一种miR-10b基因在胃癌基因表达调控中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种HiiR-IOb基因在癌症中的作用，具体涉及在胃癌中的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤的侵袭转移能力是肿瘤治疗的一大难点。近些年来，微小 RNA(micr〇RNA，miRNA)的出现为研究肿瘤的发生及侵袭转移机制提供了新的思路和途径， 微小RNA(miRNA)是一类内源性、保守、稳定的非编码短单链RNA，在转录后水平调节靶基因 表达miRNA在机体发育、细胞增殖、凋亡及肿瘤发生发展等生理和病理过程中发挥重要作 用，成为当前生命科学研究的热点。miRNA (microRNA)是广泛存在于生物体内的19-25nt的 非编码单链小分子RNA，其通过与靶基因 mRNA的互补配对降解靶mRNA或抑制其翻译。研 究表明miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗与诊断的新途 径。miRNA与靶基因 mRNA的非编码序列（3^ -UTR或Y -UTR)存在着一对多的关系。在 癌症病例中经常发现miRNA群表达失调的现象，而这些miRNA表达的改变与癌症发生密切 相关。在体外实验中，改变一个或者多个miRNA的表达能够促进或者抑制癌细胞恶化，促进 癌细胞恶化的miRNA可以认为是一类癌基因，反之，抑癌基因。miR-lOb作为微小RNA家族 中的一员，在肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、垂体瘤、急性髓性白血病等肿瘤组织中都有异 常表达，并且与肿瘤的侵袭性和远处转移有密切关系。
[0003] 胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西 北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发年龄在50岁以上，男女发病率 之比为2 :1。胃癌的预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施有 关。据世界卫生组织估计，2008年全球范围内大约100万胃癌新发病例，占全部肿瘤发病 的7. 8%，仅次于肺癌、乳腺癌和结直肠癌。超过70%的胃癌病例发生在发展中国家，其中 50%发生在中国。在我国，胃癌年龄标化发病率男性为41. 3/10万，女性为18. 5/10万，仅 次于肺癌。大约90%-95%的胃癌为腺癌,起源于胃部上皮组织。已有文献报道miR-lOb 在多种癌中起到抑癌基因的作用。KLF4(Kriippel-like factor4)是一种在多种人类组织 中广泛表达的锌指转录因子，在许多不同的生理活动中具有重要作用，研究表明KLF4基因 与多种肿瘤的发生发展有关，通过检测癌组织中KLF4蛋白的表达，探讨KLF4蛋白与胃癌临 床病理间的关系。
[0004] 本发明拟在胃癌细胞中验证KLF4是否是miR-lOb的靶基因，并探讨miR-lOb在胃 癌侵袭转移中的调控机制，为胃癌的临床治疗提供理论依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术中上述缺陷，提供一种miR-lOb基因作为KLF4 靶基因的调控者在制备下调胃癌细胞中KLF4表达水平药物中的应用。具体地，调节癌症细 胞中KLF4表达水平为miRNA-lOb抑制KLF4的表达，其中癌症细胞主要为胃癌细胞，并且 其中所述miR-lOb在RNA和蛋白水平同时调节靶基因 KLF4的表达。本发明还提供了一种 KLF4作为癌症治疗靶点在制备治疗癌症药物中的用途，其中癌症细胞主要为胃癌细胞。
[0006] 本发明还提供了以下具体方法，研究KLF4是否是miR-lOb的靶基因，具体为：
[0007] a)生物信息学方法对miR-lOb的靶基因进行预测；
[0008] b)不同胃癌细胞中miR-10b、KLF4mRNA表达水平的相关性检测；
[0009] c)荧光素酶报告验证KLF4是miR-lOb的靶基因；
[0010] d)建立稳定表达miR-lOb的细胞株，荧光定量PCR技术和western blot技术阐明 miR-lOb作用于靶基因 KLF4的核酸水平或蛋白水平；
[0011] e)胃癌组织中验证miR-lOb和KLF4的表达相关性。
[0012] 本发明培养多种胃癌细胞株，收集细胞进行总RNA抽提后，采用荧光定量PCR法检 测不同细胞中miR-lOb，KLF4mRNA的表达水平。发现miR-lOb与KLF4mRNA表达呈相反趋势 后，采用双荧光素酶检测法进一步验证KLF4是miR-lOb的直接靶基因。进一步采用荧光定 量PCR，WesternBlot检测上调miR-lOb的表达对靶基因 KLF4核酸和/或蛋白表达水平的 调控方式。最后在临床胃癌组织样本中分析miR-lOb和KLF4表达的相关性。
[0013] 胃癌细胞中HiiR-IOb的表达水平影响细胞的增殖，迁移能力等，在胃癌的发生起 重要的作用。KLF4与癌症的发生密切相关。miR-lOb通过与其靶基因 KLF4的mRNA的 3' -UTR互补，抑制靶基因 mRNA的翻译或直接降解靶mRNA。本实验通过软件预测、构建载 体，然后在胃癌细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了 KLF4是miR-lOb的靶基因，并在 AGS细胞中利用qRT-PCR技术，进一步验证了该发现。所公开的为在AGS细胞系中KLF4是 miR-lOb的靶基因的首次报道，该发明为利用miRNA-lOb为胃癌提供药物靶点方面提供了 一定的应用价值。
【附图说明】
[0014] 图1.不同胃癌细胞中miR-lOb表达水平的检测；
[0015] 图 2. pCDH-RFP-miR10b sponge-EFl-GFP+puro 质粒构建图谱；
[0016] 图 3. PCR 验证 pCDH-RFP-miR10b sponge-EFl-GFP+puro，扩增 RFP 序列。
[0017] 1?6 :挑取的克隆；7 :阴性对照；
[0018] 图 4. EcoRI/BamHI 双酶切验证 pCDH-RFP-miR10b sponge-EFl-GFP+puro，
[0019] I :未酶切质粒对照；2 :EcoRI/BamHI双酶切的质粒；
[0020] 图 5. pCDH-CMV-miR10b-EFl-GFP+Puro 质粒构建图谱；
[0021] 图6. PCR验证miR-lOb表达载体，1?12 :挑取的克隆，13 :阴性对照；
[0022] 图 7. EcoRI/BamHI 双酶切验证 pCDH-CMV-miR10b-EFl-GFP+Puro 载体，
[0023] 1 :未酶切质粒；2 :EcoRI/BamHI酶切质粒；
[0024] 图8.慢病毒包装示意图；
[0025] 图9.过表达和抑制表达miR-lOb后稳转细胞株中miR-lOb的表达水平；
[0026] 图10.过表达miR-lOb后，KLF4mRNA和蛋白表达水平的检测；
[0027] 图11.荧光素酶报告检测。
[0028] 图12. miR-lOb在胃癌组织中的表达分布。
[0029] 图13. KLF4蛋白在胃癌组织中的定位和表达。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例进一步描述本发明。
[0031] 实施例一：不同胃癌细胞中miR-10b，KLF4mRNA表达水平的检测
[0032] 培养多种胃癌细胞株，收集细胞进行总RNA抽提后，采用荧光定量PCR法检测不同 细胞中miR-10b，KLF4mRNA的表达水平。
[0033] 结果可见，miR-lOb与KLF4mRNA表达在不同的胃癌细胞中呈相反趋势，miR-lOb在 SGC-7901，MKN-45，BGC-823，AGS，MGC-803 依次下降，而在 SGC-7901，MKN-45，BGC-823，AGS， MGC-803中呈上升趋势，提示KLF4可能是miR-lOb的靶基因（图1)。
[0034] 实施例二：慢病毒缺失表达载体pO)H-RFP-miR10b sponge-EFl-GFP+puro和过表 达载体pCDH-CMV-miR10b-EFl-GFP+Puro的构建以及KLF4靶基因细胞学观察
[0035] 本实验设计miR-lOb干扰载体，基于慢病毒表达载体
[0036] pCDH-CMV