专利名称：一种激活鱼类脂代谢调控基因表达的诱导剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术应用领域，具体涉及一种激活鱼类脂代谢调控基因表达 的诱导剂及其应用。
背景技术：
xLM, it ^ M W ±1 M ^ # 舌 ^ #(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)是一类能被内源性脂肪酸以及外源性过氧化物酶体增殖物(peroxisome proliferator, PP)作为配体激活的核转录因子，属II型核受体超家族成员。PPAR还因能 被内源性脂肪酸及其代谢产物激活而称为脂肪酸受体(fatty acid receptor)。在多种动 物体内都存在三类PPARs受体，即PPAR α，PPAR β亦称PPAR δ及PPAR γ，这三种亚型均有 特异性，能产生不同的生物学作用。PPAR能够调控许多参与细胞内外脂类代谢的目的基因 表达，尤其是编码β氧化过程中一些重要酶类的基因，另外PPAR也参与脂肪细胞的分化， 可能对细胞的生长、分化甚至凋亡有重要影响。PPARs是脂肪细胞分化及脂类代谢的重要调 节因子，在调控能量代谢方面起中枢作用，能够控制脂肪酸吸收、脂肪沉积和脂肪形成，是 稳定脂类代谢内环境和胰岛素抵抗的主要调节因子。因此，对PPARs功能和作用机制的研 究引起了许多研究者的兴趣。人工配合饲料在养鱼业中的应用已经非常广泛。池塘养鱼业中，由于长期应用配 合饲料饲养家鱼，常常会引起鱼类的脂肪肝和脂肥倾向，影响鱼类的生长和鱼肉的鲜味。 随着社会的发展，人们对畜禽产品的组成和风味的要求越来越高，科学、合理地调控畜禽机 体脂肪沉积成为动物育种和生产领域的重要课题。PPARs起脂肪感受器的作用，局部改变 基因表达以调节脂类代谢。同时调控脂肪细胞分化，对脂肪细胞均具有转录激活作用，其中 PPARy具有最强的促进脂肪细胞分化的能力。根据PPARs的这些生物学功能，寻求更高亲 和力与特异性的激活剂或拮抗剂，在医学上用于治疗肥胖、高血脂症、II型糖尿病等代谢性 疾病；在畜牧生产中提高畜禽瘦肉率和降低禽类腹脂沉积以改善肉质等均具有重要意义。迄今为止，PPAR基因三种亚型已在灵长类、啮齿类、两栖类、鸟类和一些鱼类中被 鉴定和克隆，但有关鱼类PPAR的研究远没有哺乳类动物多。目前已知PPAR三种亚型有一 些共同的配体，如ΡΡ、多不饱和脂肪酸、胰岛素、非甾体类抗炎药。PPARa配体包括长链不 饱和脂肪酸、支链、聚合和氧化型脂肪酸、二十烷类化合物、白三烯Β4、贝特类降脂药物和 Wy-14563等多种。多聚不饱和脂肪酸、前列腺素和视黄酸是PPARi^的天然配基。PPARy 的配体包括某些前列腺素、前列腺素样分子等，花生四烯酸经环氧合酶、脂氧合酶作用后的 代谢产物，如15-脱氧前列腺素J2、脂肪酸衍生物为PPAR γ的天然配体。目前尚未见有将 氯贝丁酯、2-溴软脂酸、15-脱氧-Δ 12，14-前列腺素J2用于调节草鱼体内脂类代谢平衡 的相关研究报道。HWtenophaiyngodon iWh)是我国主要养殖对象，可以有效利用廉价的植 物蛋白源提供水产品，但是草鱼在养殖过程中体脂含量增加及脂肪肝的发生表现较为突 出。在集约化养殖条件下，由于大量摄入人工配合饲料及缺少运动，草鱼体内脂肪沉积，生长缓慢，体型异常，降低了鱼肉品质和风味，同时也增加了养殖成本。经解剖检查，体腔内脂 肪大部分沉积在肠道周围、肠系膜上或肝脏表层，严重者肝脏失去血色，呈乳黄色或灰 黄色。因此在鱼类饲料中添加降脂因子，降低其体组织脂肪的蓄积成为近几年水产动物营 养学的研究热点。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的鱼类养殖中存在的鱼体内脂肪沉积、生长缓慢、体 型异常等缺点，提供一种可维持鱼类营养代谢平衡，减少鱼类脂肪沉积，改善鱼肉品质的诱 导剂。本发明另一目的在于提供上述诱导剂的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一种激活鱼类脂代谢调控基因表达的诱导剂，包括氯贝丁酯、2-溴软脂酸、15-脱 氧-Δ 12，14-前列腺素J2中的一种或几种的混合物。本发明将氯贝丁酯(Clofibrate)，2-溴软脂酸(2-bromopalmitate)，15-脱 氧-Δ 12，14-前列腺素 J2 (15-deoxy- Δ 12，14- prostaglandin J2, 15d_J2)作为诱导剂 对草鱼进行活体注射，注射微量(mg/kg级)，激活草鱼脂类代谢调控基因，特别是过氧化物 酶体增殖体激活受体(PPAR)基因表达，以维持养殖鱼营养代谢平衡。首先本发明人研究了鱼体内PPAR对于脂肪代谢影响
过氧化物酶体增殖物激活受体是作为配体激活的核转录因子，是脂肪细胞分化及脂类 代谢的重要调节因子，在调控能量代谢方面起中枢作用，能够控制脂肪酸吸收、脂肪沉积和 脂肪形成，是稳定脂类代谢内环境的主要调节因子。PPAR能够调控许多参与细胞内外脂类 代谢的目的基因表达，尤其是编码β氧化过程中一些重要酶类的基因，另外PPAR也参与脂 肪细胞的分化，可能对细胞的生长、分化甚至凋亡有重要影响。PPAR的3种亚型在不同组织 中的表达各不相同，虽然在大多数组织细胞中PPARa、PPARii和PPARy是共同表达的，但 表达水平却相差悬殊。PPARa主要表达于心、肝、肾近曲小管、骨骼肌和棕色脂肪等代谢活 跃的组织。PPARii在多种组织、细胞表达，其中脑、脂肪细胞及皮肤最高，而PPARy主要存 在于脂肪组织和免疫系统，在脂肪、肠和乳腺等组织中有较高表达。本发明人利用荧光定量PCR方法，以β-肌动蛋白为外参照，研究草鱼不同组织 PPAR基因的表达水平。研究结果显示，PPARa在肝脏中大量表达，其次是脑，在肌肉和心脏 中有微量表达；PPARii在心脏、肝脏和肌肉中表达最多，在脑、脾脏和脂质中有微量表达； PPARy表达相对较弱，只在肝脏中有较多表达，而在脑，肌肉和脂质中微弱表达。与哺乳动 物PPAR基因表达分布不同，鱼类PPAR基因主要在肝脏组织中大量表达，这可能是因为鱼类 缺乏皮下脂肪层，其主要脂肪蓄积部位是腹腔肠系膜脂肪组织、肝脏及肌肉。由于肝脏是 动物脂肪酸β -氧化代谢的重要部位，因而它是鱼类随营养状况而改变脂肪蓄积的主要调 节性贮脂器官(PPARa的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；PPARβ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4 所示；PPAR γ的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所 示)。接着分析了 PPAR三种亚型的配体，它们有一些共同的配体，如PP、多不饱和脂肪酸、胰 岛素、非留体类抗炎药。PPARα配体包括长链不饱和脂肪酸、支链、聚合和氧化型脂肪 酸、二十烷类化合物、白三烯Β4、贝特类降脂药物和Wy-14563等多种。通过激活PPARa调 节与脂肪酸β氧化有关的下游基因，如脂酰CoA氧化酶、肉碱棕榈酰转移酶I的表达，进而 加速脂肪酸的分解以达到降血脂的目的。脂肪酸也可以激活PPARa，加速脂肪酸的分解。 多聚不饱和脂肪酸、前列腺素和视黄酸是PPARii的天然配基。PPAR γ的配体包括某些前列 腺素、前列腺素样分子等，花生四烯酸经环氧合酶、脂氧合酶作用后的代谢产物，如15-脱 氧前列腺素j2、脂肪酸衍生物为PPARy的天然配体。因此，本发明选择氯贝丁酯(Clofibrate)，2_溴软脂酸(2-bromo palmitate), 15-脱氧-Δ 12，14-前列腺素 J2 (15-deoxy- Δ 12，14- prostaglandin J2, 15d_J2)分别 作为PPAR三种亚型的诱导剂，诱导激活草鱼脂类代谢调控基因——过氧化物酶体增殖体激 活受体(PPAR)表达。经过具体的实验摸索发现，注射Clofibrate 25-67 mg/kg鱼体重(优选50 mg/kg 体重)，2-bromo palmitate 35_58mg/kg 鱼体重(优选 42 mg/kg 体重)，15d_J2 0.95-1.05 mg/kg鱼体重(优选1 mg/kg体重)时，注射微量(mg/kg级)，激活过氧化物酶体增殖体激活 受体(PPAR)基因表达，作为调节草鱼体内脂类代谢平衡的基因表达诱导剂经济合算。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1.本发明提供了一种激活鱼类脂代谢调控基因表达的诱导剂，注射微量(mg/kg级)， 能够激活草鱼脂类代谢调控基因——过氧化物酶体增殖体激活受体(PPAR)基因表达，以维 持养殖鱼脂肪代谢平衡；
2.草鱼是我国特有的草食性养殖鱼类，但人工饲料喂养草鱼一段时间后，常常发生脂 肪过量蓄积，影响饲料的增肉效果，降低其营养价值。根据本发明提供的三种PPAR激活剂 对鱼体腹腔注射，可调节草鱼体内脂类代谢平衡，在鱼类养殖上为减少脂肪沉积、改善肉品 质提供重要的参考价值，有助于揭示草食性鱼类对营养物的利用及其机制。
图1草鱼PPARa基因cDNA部分序列及推导的氨基酸序列，氨基酸序列用单字母 符号于核苷酸序列下对应表示出来；
图2草鱼PPARii基因cDNA部分序列及推导的氨基酸序列，氨基酸序列用单字母符号 于核苷酸序列下对应表示出来；
图3草鱼PPARy基因cDNA部分序列加3’端序列及推导的氨基酸序列。氨基酸序列 用单字母符号于核苷酸序列下对应表示出来；翻译终止密码子用星号(*)表示出来；下划 线表示PolyA加尾信号；
图4为草鱼肝脏、脑、脾脏、肌肉、脂肪和心脏PPARs基因组成型表达水平，PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1 为 PPAR α/beta-actin mRNA, 2 为 PPAR β/ beta-actin mRNA,3 为 PPARy/beta-actin mRNA ；
图5为三种浓度Clofibrate腹腔注射草鱼24小时后，肝脏PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1 为 PPAR α /beta-actin mRNA, 2 为 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 为 PPARy/beta-actin mRNA ；
图6为三种浓度Clofibrate腹腔注射草鱼24小时后，肠系膜脂肪PPARs/ beta-actinmRNA 比例柱状图；其中，1 为 PPARa /beta-actin mRNA, 2 为 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 为 PPARy/beta-actin mRNA ；
图7为三种浓度Clofibrate腹腔注射草鱼M小时后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1 为 PPAR α /beta-actin mRNA, 2 为 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 为 PPARy/beta-actin mRNA ；
图8为三种浓度2-bromo palmitate腹腔注射草鱼M小时后，肝脏PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1 为 PPARa /beta-actin mRNA，2 为 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 为 PPARy/beta-actin mRNA ；
图9为三种浓度2-bromo palmitate腹腔注射草鱼M小时后，肠系膜脂肪PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1 为 PPAR α/beta-actin mRNA, 2 为 PPAR β/ beta-actin mRNA,3 为 PPARy/beta-actin mRNA ；
图10为三种浓度2-bromo palmitate腹腔注射草鱼M小时后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1 为 PPAR α/beta-actin mRNA, 2 为 PPAR β/ beta-actin mRNA,3 为 PPARy/beta-actin mRNA ；
图11为三种浓度15-deoxy-A12, 14- prostaglandin J2腹腔注射草鱼24小时后， 肝脏 PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1 为 PPARα/beta-actin mRNA，2 为 PPAR^ /beta-actin mRNA,3 为 PPARy/beta-actin mRNA ；
图12为三种浓度15-deoXy-A 12，14- prostaglandin J2腹腔注射草鱼M小时后，肠 系膜脂肪PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1 为PPARα/beta-actin mRNA，2为 PPAR^ /beta-actin mRNA,3 为 PPARy/beta-actin mRNA ；
图13为三种浓度15-deoxy-A12, 14- prostaglandin J2腹腔注射草鱼24小时后， 肌肉 PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1 为 PPAR α /beta-actin mRNA, 2 为 PPAR^ /beta-actin mRNA,3 为 PPARy/beta-actin mRNA ；
图14为PBS和50mg/kg Clofibrate腹腔注射草鱼M小时后，肝脏PPARs/ beta-actin mRNA比例柱状图；其中，1为腹腔注射PBS，2为腹腔注射50mg/kg Clofibrate ；
图15为PBS和50mg/kg Clofibrate腹腔注射草鱼M小时后，肠系膜脂肪 PPARs/ beta-actin mRNA比例柱状图；其中，1为腹腔注射PBS，2为腹腔注射50mg/kg Clofibrate ；
图16为PBS禾口 50mg/kg Clofibrate腹腔注射草鱼24小时后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA比例柱状图；其中，1为腹腔注射PBS，2为腹腔注射50mg/kg Clofibrate ；
图17为PBS和125umol/kg 2-bromo palmitate腹腔注射草鱼M小时后，肝脏PPARs/ beta-actin mRNA比例柱状图；其中，1为腹腔注射PBS，2为腹腔注射125umol/kg 2-bromo palmitate ；
图18为PBS和125umol/kg 2-bromo palmitate腹腔注射草鱼M小时后，肠系膜脂肪 PPARs/ beta-actin mRNA比例柱状图；其中，1为腹腔注射PBS，2为腹腔注射125umol/kg 2-bromo palmitate ；
图19为PBS和125umol/kg 2-bromo palmitate腹腔注射草鱼M小时后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA比例柱状图；其中，1为腹腔注射PBS，2为腹腔注射125umol/kg 2-bromo palmitate；
权利要求
1.一种激活鱼类脂代谢调控基因表达的诱导剂，其特征在于所述诱导剂为氯贝丁酯、 2-溴软脂酸、15-脱氧-Δ 12，14-前列腺素J2中的一种或几种的混合物。
2.权利要求1所述诱导剂的应用，其特征在于所述诱导剂对鱼类进行活体注射或饲料 添加，用于激活鱼类脂代谢调控基因表达。
3.根据权利要求2所述诱导剂的应用，其特征在于所述氯贝丁酯的加入量为25-67 mg/kg鱼体重。
4.根据权利要求3所述诱导剂的应用，其特征在于所述氯贝丁酯的加入量为50mg/kg鱼体重。
5.根据权利要求2所述诱导剂的应用，其特征在于所述2-溴软脂酸的加入量为 35-58mg/kg 鱼体重。
6.根据权利要求5所述诱导剂的应用，其特征在于所述2-溴软脂酸的加入量为42mg/ kg鱼体重。
7.根据权利要求2所述诱导剂的应用，其特征在于所述15-脱氧-Δ12，14-前列腺素 J2的加入量为0. 95-1. 05 mg/kg鱼体重。
8.根据权利要求7所述诱导剂的应用，其特征在于所述2-溴软脂酸的加入量为Img/ kg鱼体重。
9.根据权利要求2所述诱导剂的应用，其特征在于所述激活鱼类脂代谢调控基因为过 氧化物酶体增殖体激活受体基因。
10.根据权利要求2所述诱导剂的应用，其特征在于所述鱼类为草鱼。
全文摘要
本发明公开了一种激活鱼类脂代谢调控基因表达的诱导剂及其应用。本发明诱导剂为氯贝丁酯、2-溴软脂酸、15-脱氧-Δ12,14-前列腺素J2中的一种或几种的混合物。本发明诱导剂可以激活鱼类体细胞脂类代谢调控基因——过氧化物酶体增殖体激活受体基因的表达，因此本发明诱导剂可用于鱼类养殖中，维持鱼类养殖中的营养代谢平衡，减少鱼类脂肪沉积、改善肉品质。
文档编号A61K31/20GK102125544SQ201010593480
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者何珊, 姚煜, 梁旭方, 邹奕, 郁颖, 陈亮, 陈小佳 申请人:暨南大学