专利名称：雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达的调控方法
技术领域：
本发明涉及基因调控方法，具体而言涉及调控雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达的方法。
背景技术：
vasa是动物细胞中特异性表达基因，其编码的蛋白为DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)家族中的一种解旋酶，首先于果蝇中发现。随后在水螅、涡虫、线虫、尼罗罗非鱼、虹鳟、黄鳝、 鲤鱼、斑马鱼、爪蟾、鸡[11]、小鼠和人等物种中克隆获得了同源基因。系统进化分析表明从低等无脊椎动物到高等哺乳动物中vasa均保持高度保守。基因表达分析表明在绝大多数物种中，vasa仅表达于生殖细胞中。已经证明，vasa基因敲除小鼠生殖细胞不能完成减数分裂，精子发生受阻。在雌性果蝇中vasa突变体中卵子有缺陷，即使受精，个体发育后则会缺少生殖细胞。对斑马鱼和果蝇的研究表明，vasa在卵细胞中为母源性基因，在早期胚胎发育中起重要作用。另外，vasa可以和诸如0skar、TudOr以及Maufen等蛋白一起参与生殖质的形成。有研究表明vasa的表达可引起其它基因的表达下降。进一步的研究表明， vasa和翻译因子eIF5B可对翻译过程起调控作用。目前，vasa已经被认为是生殖细胞的特异性标记分子，针对vasa开发的抗体以及GFP载体等分子标记已经运用于多项研究中。vasa最早在果蝇中发现，在脊椎动物中作为生殖细胞高度特异表达基因，是生殖细胞中公认的分子标志。后来的实验证明，在不同动物中vasa均为 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)家族中的一种解旋酶。迄今为止，鱼类中vasa基因已经被广泛克隆，而且在不同物种中有不同结构。在南方鲶中已经发现有两种vasa基因，且有很高的同源性。在尼罗罗非鱼中，也发现了两种 vasa基因片段，这可能是鱼类在多倍化的过程中演化而来。本发明克隆得到的vasa与尼罗罗非鱼两种vasa相似性最高，达到96. 3%和96. 1%，而与其它物种vasa基因的同源性则较低。进化树分析结果与奥利亚罗非鱼的分类学地位相一致。然而在奥利亚罗非鱼中是否也存在着其它形式的vasa基因还有待研究。vasa在脊椎动物中仅仅于生殖细胞中表达，在奥利亚罗非鱼中也得到印证。在 vasa基因敲除小鼠中，精子发生阻滞于第一次减数分裂的偶线期，从而导致精细胞凋亡，最终引起雄性小鼠不育。在鱼类中vasa主要于精原细胞和还未进入减数第一次分裂的精母细胞中，但在未成熟的精子中表达下降，而在成熟精子中则不表达。本文结合原代细胞培养技术，在培养过程中加入不同浓度的LHRH-A后分析原代精巢细胞中vasa mRNA的表达差异。结果显示在LHRH-A刺激后vasa mRNA的表达水平明显降低。在性腺发育调控中，下丘脑-垂体-性腺轴在激素水平扮演者重要角色。在适应的环境刺激下，如温度、光照等，下丘脑分泌&iRH刺激垂体，垂体LH随之表达升高，LH进入血液循环，最终在鱼类性腺成熟以及排卵排精过程中起重要作用。奥禾Ij亚罗非鱼(Oreochromis aurea)属于鲈形目(Perciformes),鲡鱼科 (Cichlidae)，罗非鱼属(Oreochromis)。奥利亚罗非鱼对温度和盐度的耐受能力比尼罗罗非鱼强，因此在越冬保种时较尼罗罗非鱼有优势。在实际生产中，雄性奥利亚罗非鱼主要作为奥尼罗非鱼的杂交亲本在繁殖育种中广泛使用。生产得到的奥尼杂交罗非鱼雄性率很高 (可达95%以上)，不但具有母本尼罗罗非鱼生长速度快的优势，而且还具有父本奥里亚罗非鱼抗逆性强的优势，是我国罗非鱼养殖业养殖的主要品种之一。随着我国大规模罗非鱼尤其是杂交罗非鱼养殖业的发展，必须对其亲本的生殖生理调控进行深入研究，以便指导育种工作。vasa是生殖细胞发育分化的重要基因，对其进行研究不仅能了解其在奥利亚罗非鱼中的作用，而且对今后在奥利亚罗非鱼生殖细胞的定位研究开发分子标记有意义。
发明内容
为了对雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达进行调控，本发明采用如下的技术方案一种雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达进行调控的方法，其特征在于使用 LHRH-A进行调控。在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于对奥利亚罗非鱼精巢进行原代培养，培养时使用LHRH-A处理。在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于LHRH-A的浓度为1(Γ9Μ以上，优选为 10、及其以上。在本发明的一个优选实施方式中，特征在于所述的罗非鱼为奥利亚罗非鱼。本发明另外一方面还涉及一种罗非鱼人工繁殖时进行催产的方法，其特征在于给予一定量的LHRH-A。在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于LHRH-A的浓度为1(Γ9Μ以上，优选为 10、及其以上。在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述的罗非鱼为奥利亚罗非鱼。本发明另外一方面还涉及LHRH-A在调控雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达中的应用。
具体实施例方式奥尼亚罗非鱼精巢细胞原代培养参照文献进行，具体方法如下取3条成体奥尼亚罗非鱼精巢组织约4g剪碎后PBS清洗3次，5min/次。500U/ml胶原酶25°C消化池后， 用M199 (sigma)培养基稀释后种入M孔板，每条鱼的精巢细胞种12孔，一共36孔。每孔中包含Iml M199培养基。5% CO2, 25°C培养过夜。将过夜培养后的细胞分为4组对照组，低浓度LHRH-A (Sigma) (10_12M)处理组、中浓度LHRH-A(KTkiM)处理组和高浓度LHRH-A (10_8M)处理组，每组3孔作为平行孔。分别在各孔中加入相应浓度的LHRH-A进行处理。2小时后收集细胞提取RNA。提取的RNA进行DNase I消化后，以Iyl RNA进行反转录。根据获得的序列设计引物进行实时定量PCR(表1)。将样本cDNA进行5倍稀释，反应体系为SOyLdXSTOR Premix Ex Taq (ABI) 10 μ L，上下游引物各 2 μ L(10 μ mol/L)，稀释后的 cDNA 模板 4 μ L， ddH20 16μ L，95°C IOs预变性，95°C 5s,60°C 34s,40个循环。扩增完成后进行熔解曲线分析以确定反应是否特异。最后以β-actin为内参通过2_“CT计算不同组的相对含量。
用实时定量PCR对不同处理组样品的vasa mRNA进行检测。结果显示，对照组vasa 表达量最高(P < 0. 05)，设对照组表达量为1。LHRH-A 10_1组表达量最低为0.四士0. 097， (P < 0. 05)。LHRH-A(KTiqM)和 LHRH-A(KT12M)组表达量居中，分别为 0. 43士0. 213 和 0. 39 士 0. 106，但这两组之间无显著性差异(P > 0. 05)。实验结果显示LHRH-A对精巢细胞的vasa表达起抑制作用。提示在奥利亚罗非鱼生殖细胞最终成熟时，垂体中LH分泌上调，从而抑制了 vasa的表达。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达量进行调控的方法，其特征在于使用 LHRH-A进行调控。
2.根据权利要求1所述的调控方法，其特征在于对奥利亚罗非鱼精巢进行原代培养， 培养时使用LHRH-A处理。
3.根据权利要求1所述的调控方法，其特征在于LHRH-A的浓度为KT9M以上，优选为 10、及其以上。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的调控方法，其特征在于所述的罗非鱼为奥利亚罗非鱼。
5.一种罗非鱼人工繁殖时进行催产的方法，其特征在于给予一定量的LHRH-A。
6.根据权利要求6所述的催产方法，其特征在于LHRH-A的浓度为1(Γ9Μ以上，优选为 10、及其以上。
7.根据权利要求5或6所述的催产方法，其特征在于所述的罗非鱼为奥利亚罗非鱼。
8.LHRH-A在调控雄性罗非鱼精巢细胞vasa基因表达中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种LHRH-A对雄性奥利亚罗非鱼精巢细胞vasa基因进行调控的方法，通过适宜浓度的LHRH-A调控vasa基因的表达，能够实现在人工繁殖时达到催产的目的。
文档编号C12N15/63GK102286507SQ201110165008
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者严欣, 余高云, 张明, 曹谨玲, 杨丽, 杨军, 杨弘, 王玉, 甘西, 罗永巨, 肖俊, 郭忠宝, 郭恩彦, 陈丽兵 申请人:广西壮族自治区水产研究所