胃癌、或中分化型胃癌。这里，ATG3-EPHB1、TNIK-RNF123、或SLC12A2-NRG2基因融合阳 性癌是指利用本发明的检测方法检测到各自的融合多核苷酸或由其编码的多肽的癌。
[0278] 另外，本发明提供一种ATG3-EPHB1、TNIK-RNF123、或SLC12A2-NRG2基因融合阳性 癌的治疗剂（以下，也称为本发明的癌治疗剂）。对于上述3种基因融合阳性癌，迄今为止没 有进行将该基因融合作为靶标的治疗。另外，关于这些基因融合的存在，即使考虑任一种现 有技术文献等，也是完全不能预料的。因此，本发明的癌治疗剂提供对上述3种的基因融合 阳性癌有效的新型的治疗手段。
[0279] 本发明的癌治疗剂中，癌没有特别限定，优选为胃癌，进一步优选为特殊型胃癌、 未分化型胃癌、或中分化型胃癌。
[0280] 本发明的癌治疗剂典型而言，含有抑制下述的融合多肽的表达和/或活性的物质 作为有效成分，所述融合多肽为:包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的ATG3-EPHB1融 合多肽;包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结构域和环指结构域、且具有激酶活性的 TNIK-RNF123融合多肽；或包括SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神 经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的SLC12A2-NRG2融合多肽。 [0281 ]在本发明的治疗方法和癌治疗剂中，作为抑制上述3种融合多肽的表达和/或活性 的物质，可以列举上述<鉴定癌患者或存在患癌风险的受试者的方法>中记载的物质。
[0282] 本发明的癌治疗剂能够使用这些在制剂化中通常所使用的药理学上可接受的载 体、赋形剂和/或其它的添加剂，作为医药组合物来制备。
[0283] 本发明的癌治疗剂的给药方法能够根据该抑制剂的种类或癌的种类等来适当选 择，例如，能够采用口服、静脉内、腹腔内、经皮、肌肉内、气管内（气溶胶）、直肠内、阴道内等 给药方式。
[0284] 本发明的癌治疗剂的给药量能够考虑有效成分的活性和种类、给药方式(例如口 月艮、非口服）、患病的严重程度、作为给药对象的动物种类、给药对象的药物感受性、体重、年 龄等来适当决定。
[0285] 本发明的治疗方法和癌治疗剂使以具有往未知的本申请发明发现的特定的癌的 责任突变的患者的治疗成为可能，因此是有用的。
[0286] <癌治疗剂的筛选方法>
[0287] 本发明提供对具有上述3种基因融合的任一种的癌患者能带来治疗效果的癌治疗 剂的筛选方法（以下，也称为本发明的筛选方法）。根据本发明的筛选方法，能够将抑制上述 3种融合多肽（即ATG3-EPHB1融合多肽、TNIK-RNF123融合多肽和SLC12A2-NRG2融合多肽）中 的任一种的表达和/或活性的物质作为癌治疗剂。
[0288] 提供给本发明的筛选方法的受试物质可以为任何化合物或组合物，例如，可以列 举核酸(例如，核苷、寡核苷酸、多核苷酸）、糖质(例如，单糖、二糖、寡糖、多糖）、脂质(例如， 饱和或不饱和的包括直链、支链和/或环的脂肪酸）、氨基酸、蛋白质（例如，寡肽、多肽）、低 分子化合物、化合物文库、无规肽文库、天然成分(例如，来自微生物、动植物、海洋生物等的 成分）、或者食品等。
[0289] 本发明的筛选方法只要能够评价受试物质是否抑制上述3种融合多肽中的任一种 的表达和/或活性即可，可以为任意形态。典型而言，本发明的筛选方法包括下述的工序：
[0290] (1)使受试物质与表达ATG3-EPHB1融合多肽、TNIK-RNF123融合多肽、或SLC12A2-NRG2融合多肽的细胞接触的工序；
[0291] (2)确定是否抑制上述融合多肽的表达和/或活性的工序;和
[0292] (3)将确定为抑制上述融合多肽的表达和/或活性的物质选择作为癌治疗剂的工 序。
[0293] 在工序（1)中，使表达上述3种融合多肽中的任一种的细胞与受试物质接触。作为 对照，能够使用不含被检测物质的溶剂(例如，DMS0等）。该接触能够在培养基中进行。培养 基根据所使用的细胞的种类等适当选择，例如，为含有约5~20%的胎牛血清的最低必需培 养基(MEM)、Dulbecco改良最低必需培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基等。另外，培 养条件也可以根据所使用的细胞的种类等适当选择，例如，培养基的pH为约6~约8,培养温 度为约30~约40°C，培养时间为约12~约72小时。
[0294] 作为表达上述3种融合多肽中任一种的细胞，例如，可以列举内在表达该融合多肽 的来自癌组织的细胞、从该细胞诱导的细胞株、通过基因工程制作的细胞株等，但不限定于 这些。某个细胞是否表达上述3种融合多肽中任一种，能够利用上述本发明的检测方法来确 认。另外，细胞通常为哺乳动物的细胞，优选为人类的细胞。
[0295] 在工序(2)中，确定是否抑制上述融合多肽的表达和/或活性。融合多肽的表达能 够通过用公知的分析方法、例如RNA印迹法、定量PCR法、免疫印迹法、ELI SA法等来确定细胞 中的mRNA水平或者蛋白质水平来测定。另外，融合多肽的活性也能够通过公知的分析方法 (例如，激酶活性测定等)来测定。将所得到的测定值与不接触受试物质的对照细胞中的测 定值进行比较。测定值的比较优选基于显著差异的有无来进行。与受试物质接触的细胞中 的测定值与对照进行相比显著降低时，能够确定为该受试物质抑制融合多肽的表达和/或 活性。
[0296] 或者，表达这些融合多肽的细胞增殖亢进，因此，能够将该细胞的增殖作为本工序 中用于确定的指标。此时，首先，测定与受试物质接触的该细胞的增殖。细胞增殖的测定能 够通过细胞计数、 3H胸腺嘧啶脱氧核苷的摄入、BRDU法等自身公知的方法来进行。其次，将 与受试物质接触的该细胞的增殖和不与受试物质接触的对照细胞的增殖进行比较。增殖水 平的比较优选基于显著差异的有无来进行。不与受试物质接触的对照细胞的增殖相对于与 受试物质接触的细胞的增殖的测定，可以为事先测得的值，也可以为同时测定得到的值，从 实验的精度、再现性的观点考虑，优选为同时测定得到的值。比较的结果为与受试物质接触 的该细胞的增殖被抑制时，能够确定为该受试物质抑制融合多肽的表达和/或活性。
[0297] 在工序(3)中，将在工序(2)中确定为抑制融合多肽的表达和/或活性的受试物质 选择作为癌治疗剂。
[0298] 如上所述，根据本发明的筛选方法，能够得到能够适用于具有以往未知的癌的责 任突变的患者的治疗的癌治疗剂。
[0299] <分离得到的融合多肽或其片段及编码它们的多核苷酸>
[0300] 本发明提供以下的分离得到的融合多肽（以下，也称为本发明的融合多肽)或其片 段：
[0301] (1)包括EPHB1蛋白质的激酶结构域且具有激酶活性的、分离得到的ATG3-EPHB1融 合多肽、
[0302] (2)包括TNIK蛋白质的激酶结构域、RNF123蛋白质的SPRY结构域和环指结构域、且 具有激酶活性的、分离得到的TNIK-RNF123融合多肽、
[0303] (3)包括SLC12A2蛋白质的AA_permease_N super family结构域和NRG2蛋白质的 神经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的、分离得到的SLC12A2-NRG2融合多肽。
[0304] 本说明书中，"分离得到的"物质是指某种物质为从天然存在的环境(例如生物体 的细胞内）的其它物质(优选生物学因子）（例如为核酸的情况下，为核酸以外的因子和包括 目标核酸以外的核酸序列的核酸;为蛋白质的情况下，为蛋白质以外的因子和包括目标蛋 白质以外的氨基酸序列的蛋白质等）中实质分离或精制得到的物质。本说明书中"分离得 到"是指具有优选为75重量％以上、更优选为85重量％以上、更进一步优选为95重量％以 上、最优选为96重量％以上、97重量％以上、98重量％以上、99重量％以上、或100%的纯度。 在"分离得到的"多核苷酸和多肽中，包括通过标准的精制方法精制得到的多核苷酸和多 肽，另外，也包括化学合成得到的多核苷酸和多肽。
[0305] 关于上述（1)~（3)中的其它的各词语的含义如上述<具体的癌的责任突变>中 所记载的各词语的含义。
[0306] "片段"是指为本发明的融合多肽的片段，由包括融合点的上游和下游的序列的连 续的部分序列构成。该部分序列中所包括的融合点的上游的序列包括从融合点至1个氨基 酸残基以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100个氨基酸残基以上），可以包括直 至本发明的融合多肽的N末端。该部分序列中所包括的融合点的下游的序列包括从融合点 至1个氨基酸残基以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100个氨基酸残基以上）， 也可以包括直至本发明的融合多肽的C末端。片段的长度没有特别限定，通常为8个氨基酸 残基以上(例如9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、100个氨基酸残基以上）。
[0307]另外，本发明的融合多肽例如可以为下述的分离得到的融合多肽。
[0308] (1)关于 ATG3-EPHB1 融合多肽，
[0309] (i)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽，
[0310] (ii)由在序列号2所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺失、取代或者添加1个或多 个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽，或
[0311] (iii)由与序列号2所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列 构成、且具有激酶活性的多肽；
[0312] (2)关于 TNIK-RNF123 融合多肽，
[0313] (i)由序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列构成的多肽，
[0314] (ii)由在序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺 失、取代或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽，或
[0315] (iii)由与序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列具有80%以上的序 列同一性的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽；
[0316] (3)关于 SLC12A2-NRG2 融合多肽，
[0317] (i)由序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列构成的多肽，
[0318] (^)由在序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺失、取代 或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽， 或
[0319] (iii)由与序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一 性的氨基酸序列构成、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽。
[0320] 上述（i)~（iii)中的各词语的含义与上述<具体的癌的责任突变> 中所记载的 各词语的含义相同。
[0321] 另外，本发明提供编码上述本发明的融合多肽或其片段的分离得到的多核苷酸 (以下，也称为本发明的多核苷酸）。本发明的多核苷酸可以为mRNA、cDNA和基因组DNA的任 一种。另外，可以为双链，也可以为双链。
[0322] 编码ATG3 -EPHB1融合多肽的cDNA的典型例为由序列号1所示的碱基序列构成的多 核苷酸。
[0323] 编码TNIK-RNF123融合多肽的cDNA的典型例为由序列号3、5、7、9、11、13、15或17所 示的碱基序列构成的多核苷酸。
[0324] 编码SLC12A2-NRG2融合多肽的cDNA的典型例为由序列号19、21、23、25、或27所示 的碱基序列构成的多核苷酸。
[0325] 本发明的多核苷酸能够利用自身公知的方法制作。例如，可以由从保持ATG3-EPHB1融合多核苷酸、TNIK-RNF123融合多核苷酸、或SLC12A2-NRG2融合多核苷酸的癌组织 等制备的cDNA文库或者基因组文库利用公知的杂交技术来提取。另外，也能够以从上述癌 组织等制备的mRNA、cDNA或者基因组DNA为模板，利用公知的基因扩增技术(PCR)进行扩增 来制备。另外，也能够以来自各融合多核苷酸的5'末端侧和3'末端侧的部分的野生型基因 的cDNA为材料，利用PCR、限制性内切酶处理、定点突变诱导（site-directed mutagenesis) 法（Kramer，W.&Fritz，HJ.，Methods Enzymol，1987，154，350 ·)等公知的基因扩增技术、重 组技术来制备。
[0326] 本发明的融合多肽或其片段也能够通过自身公知的方法来制得。例如，将如上所 述制得的多核苷酸插入适当的表达载体，将该载体导入无细胞蛋白质合成体系(例如，网织 红细胞提取液、小麦胚芽提取液)进行孵育，或者将该载体导入适当的细胞（例如，大肠杆 菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞），将由此得到的转化体进行培养，由此，能够制备本发明的融 合多肽。
[0327] 本发明的融合多肽或其片段能够作为本发明的检测方法等中的标记物使用，另 外，也能够用于制作针对本发明的融合多肽的抗体等。实施例
[0328] 以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[0329] < 样品 >
[0330] 作为RNA测序用样品，由从51病例（中分化型5病例、特殊型mucinous 3病例、未分 化型43病例）的胃癌患者摘除的胃组织利用规定方法制备总RNA。另外，作为RT-PCR和桑格 测序用的样品，由从149病例（高分化型27病例、中分化型65病例、特殊型mucinous 2病例、 未分化型55病例）的胃癌患者摘除的胃组织利用规定方法制备总RNA。其中，该研究得到本 研究的组织的伦理审查员会的承认而进行。
[0331] <RNA测序 >
[0332] RNA测序文库根据制造者的标准操作说明、使用Illumina公司TruSeq RNA Sample Prep Kit v2来制作。关于该文库，使用新一代测序仪、HiSeq2000或GAIIx进行100bp的双端 测序。通过将所得到的双端测序与RefSeq(NCBI Reference Sequence)数据库对照，检测融 合基因候选。
[0333] <RT_PCR、桑格测序>
[0334] 由从胃癌患者摘除的胃组织提取的总RNA通过逆转录酶法合成cDNA。将所得到的 cDNA用于PCR扩增。所得到的PCR产物的碱基序列使用BigDye Terminator kit和ABI 3130x1 DNA测序仪(Applied Biosystem公司制)直接确定。其中，本研究中所使用的引物示 于表1。
[0337](实施例）
[0338] 本实施例对胃癌组织中的新型融合转录产物的鉴定进行记载。
[0339] 为了鉴定可成为治疗靶标的新型融合转录产物，进行从51病例（中分化型5病例、 特殊型mucinous 3病例、未分化型43病例）的胃癌患者中摘除的胃组织的全转录组测序 (RNA测序、Meyerson，M.et al.，Nat Rev Genet，2010，ll，685_696)〇
[0340] 除利用PCR的重复克隆之外的结果，可得到各自8.OX 107以上的配对碱基序列。将 这些参照于现有的基因数据基础的结果，在1例(特殊型muc inous)中检测ATG3基因和ΕΡΗΒ1 基因的融合基因候补，在1例(未分化型）中检测TNIK基因和RNF123基因的融合基因候补，而 且在1例（中分化型）中检测SLC12A2基因和NRG2基因的融合基因候补。将融合基因的结构示 于表2和图1~4。
[0341] [表 2]
[0343]接着，对检测到上述融合基因的检体，使用表1中记载的引物进行RT-PCR，将所得 至|J的PCR产物进行序列解析，由此确认上述3种融合基因的表达。扩增得到的PCR产物的序列 如下所述。
[0344] ATG3-EPHB1 (大字母和小字母分别表示来自ATG3基因的序列和来自EPHB1基因的 序列）
[0346] TNIK-RNF123(大字母和小字母分别表示来自TNIK基因的序列和来自RNF123基因 的序列）
[0348] SLC12A2-NRG2融合基因（大字母和小字母分别表示来自SLC12A2基因的序列和来 自NRG2基因的序列）
[0350] ATG3-EPHB1为通过染色体倒位（inv3)产生的、ATG3基因的外显子2和EPHB1基因的 外显子7编码不发生阅读框错位而直接结合的融合基因。其中，关于ATG3-EPHB1融合基因， 克隆编码区域整体并进行序列确定(序列号1)。
[0351] TNIK-RNF123为通过染色体倒位（inv3)产生的、TNIK基因的外显子32和RNF123基 因的外显子6编码不发生阅读框错位而直接结合的融合基因。
[0352] SLC12A2-NRG2为通过染色体倒位（inv5)产生的、SLC12A2基因的外显子4和NRG2基 因的外显子2编码不发生阅读框错位而直接结合的融合基因。
[0353] 以上的结果显示:通过利用RT-PCR有无特异条带的扩增的检查或PCR产物的碱基 序列确定，能够检测实施例1所发现的基因融合。
[0354] 另外，对正常胃粘膜组织使用表1中记载的引物进行RT-PCR，结果确认，没有特异 条带的扩增，上述3种融合基因均没有进行表达。以上的结果显示，上述3种基因融合为癌细 胞所特有的。
[0355] 另外，作为公知的胃癌的原因基因突变已知的KRAS突变(从N末端至第12、13或61 号氨基酸残基的突变）、NRAS突变(从N末端至第12、13或61号氨基酸残基的突变）、和8狀?突 变(从N末端至第600号及其周边的氨基酸残基的突变)在检测到上述3种融合基因的3个病 例的任一个中均没有检测到。因此，暗示这些融合基因作为胃癌的责任突变的可能性高。
[0356] 工业上的可利用性
[0357] 根据本发明，能够检测作为癌的责任突变的新发现的基因融合，能够鉴定抑制由 该基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的 癌患者或存在患癌风险的受试者，能够进行适于这种癌患者的治疗(个体化医疗）。
[0358] 序列表自由文本
[0359] 序列号1:ATG3_EPHB1融合多核苷酸
[0360] 序列号2:ATG3-EPHB1融合多肽
[0361] 序列号3、5、7、9、11、13、15和17 4肌1(-1?吧123融合多核苷酸
[0362] 序列号4、6、8、10、12、14、16和18:了肌1(-1?吧123融合多肽
[0363] 序列号19、21、23、25和27:51^(：1242-顺62融合多核苷酸
[0364] 序列号 20、22、24、26和28:51^(：1242-顺62融合多肽
[0365] 序列号 29:ATG3cDNA
[0366] 序列号30:ATG3多肽
[0367] 序列号 31:EPHBlcDNA
[0368] 序列号32:EPHB1多肽
[0369] 序列号 33、35、37、39、41、43、45和47:了肌1(。0嫩
[0370] 序列号 34、36、38、40、42、44、46和48:了肌1(多肽
[0371] 序列号 49:RNF123cDNA
[0372] 序列号50:RNF123多肽
[0373] 序列号 51 和 53:SLC12A2cDNA
[0374] 序列号52和54:SLC12A2多肽
[0375] 序列号 55、57、59、60P63:NRG2cDNA
[0376] 序列号 56、58、60、62 和 64: NRG2 多肽
[0377] 序列号65:ATG3正向引物
[0378] 序列号66:EPHB1引物
[0379] 序列号67:TNIK正向引物
[0380] 序列号68:RNF123引物
[0381] 序列号69:SLC12A2正向引物
[0382] 序列号70:NRG2引物
[0383] 序列号71 :ATG3-EPHB1融合多核苷酸的部分序列
[0384] 序列号72:TNIK-RNF123融合多核苷酸的部分序列
[0385] 序列号73:SLC12A2-NRG2融合多核苷酸的部分序列
【主权项】
1. 一种作为癌的责任突变(驱动突变)的基因融合的检测方法，其特征在于： 包括检测来自受试者的分离得到的试样中下述(a)~（c)中的任一种融合多核苷酸或 由其编码的多肽的工序： (a) ATG3-EPHBl融合多核苷酸，其编码包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的多 肽； (b) TNIK-RNF123融合多核苷酸，其编码包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结构域 和环指结构域、且具有激酶活性的多肽;和 (c) SLC12A2-NRG2融合多核苷酸，其编码包括SLC12A2的AA_permease_N super family 结构域和NRG2的神经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于： 融合多核苷酸为下述(a)~(c)中的任一种： (a) 编码下述的多肽的ATG3-EPHB1融合多核苷酸： (i) 由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽， (ii) 由在序列号2所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺失、取代或者添加1个或多个氨 基酸的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽，或 (iii) 由与序列号2所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列构成、 且具有激酶活性的多肽； (b) 编码下述的多肽的TNIK-RNF123融合多核苷酸： (i) 由序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列构成的多肽， (ii) 由在序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺失、取 代或者添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽，或 (iii) 由与序列号4、6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同 一性的氨基酸序列构成、且具有激酶活性的多肽;和 (c) 编码下述的多肽的SLC12A2-NRG2融合多核苷酸： (i) 由序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列构成的多肽， (ii) 由在序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列所构成的多肽中缺失、取代或者 添加1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽，或 (iii) 由与序列号20、22、24、26或28所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的 氨基酸序列构成、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽。3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于： 融合多核苷酸为下述(a)~(c)中的任一种： (a) (i)由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸， (ii) 与由与序列号1所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷 酸在严格条件下杂交、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸， (iii) 由在序列号1所示的碱基序列所构成的多核苷酸中缺失、取代或者添加1个或多 个核苷酸的碱基序列构成、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸，或 (iv) 与由序列号1所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80%以上的序列同一性、且编 码具有激酶活性的多肽的多核苷酸； (b) (i)由序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列构成的多核苷酸， (ii) 与由与序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的 碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸， (iii) 由在序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列所构成的多核苷酸中缺失、 取代或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列构成、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸， 或 (iv) 与由序列号3、5、7、9、11、13、15或17所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80%以 上的序列同一性、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸;和 (c)(i)由序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列构成的多核苷酸， (ii)与由与序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列所构成的多核苷酸互补的碱基 序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的 多核苷酸， (1^)由在序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列所构成的多核苷酸中缺失、取代 或者添加1个或多个核苷酸的碱基序列构成、且编码具有激酶活性的多肽的多核苷酸，或 (iv)与由序列号19、21、23、25、或27所示的碱基序列构成的多核苷酸具有80%以上的 序列同一性、且编码具有增强细胞内信号转导的活性的多肽的多核苷酸。4. 如权利要求1~3中任一项所述的方法，其特征在于： 癌为胃癌。5. -种鉴定癌患者或存在患癌风险的受试者的方法，所述癌患者或存在患癌风险的受 试者是抑制由作为癌的责任突变(驱动突变）的基因融合产生的融合多核苷酸所编码的多 肽的表达和/或活性的物质能带来治疗效果的癌患者或存在患癌风险的受试者，所述方法 的特征在于，包括下述的工序： (1) 检测来自受试者的分离得到的试样中的下述(a)~(c)中的任一种融合多核苷酸或 由其编码的多肽的工序： (a) ATG3-EPHBl融合多核苷酸，其编码包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的多 肽； (b) TNIK-RNF123融合多核苷酸，其编码包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结构域 和环指结构域、且具有激酶活性的多肽;和 (c) SLC12A2-NRG2融合多核苷酸，其编码包括SLC12A2的AA_permease_N super family 结构域和NRG2的神经调节蛋白家族保守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的多肽； 和 (2) 在检测到所述融合多核苷酸或由其编码的多肽的情况下，判定为抑制所述多肽的 表达和/或活性的物质在所述受试者中能带来治疗效果的工序。6. -种作为癌的责任突变(驱动突变）的基因融合的检测用试剂盒，其特征在于，含有 下述(A)~(C)中的任一种或者它们的组合： (A)作为探针的多核苷酸，所述探针设计为特异性识别A T G 3 - Ε Ρ Η B1融合多核苷酸、 TNIK-RNF123融合多核苷酸、或SLC12A2-NRG2融合多核苷酸； (Β)作为一对引物的多核苷酸，所述一对引物设计为能够特异性扩增ATG3-EPHB1融合 多核苷酸、TNIK-RNF123融合多核苷酸、或SLC12A2-NRG2融合多核苷酸;和 (C)特异性识别ATG3-EPHB1融合多肽、TNIK-RNF123融合多肽、或SLC12A2-NRG2融合多 肽的抗体。7. 包括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的、分离得到的ATG3-EPHB1融合多肽或其 片段。8. 包括TNIK的激酶结构域、RNF123的SPRY结构域和环指结构域、且具有激酶活性的、分 离得到的TNIK-RNF123融合多肽或其片段。9·包括SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神经调节蛋白家族保 守区域、且具有增强细胞内信号转导的活性的、分离得到的SLC12A2-NRG2融合多肽或其片 段。10. 编码权利要求7~9中任一项所述的融合多肽或其片段的多核苷酸。11. 一种ATG3-EPHB1、TNIK-RNF123、或 SLC12A2-NRG2基因融合阳性癌的治疗剂。12. 如权利要求11所述的治疗剂，其特征在于： 含有抑制下述的融合多肽的表达和/或活性的物质作为有效成分，所述融合多肽为:包 括EPHB1的激酶结构域且具有激酶活性的ATG3-EPHB1融合多肽;包括TNIK的激酶结构域、 RNF123的SPRY结构域和环指结构域、且具有激酶活性的TNIK-RNF123融合多肽；或包括 SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神经调节蛋白家族保守区域、且 具有增强细胞内信号转导的活性的SLC12A2-NRG2融合多肽。13. 如权利要求11或12所述的治疗剂，其特征在于： 癌为胃癌。14. 一种癌治疗剂的筛选方法，其特征在于，包括下述的工序： (1) 使受试物质与表达下述的融合多肽的细胞接触的工序，其中，所述融合多肽为:包 括EPHB 1的激酶结构域且具有激酶活性的ATG3-EPHB1融合多肽;包括TNIK的激酶结构域、 RNF123的SPRY结构域和环指结构域、且具有激酶活性的TNIK-RNF123融合多肽；或包括 SLC12A2的AA_permease_N super family结构域和NRG2的神经调节蛋白家族保守区域、且 具有增强细胞内信号转导的活性的SLC12A2-NRG2融合多肽； (2) 确定是否抑制所述融合多肽的表达和/或活性的工序;和 (3) 将确定为抑制所述融合多肽的表达和/或活性的物质选择作为癌治疗剂的工序。
【文档编号】C07K19/00GK105980555SQ201480069695
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年12月18日
【发明人】柴田龙弘, 细田文惠
【申请人】日本国立癌症研究中心, Lsip基金运营联合公司