Uch677蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种UCH677蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。该应用为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物如下1)-10)中至少一种的生长发育中的应用：1)种子重量；2)种子体积；3)种子粒长；4)种子粒宽；5)种子粒厚；6)单穗种子数；7)植株株高；8)植株叶长；9)植株叶宽；10)植株穗长。实验证明，在水稻的发育过程中，将水稻中UCH677蛋白表达水平上调，可导致水稻种子表现出如下表型：比野生型水稻种子相比，种子重量增加、体积增大，同时单穗种子数增多；另外，从植株表型上来说，与野生型相比，过表达植株的株高更高。本发明为找出更简单的创制作物高产性状的思路和方法奠定了基础。
【专利说明】UCH677蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物分子生物学【技术领域】，涉及一种UCH677蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。
【背景技术】
[0002]从上世纪70年代以来，杂种优势利用为我国水稻生产做出了重大的贡献。面临我国经济发展对农业生产所提出“高产、优质、高效、安全、生态”的新的重大需求，能否进一步发掘杂种优势的应用潜力以应对，就成为摆在当代科学家面前的一个严峻挑战。
[0003]杂种优势的形成基于两个不同亲本的组合。要在现有应用的基础上进一步发掘其潜力，除了需要加强杂种优势形成机制的研究之外，还急需建立有效的方法来创造雄性不育性状，以便有效扩大杂交组合的筛选和优秀组合在生产上的应用。
[0004]目前，在育种工作和生产上广泛应用的雄性不育性状多来自于自然突变及其性状转育株系。雄性不育性状的来源十分有限，是扩大杂交组合筛选特别是应用的严重制约因子。按照目前国际通行的规则，所有具有应用潜力的创新都受到知识产权保护。因此，寻找新的、具有自主知识产权的创制人工控制作物种子大小及产量的思路和方法，已经成为希望把握发掘杂种优势应用潜力主动权的国家和地区所面临的无法回避、亟待解决的关键问题之一。
[0005]长期以来， 人们一直利用常规育种的方法选育杂交作物，这些方法周期长、见效慢，不能满足生产发展的迫切需要。基因工程方法相比传统方法具有一些特点:选育周期缩短，育性相对稳定，受环境影响小，对基因型依赖少，环境污染少。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种UCH677蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。
[0007]本发明所提供的应用，具体为由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质(命名为UCH677蛋白)或其编码基因(命名为UCH677基因)在调控植物如下1)-10)中至少一种中应用:
[0008]I)种子重量；
[0009]2)种子体积；
[0010]3)种子粒长；
[0011]4)种子粒宽；
[0012]5)种子粒厚；
[0013]6)单穗种子数；
[0014]7)植株株高；
[0015]8)植株叶长；
[0016]9)植株叶宽；[0017]10)植株穗长。
[0018]上述应用具体体现在:所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的UCH677蛋白在所述植物中的表达量越高，所述植物的种子重量越重、和/或种子体积越大、和/或种子粒长越长、和/或种子粒宽越宽、和/或种子粒厚越厚、和/或单穗种子数越多、和/或植株株闻越闻、和/或植株叶长越长、和/或植株叶宽越宽、和/或植株穗长越长；所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的UCH677蛋白在所述植物中的表达量越低，所述植物的种子重量越轻、和/或种子体积越小、和/或种子粒长越短、和/或种子粒宽越窄、和/或种子粒厚越薄、和/或单穗种子数越少、和/或植株株高越矮、和/或植株叶长越短、和/或植株叶宽越窄、和/或植株穗长越短。
[0019]由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的(UCH677蛋白)或其编码基因(UCH677基因)在选育具有如下I)-X)目的性状中至少一种的植物品种中的应用也属于本发明的保护范围:
[0020]I)种子重量增加或减少；
[0021]II)种子体积增大或减小；
[0022]III)种子粒长增长或减短；
[0023]IV)种子粒宽增宽或变窄；
[0024]V)种子粒厚增厚或变薄；
[0025]VI)单穗种子数增加或减少；
[0026]VII)植株株高增高或变矮；
[0027]VIII)植株叶长增长或减短；
[0028]IX)植株叶宽增宽或变窄；
[0029]X)植株穗长增长或减短。
[0030]在实际应用中，当所选育的植物品种为种子重量增加、和/或种子体积增大、和/或种子粒长增长、和/或种子粒宽增宽、和/或种子粒厚增厚、和/或单穗种子数增加、和/或)植株株高增高、和/或植株叶长增长、和/或植株叶宽增宽、和/或植株穗长增长的植物品种时，需将所述UCH677蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交。当所选育的植物品种为种子重量减少、和/或种子体积减小、和/或种子粒长减短、和/或种子粒宽变窄、和/或种子粒厚变薄、和/或单穗种子数减少、和/或植株株高变矮、和/或植株叶长减短、和/或植株叶宽变窄、和/或植株穗长减短的植物品种时，需将所述UCH677蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交。
[0031]本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0032]本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为如下(A)或⑶:
[0033](A)培育具有如下bl)_bl0)目的性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下步骤:
[0034]a)向目的植物中导入由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
[0035]b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下bl)_blO)目的性状中至少一种的转基因植物:
[0036]bl)种子重量增加；[0037]b2)种子体积增大；
[0038]b3)种子粒长增长；
[0039]b4)种子粒宽增宽；
[0040]b5)种子粒厚增厚；
[0041]b6)单穗种子数增加；
[0042]b7)植株株高增高；
[0043]b8)植株叶长增长；
[0044]b9)植株叶宽增宽；
[0045]blO)植株穗长增长；
[0046](B)培育具有如下dl)-dl0)目的性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下步骤:
[0047]c)在目的植物中对由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；
[0048]d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下dl)-dl0)目的性状中至少一种的转基因植物:
[0049]dl)种子重量减少；
[0050]d2)种子体积减小；
[0051]d3)种子粒长减短；
[0052]d4)种子粒宽变窄；
[0053]d5)种子粒厚变薄；
[0054]d6)单穗种子数减少；
[0055]d7)植株株高变矮；
[0056]d8)植株叶长减短；
[0057]d9)植株叶宽变窄；
[0058]dlO)植株穗长减短。
[0059]在上述应用或方法中，所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质(UCH677蛋白)的编码基因(UCH677基因)是如下(I)至(3)中任一所述的DNA分子:
[0060](I)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0061](2)在严格条件下与(I)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0062](3)与⑴或⑵所限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0063]上述严格条件可为用6XSSC，0.5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC，
0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。
[0064] 其中，序列2由534个核苷酸组成，为所述UCH677基因的编码序列(ORF);序列2编码序列表中序列I所示的蛋白质，序列I由177个氨基酸残基组成。
[0065]在上述方法(A)中，所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因具体是通过重组表达载体的形式导入所述目的植物中的。
[0066]所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(PUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0067]在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述UCH677基因基因转录的启动子具体为Actin启动子。
[0068]更为具体的，所述重组表达载体为将所述UCH677基因基因插入到pCAM23A载体的多克隆位点后得到的重组质粒；在本发明的一个实施例中，所述多克隆位点具体为Xba I和Sal I。
[0069]在上述方法⑶中，所述在目的植物中对所述UCH677蛋白的编码基因进行抑制表达，可为任何可降低 所述目的植物中所述UCH677基因的表达的方法。
[0070]在上述培育转基因植物的方法㈧和方法⑶中，将携带有所述UCH677基因的所述重组表达载体或所述UCH677基因的所述RNA干扰表达载体导入所述目的植物，具体可为:通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0071]在上述各应用或各方法中，所述植物即可为单子叶植物，也可为双子叶植物。在本发明中，所述植物具体为单子叶植物水稻，如水稻品种中花11。
[0072]在上述各应用或各方法中，所述叶长和所述叶宽均具体为旗叶的叶长和叶宽。
[0073]实验证明，在水稻的发育过程中，本发明通过基因过表达技术，将水稻中UCH677蛋白及其编码基因表达水平上调，可导致水稻种子表现出如下表型:比野生型水稻种子相t匕，种子重量增加、体积增大(粒长、宽、厚均增加)，同时单穗种子数增多；另外，从植株表型上来说,与野生型相比,过表达植株的株高更高、叶长、叶宽和穗长均增加。本发明为找出更简单的创制作物高产性状的思路和方法奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0074]图1为T1代转入过量表达载体pCAM23A_UCH677ox的转基因水稻的PCR鉴定结果。其中，泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000，3000，2000，1000，750，500，300，200bp ;泳道1-7为鉴定阳性的植株，8为未转基因的野生型水稻中花11。[0075]图2为T1代转入重组表达载体pCAM23A-UCH677ox的转基因水稻中UCH677基因的实时荧光定量PCR检测。其中，WT表示未转基因的野生型水稻中花11 ;677ox表示1\代转入重组表达载体pCAM23A-UCH677ox的转基因水稻。以未转基因的野生型水稻中花11中UCH677基因的表达量为I。*表示与WT相比差异显著(P〈0.05)。
[0076]图3为UCH677基因各遗传材料水稻植株表型。其中，WT表示为未转基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示鉴定阳性的T1代转入过量表达载体PCAM23A-UCH6770X的转基因水稻植株。
[0077]图4为UCH677基因各遗传材料水稻植株的株高、旗叶的叶长和叶宽的统计结果。其中，A为株高；B和C分别为旗叶的叶长和叶宽。A-C中，WT表示未转基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代转入重组表达载体pCAM23A-UCH677ox的转基因水稻，*表示与WT相比差异显著(P〈0.05)。
[0078]图5为UCH677基因各遗传材料水稻稻穗表型。其中，WT表示未转基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代转入过量表达载体PCAM23A-UCH6770X的转基因水稻植株。
[0079]图6为UCH677基因各遗传材料水稻单穗种子数。其中，ZHll表示未转基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代转入过量表达载体PCAM23A-UCH6770X的转基因水稻植株，*表示与ZHll相比差异显著(P〈0.05)。
[0080]图7为UCH677基因各遗传材料水稻籽粒表型。其中，WT表示未转基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代转入过量表达载体PCAM23A-UCH6770X的转基因水稻植株。
[0081]图8为UCH677基因各遗传材料水稻籽粒的粒长、粒厚和粒宽的统计结果。其中，A、B和C分别为粒长、 粒宽和粒厚。A-C中，WT表示未转基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代转入重组表达载体pCAM23A-UCH677ox的转基因水稻，*表示与WT相比差异显著(Ρ〈0.05)。
[0082]图9为UCH677基因各遗传材料水稻种子的千粒重。其中，ZHll表示未转基因的野生型水稻中花11 ；677οχ表示T1代转入过量表达载体PCAM23A-UCH6770X的转基因水稻植株，*表示与ZHll相比差异显著(P〈0.05)。
[0083]图10为UCH677基因各遗传材料水稻种子的结实率。其中，ZHlI表示未转基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代转入过量表达载体PCAM23A-UCH6770X的转基因水稻植株。
【具体实施方式】
[0084]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0085]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0086]PCAM23A载体:北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。记载于“池正昌.水稻减数分裂基因OsSGOl功能研究与分析.扬州大学，2010年，硕士论文”一文中。pCAM23A载体上自带的位于Xba I上游的启动子是Actin启动子。
[0087]水稻品种中花11号:购自于中国农业科学院作物研究所；由中国农科院作物所1979年用京风五号/特特普/福锦进行花培。记载于“倪丕冲.水稻花培新品种一中花11号.作物品种资源，1989年04期”。
[0088]农杆菌EHA105:北京全式金生物工程有限公司。[0089]下述实施例中获得转基因植物的过程中所涉及的培养基如下: [0090]1、水稻愈伤诱导及继代培养基(粳稻)NB基本培养基
[0091]
【权利要求】
1.由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物生长发育中的应用； 所述植物生长发育，具体体现在如下1)-10)中至少一种: 1)种子重量； 2)种子体积； 3)种子粒长； 4)种子粒宽； 5)种子粒厚； 6)单穗种子数； 7)植株株高； 8)植株叶长； 9)植株叶宽； 10)植株穗长。
2.由序列表中序列I所不的氣基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在选育具有如下D-X)目的性状中至少一种的植物品种中的应用: I)种子重量增加或减少； 11)种子体积增大或减小； III)种子粒长增长或减短； IV)种子粒宽增宽或变窄； V)种子粒厚增厚或变薄； VI)单穗种子数增加或减少； VII)植株株高增高或变矮； VIII)植株叶长增长或减短； IX)植株叶宽增宽或变窄； X)植株穗长增长或减短。
3.培育转基因植物的方法，为如下⑷或⑶:(A)培育具有如下bl)-bl0)目的性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下步骤: a)向目的植物中导入由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物； b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下bl)_blO)目的性状中至少一种的转基因植物: bl)种子重量增加； b2)种子体积增大； b3)种子粒长增长； b4)种子粒宽增宽； b5)种子粒厚增厚； b6)单穗种子数增加； b7)植株株高增高；b8)植株叶长增长； b9)植株叶宽增宽； blO)植株穗长增长； (B)培育具有如下dl)-dlO)目的性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下步骤: c)在目的植物中对由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物； d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下dl)-dlO)目的性状中至少一种的转基因植物: dl)种子重量减少； d2)种子体积减小； d3)种子粒长减短； d4)种子粒宽变窄； d5)种子粒厚变薄； d6)单穗种子数减少； d7)植株株高变矮； d8)植株叶长减短； d9)植株叶宽变窄； dlO)植株穗长减短。
4.根据权利要求1- 3中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下(I)至(3)中任一所述的DNA分子: (1)序列表中序列2所不的DNA分子； (2)在严格条件下与⑴所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子； (3)与(I)或⑵所限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述(A)中，所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过重组表达载体的形式导入所述目的植物中的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述重组表达载体中，启动所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因转录的启动子为Actin启动子。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.根据权利要求7所述的应用或方法，其特征在于:所述单子叶植物为水稻。
【文档编号】C07K14/415GK104004074SQ201410228344
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】王东辉, 白书农, 许智宏 申请人:北京大学