一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种启动子，尤其涉及一种一种利用分子生物学手段获得的在植物非 分泌型腺毛中特异表达的萜类合成酶基因启动子（ProFDSl)及其在转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002] 青蒿（ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发 性香气，其植株中含有许多次级代谢产物：青蒿素、挥发油、a-蒎烯、樟脑、青蒿酮等，此 外还含有黄酮类化合物。青蒿素（Artemisinin)是从其地上部分分离出的一种含有过 氧桥结构的倍半萜内酯化合物，作为世界卫生组织（WHO)推荐的抗疟疾药物联合治疗 (Artemisinin-basedcombinationtherapies，ACTs)的主要有效成分。目前青蒿素的主 要来源是从青蒿的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低（0. 01 % -1 % )，这使得 这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。
[0003] 青蒿的叶片表面有两种腺毛：分泌型腺毛（glandularsecretorytrichome，GST) 和非分泌型腺毛（Tshapetrichome，TST)，两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传 播等都起到至关重要的作用。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调 控下游基因的表达，启动子就像一个"开关"，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作 用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动 子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子 (CaMV35S)，这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内 的物质和能量，并且不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生 长造成一定的负担和危害。因此急需找到在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替 组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。由于腺毛特异表达的启动子对于 植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子 的种种弊端。因此，本发明致力提供一种克隆到植物腺毛组织特异表达的启动子。
【发明内容】
[0004] 有鉴于现有技术的上述缺陷，同时为深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其 中的次级代谢产物的代谢调控。本发明提供一种在植物非分泌型腺毛中特异表达的启动 子，能引导基因在转基因植物非分泌型腺毛中特异表达。所述启动子为萜类合成酶基因启 动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0005] 进一步地，所述启动子为诱导型启动子。
[0006] 本发明还提供一种如上所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，可应用 在在植物生产代谢产物的基因工程育种中。
[0007] 进一步地，所述启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在 植物非分泌型腺毛中特异表达。
[0008] 本发明还提供一种载体连接有如上述所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的 启动子。
[0009] 本发明还提供一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，包括以 下步骤：
[0010] 步骤一、培养青蒿无菌苗；
[0011] 步骤二、克隆调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子基因组序列；
[0012] 步骤三、分析调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确 定所述启动子类型；
[0013] 步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入PCAMBIA1391Z载体中；
[0014] 步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；
[0015] 步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；
[0016] 步骤七、PCR检测转基因植株；
[0017] 步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。
[0018] 进一步地，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增非分泌 型腺毛特异启动子序列。
[0019] 进一步地，所述步骤三中调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺 式作用元件包括：TATA box、CAAT box、G_box、AE-box、ARE、GA-motif、GAREnotif和GATA-motif〇
[0020] 启动子序列中调控元件见下表I:
[0021] 表1启动子序列中调控元件分析
[0022]
[0023] 进一步地，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入PstI酶切 位点，反向引物中引入EcoRI酶切位点，引物序列如下所示：
[0024] 1391z-proFDSI-F ：AACTGCAGTGACGGGCAGATTGACGAT
[0025] 1391 z-proFDS I-R：CGGAATTCGCATGCCATTTACAACAGATT
[0026] 进一步地，所述步骤六具体包括：
[0027] 1)外植体的预培养；
[0028] 2)农杆菌与外植体的共培养；
[0029] 3)抗性再生植株的筛选。
[0030]与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用有效的青蒿表皮毛组织特异 性启动子代替组成型启动子可以用于构建在分子生物学中在青蒿非分泌型腺毛特异表达 目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基 因的定向操作已获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用 植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。
【附图说明】
[0031] 图1是本发明的一个实施例的AaFDSl基因启动子序列及其顺式作用元件；
[0032] 图2为转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；
[0033] 图3是为利用AaFDSl基因启动子与⑶S基因融合的载体pCAMBIA1391z-proFDSl 通过农杆菌介导稳定转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中GUS组织染色图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实例对本发明进行详尽说明，以下实例将有助于本领域的技术人员 进一步理解本发明而不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。
[0035] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验室手册见New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0036] 本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄； 根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008, 28(3) :38-43》文 献中公开。根癌农杆菌EHA105,质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可 以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambarl。
[0037] 实施例
[0038] 本实施例涉及AaPDSl基因启动子的获得，具体包括如下步骤：
[0039] 步骤一、培养青蒿无菌苗
[0040] 青蒿种子用体积分数为75 %的乙醇浸泡lmin，再用20 % (w/v)的NaClO浸泡 20min后，无菌水冲洗3次~4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培 养基上，25°C、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；
[0041] 步骤二、基因组DNA中启动子序列的克隆
[0042]1、基因组DNA的提取
[0043] 在1.5mL离心管中放一片青蒿叶片（Icm2左右大小，用冰盒盛取），加入2粒钢 珠。加入300yLTPSbuffer(通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇），55-60Hz，震荡90秒。 再加入300yLTPSbuffer(通风橱）。65°C水浴Ih(每隔20min摇一摇），可适当延长时 间，最长1.5h。冷却至室温，4°C10000rpm离心15min。取300yL-400yL上清液。加入 300yL-400yL异丙醇（异丙醇在-20°C预冷）。混合后在-20°C冰箱中放置10-15min(可 延长至Ih)。取出4°C离心12000rpm，吸去上清，在通风橱中倒置l〇-15min。加入75%乙醇 500-600yL，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放 在37°C中烘干，直到沉淀变为透明。加入50IiLddH2O回溶，4°C保存。
[0044] 2、PCR扩增
[0045] 以基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子序列。为了提高 产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，根据本实验室基因组测序得到的AaFDSl基因的启 动子序列设计巢式PCR引物如表2所示，首轮PCR反应体系如表3所示。PCR条件为：95°C 预变性5min;94°C变性30s;50°C退火30s;72°C延伸2min，35个循环；72°C延伸lOmin。在 I%的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。
[0046] 表2巢式PCR引物设计
[0050] 将首