一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的myl3基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，提供了一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因cDNA序列的克隆方法，该基因的cDNA序列如SEQIDNO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。应用该基因可以通过对其表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础，具有重要的现实意义。
【专利说明】-种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种可以调控小尾寒羊骨骼 肌生长的MYL3基因及其在绵羊育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 肌球蛋白轻链3(MYL3)为肌球蛋白轻链家族中的一员，是一种基本性轻链，对肌 球蛋白构型的维系起主要作用，主要在骨骼肌快肌中表达。研究发现该基因在斑马鱼的骨 骼肌卫星细胞分化为快肌纤维的早期阶段表达，并且发现在增殖速度较慢的成肌细胞中高 表达，因而认为该基因可能具有抑制成肌细胞增殖而促进肌细胞的分化的功能。目前，在绵 羊基因组中可见MYL3基因的预测序列，还未见到该基因的确切序列报道，并且关于该基因 对肌肉生长和发育的调控机制还不清楚。
【发明内容】
[0003] 基于上述的原因，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因， 其cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，除poly (A)外长为925bp ;该序列中的开放读码框编码 199个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用 该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基 础，具有重要的现实意义。
[0004] 本发明所提供的调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因，其CDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，除poly(A)外长为925bp ;该序列中的开放读码框编码199个氨基酸，氨基酸序 列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 上述的MYL3基因是通过如下方法获得的：
[0006] (1)小尾寒羊肌肉总RNA的提取和反转录：
[0007] 采用TRIzoI法提取小尾寒羊肌肉组织总RNA，提取的RNA以 Agilent2100Bioanalyzer进行检测，要求总RNA含量在IOyg以上且RIN(RNA完整性指 标）> 7. 5,并根据现有技术经Roche公司的cDNA反转录试剂盒反转录合成cDNA第一链； [0008] (2)MYL3基因 cDNA序列保守区的扩增：
[0009] 比对已有物种MYL3基因的cDNA序列，根据保守区设计上下游引物，以步骤⑴中 的cDNA第一链为模板进行PCR扩增克隆测序得到保守区序列；
[0010] ⑶应用3'降落巢式PCR法对MYL3基因 cDNA序列的3'端进行扩增：
[0011] 根据所得保守区序列设计MYL3基因的3'特异内侧和外侧引物；
[0012] 以3'特异外侧引物和3'通用外侧引物采用退火温度逐渐降落法对上述cDNA第 一链进行第一轮PCR扩增；
[0013] 然后以3'特异内侧引物和3'通用内侧引物采用同样的退火温度逐渐降落法对 第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增；
[0014] 对第二轮PCR产物经克隆测序得到MYL3基因 cDNA序列的：V端序列；
[0015] (4)应用Y RACE法对MYL3基因 cDNA序列的5'端进行扩增：
[0016] 对小尾寒羊肌肉组织经TRIzoI法所提总RNA依次进行常规的去磷酸化处理、"去 帽子"反应、与接头序列连接并以TaKaRa公司的Y -Full RACE Kit With TAP试剂盒反 转录合成cDNA的第一链；
[0017] 根据所得保守区序列设计MYL3基因的5'特异外侧和特异内侧引物；
[0018] 以5'特异外侧和5'通用外侧引物进行第一轮PCR扩增；
[0019] 以Y特异内侧和Y通用内侧引物进行第二轮PCR扩增；
[0020] 内侧PCR产物经克隆测序得到MYL3基因 cDNA序列的Y端序列；
[0021] (5)全长序列拼接及克隆测序验证：
[0022] 根据重叠区域对上述步骤获得的cDNA的保守区、5'和3'所得序列进行拼接，获 得MYL3基因的全长cDNA序列；设计两端序列为上下游引物，PCR扩增并克隆测序得到MYL3 基因的全长cDNA序列，具有如SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
[0023] 对该cDNA序列进行生物信息学分析，得到该基因编码产生含有199个氨基酸的蛋 白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0024] 之后发明人利用qRT-PCR法测定MYL3基因在小尾寒羊心、肝、肌肉等组织中的表 达量，发现该基因主要在小尾寒羊的心肌和背最长肌中表达，表明该基因具有调控骨骼肌 生长的功能。
[0025] 综上所述，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因，该基因 具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现 培育生长速度快的绵羊品种奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为本发明中小尾寒羊MYL3基因 cDNA保守区扩增图，
[0027] 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL3基因 cDNA保守区序列；
[0028] 图2为本发明中小尾寒羊MYL3基因3'端扩增图，
[0029] 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL3基因 cDNA的3'端序列；
[0030] 图3为本发明中小尾寒羊MYL3基因 Y RACE扩增图，
[0031] 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL3基因 cDNA的5'端序列；
[0032] 图4为本发明中小尾寒羊MYL3基因 cDNA全长序列扩增图，
[0033] 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL3的全长cDNA序列；
[0034] 图5为本发明中MYL3在小尾寒羊不同组织中的表达水平柱状图，
[0035] 图中a、b、c表示小尾寒羊各组织间的差异显著性（p〈0. 05) ;MYL3主要在心肌和 背最长肌中表达。
【具体实施方式】
[0036] 以下结合附图对本发明的上述
【发明内容】
作进一步的详细描述。应理解，这些实施 例仅为了说明本发明而不是为了限制本发明的保护范围。
[0037] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的实验条 件或常规方法，如Sambrook等编著的分子克隆实验手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件。
[0038] 实施例I :小尾寒羊背最长肌组织总RNA的提取及反转录
[0039] 取小尾寒羊背最长肌约20g，使用康为世纪公司的总RNA提取试剂盒（No. CW0580)提取肌肉组织的总RNA ;将提取的RNA采用Roche公司的cDNA反转录试剂盒 (No. 05081955001)反转录合成cDNA第一链，-20°C保存备用。
[0040] 实施例2 :cDNA保守区序列的克隆与测序
[0041] (1)引物的设计：从NCBI上下载人、猪、牛、鼠等各物种MYL3基因的cDNA序 列，以DNAMAN6. 0软件进行比对获得保守区序列，设计该基因 cDNA的保守区引物为：Fl : GGAGGCTCACCTACCCTG，如 SEQ ID NO. 3 所示，和 F2 :GCCATGATGTGCTTGACAAATGC，如 SEQ ID NO. 4所示；
[0042] (2) PCR扩增：以实施例1获得的cDNA第一链为模板，采用TIANGEN的PCR MasterMix试剂盒（KT201)进行PCR扩增；50μ 1扩增体系中包含：PCR MasterMix25y 1 ; Fl(10X)2y I ;F2(10X)2y I ;cDNA 第一链 2μ 1。扩增条件为：94°C，5min ;(94°C 30s， 58°C 30s，72°C lmin)35cycles ;72°C，10min。扩增结果见附图 I ;
[0043] (3)扩增条带的回收：PCR扩增产物经I %琼脂糖的TAE凝胶进行电泳凝，切取相 应条带；采用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒（#0691)对PCR产物进行纯化回收；
[0044] (4)回收产物与载体连接：载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8 ;根据扩增产物回 收后凝胶电泳情况将回收产物稀释至标准浓度，依PMD18-T载体试剂盒说明书（No. 6011) 进行连接反应。
[0045] (5)连接产物的转化：取适量连接产物，依TIANGEN公司的大肠杆菌感受态细胞 DH5a (CB101)使用说明进行转化及细菌的培养操作；
[0046] (6)菌液PCR鉴定：吸取1?2 μ 1菌液作模板，依据⑵中PCR扩增体系和条件 进行扩增，1 %琼脂糖凝胶电泳检测目的条带；
[0047] (7)克隆产物的测序分析：如果凝胶检测含有目的条带且较纯，则吸取Iml菌液测 序分析，得到长为658bp的一条保守区目标序列。
[0048] 实施例3 :cDNA3'端序列的克隆与测序
[0049] 采用降落巢式PCR法克隆cDNA序列的3'端，具体步骤如下：
[0050] (1)引物的设计与合成：根据实施例2所得MYL3基因 cDNA保守区的测序 结果，设计两条上游嵌套式引物，3 ^ GSP :GGACACCGGCACCTATGAGGAC，如SEQ ID NO. 5 所示，和 V NGSP :GAGAAGCTGATGGCGGGGCAAG，如 SEQ ID NO. 6 所示；并合成两条下 游 3 '通用引物，3 ' -UP :GACTCGAGTCGATCGA，如 SEQ ID NO. 7 所示，和 OligodT-AP : GACTCGAGTCGATCGA(T)18jnSEQIDN0.8K*。
[0051] ⑵反转录合成cDNA第一链：取IOOpg?1μ g实施例1中提取的RNA，加入 OligodT-AP为反转录引物反转录合成cDNA第一链；
[0052] (3)夕卜侧PCR扩增：以3 ' GSP和OligodT-AP为上下游引物，依实施例2中PCR 反应试剂盒体系进行，扩增程序为：98°C，30s ;(98°C，10s ;70°C，30s ;72°C，30s)3cycles ; (98 °C,l〇s ；68 〇C,30s；72 °C, 30s)4cycles ； (98 °C,l〇s ；66 〇C,30s；72 °C, 30s) 5cycles ； (98 °C, 10s ；64 °C, 30s ；72 °C, 30s) 6cycles ； (98 °C, 10s ；62 °C, 30s ；72 °C, 30s) 8cycles ； (98〇C, 10s ；60°C, 30s ；72〇C, 30s) IOcycles ；72〇C, IOmin ；4°C ；
[0053] (4)内侧PCR扩增：以3' NGSP和3' -UP为上下游引物，步骤（3)的扩增产物稀 释30倍为模板，依上述步骤（3)中反应条件和扩增程序进行目的条带的扩增，扩增结果见 附图2;
[0054] (5)PCR产物的克隆测序：扩增条带的回收、与载体连接、连接产物的转化及测序 同实施例2,得到长为341bp的一条序列。
[0055] 实施例4 :cDNA 5'端序列的克隆与测序
[0056] 采用5' RACE法克隆5'端序列，步骤如下：
[0057] (1)引物的设计与合成：根据实施例3所得MYL3基因 cDNA保守区的测序结果， 设计两条下游嵌套式引物，5 ' GSP :GTTCTTGGAGATGTGCTGGA，如SEQ ID NO. 9所示，和 5' NGSP:CGTGATCTTCATCTCGCACTTG，如 SEQ ID NO. 10 所示；并合成两条上游 Y 通用引 *，5,-0uterPrimer:CATGGCTACATGCTGACAGCCTAjnSEQIDN0.1lK*jP5，-Inner Primer :CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如 SEQ ID NO. 12 所示。
[0058] (2)mRNA的去磷酸化处理 [0059] ①配制去磷酸反应液：
【权利要求】
1. 一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL3基因，其特征在于：具有如SEQ ID NO. 1所示 的cDNA序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 根据权利要求1所述的MYL3基因，其特征在于：其来源于小尾寒羊骨骼肌的肌球蛋 白轻链3。
3. 权利要求1所述的调控骨骼肌生长的MYL3基因，在绵羊育种中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：通过对MYL3基因的调控实现培育生长速 度快的绵羊育种。
【文档编号】C07K14/47GK104212811SQ201410472965
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】王建民, 张春兰, 刘冠卿, 纪志宾, 秦孜娟, 王桂芝 申请人:山东农业大学