获自功能型苹果的黄烷醇调控蛋白MsMYB6L及其编码基因和应用
【专利摘要】本发明公开了一种获自功能型苹果的黄烷醇调控蛋白MsMYB6L及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，获自苹果，命名为MsMYB6L蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物黄烷醇类化合物含量相关的由序列1衍生的蛋白质。编码所述MsMYB6L蛋白的基因(MsMYB6L基因)也属于本发明的保护范围。本发明发现了MsMYB6L蛋白及其功能，可用于培育黄烷醇类化合物含量改变的转基因植物，在植物育种中具有重大应用前景。
【专利说明】
获自功能型苹果的黄烷醇调控蛋白MsMYB6L及其编码基因和 应用
技术领域
[00011本发明涉及一种获自功能型苹果的黄烷醇调控蛋白MsMYB6L及其编码基因和应 用。
【背景技术】
[0002] "医食同源"是发展方向。苹果耐贮性好，供应周期长，是世界性果品，尤其果实含 有较高比例的、人体比较容易吸收的游离多酚，具有很好的抗氧化、抗肿瘤、预防心脑血管 疾病及保肝等作用，营养保健价值高，有"一天一苹果，医生远离我"（An apple a day keeps the doctor away!)的美誉，世界上相当多的国家都将其列为主要消费果品而大力 推荐。但近几年的调研结果表明，一方面，在过去几十年国内外育成的1000多个苹果品种， 80%是'金帅'等品种的杂交、实生或芽选后代，这种"近亲繁殖"往往带来品种的遗传基础 狭窄及抗逆性减退等问题;另一方面，特色、多抗和多样性果品成为产业发展的重要方向。 [0003] 新疆野苹果及其红肉变型（Malus sieversii f.neidzwetzkyana)是世界栽培苹 果的祖先种，不仅遗传多样性极为丰富，而且富含类黄酮等功能、保健成分，是进行抗逆与 品质育种的珍贵基因库。但因农田开垦等原因，新疆野苹果的遗传多样性正遭到严重破坏， 濒临灭绝;我国是世界上最大的苹果生产和消费国，其中2012年生产苹果3950万吨，主要用 于鲜食，且近70 %是类黄酮含量较低的富士品种。
[0004] 因此，围绕"新疆野苹果资源的科学保护与持续高效利用、栽培品种遗传基础拓 展、苹果产业转型升级与共给侧结构改革和农民持续增收以及人类健康水平提升"，进行联 合攻关与集成示范，本发明的发明人与美国康奈尔大学的教授合作，对新疆野苹果及欧洲 森林苹果等世界范围内的97份苹果资源进行了基因组重测序与生物信息学分析，构建了新 疆红肉苹果与苹果品种杂种一代及回交一、二代分离群体，研究明确了新疆野苹果群体遗 传结构与遗传多样性特征、核心种质构建的技术参数、类黄酮含量等性状的遗传变异特点 及发育机理，提出了"功能型苹果"的概念及"宽行高干、行间生草、给草施肥、肥田养根"的 现代果园管理理念，创建了常规杂交与生物技术有机结合的苹果高效育种技术体系，创制 了一批新品种及优异种质，研发了苹果新品种配套高效栽培技术体系。目前，已授权和申报 发明专利10余项，定植杂种实生苗4万余株，育成新品种（系）16个;发表相关研究论文120 篇，其中SCI论文20余篇，这些研究成果总体处在国际同类研究的领先水平。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种获自功能型苹果的黄烷醇调控蛋白MsMYB6L及其编码基 因和应用。
[0006] 本发明提供的蛋白质，获自苹果，命名为MSMYB6L蛋白，是如下(al)或(a2):
[0007] (al)由序列表中序列1所不的氣基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与植物黄烷醇类化合物含量相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0009] 为了使(a)中的MSMYB6L蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基 酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0010] 表1标签的序列
[0012] 上述(b)中的MSMYB6L蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。上述(b)中的MsMYB6L蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5' 端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0013] 编码所述MsMYB6L蛋白的基因(MsMYB6L基因）也属于本发明的保护范围。
[0014]所述基因为如下（1)或(2)或(3):
[0015] ⑴编码区序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016] (2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码与植物黄烷醇类化合物含量相 关的蛋白质的DNA分子；
[0017] (3)与（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与植物黄烷醇类化合物含量 相关的蛋白质的DNA分子。
[0018] 上述严格条件可为用0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)，0.1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA杂 交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0019] 含有所述MSMYB6L基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本 发明的保护范围。
[0020] 可用现有的植物表达载体构建含有MSMYB6L基因的重组表达载体。所述植物表达 载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用MsMYB6L基因构建重组表 达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启 动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用MsMYB6L基因构建重组 表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列 的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合 成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植 物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变 化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转 基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。所述重组 表达载体的出发载体可为pRI 101载体。所述重组表达载体具体可为在pRI 101载体的Nde I 和EcoR頂每切位点之间插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒pRI 101 - MsMYB6L。
[0021] 本发明还保护所述MsMYB6L蛋白的应用，为如下（bl)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5) 或(b6):
[0022] (bl)调控植物的黄烷醇类化合物含量；
[0023] (b2)促进植物的黄烷醇类化合物含量增加；
[0024] (b3)调控植物种子的黄烷醇类化合物含量；
[0025] (b4)促进植物种子的黄烷醇类化合物含量增加；
[0026] (b5)调控植物种皮的黄烷醇类化合物含量；
[0027] (b6)促进植物种皮的黄烷醇类化合物含量增加。
[0028] 所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如 哥伦比亚生态型拟南芥。
[0029]本发明还保护所述MsMYB6L基因在培育黄烷醇类化合物含量增高的转基因植物中 的应用。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。 所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述黄烷醇类化合物含量 增高具体可为种子中黄烷醇类化合物含量增高。所述黄烷醇类化合物含量增高具体可为种 皮中黄烷醇类化合物含量增高。
[0030] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:将所述MSMYB6L基因导 入出发植物，得到黄烷醇类化合物含量高于所述出发植物的转基因植物。所述植物可为单 子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所 述MsMYB6L基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物。携带有所述 MsMYB6L基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注 射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。所述"黄烷醇类化合物 含量高"体现为"在种子中黄烷醇类化合物含量高"。所述"黄烷醇类化合物含量高"体现为 "在种皮中黄烷醇类化合物含量高"。
[0031] 本发明还保护所述MSMYB6L蛋白或所述所述MSMYB6L基因或以上任一所述方法在 植物育种中的应用。所述植物育种的目的为培育黄烷醇类化合物含量增高的植物。所述植 物可为单子叶植物或双子叶植物。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植 物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。所述黄烷醇类化合物含量增高具体可为 种子中黄烷醇类化合物含量增高。所述黄烷醇类化合物含量增高具体可为种皮中黄烷醇类 化合物含量增高。
[0032] 以上任一所述黄烷醇类化合物为具有式(I)所示母环的化合物；
[0034]以上任一所述黄烷醇类化合物为式（Π )所示化合物；
[0037] R2 = 0H或 Η;
[0038] R3 = H 或 OH。
[0039] κ1 = η，Κ2 = 〇Η，Κ3 = Η 时为儿茶素
[0040] Ri = OH，R2 = H，R3 = H 时为表儿茶素
[0041] Ri = H，R2 = 〇H · R3 = 0H时为没食子儿茶素 [0042] R! = OH，R2 = Η，R3 = 0H时为表没食子儿茶素 [0043] Rl = 0G，R2 = H · r3 = H时为表儿茶素没食子酸酯 [0044] Ri = 0G，R2 = Η，R3 = 0H时为表没食子儿茶素没食子酸酯
[0045]本发明发现了MsMYB6L蛋白及其功能，可用于培育黄烷醇类化合物含量改变的转 基因植物，在植物育种中具有重大应用前景。
【附图说明】
[0046] 图1为定性鉴定的照片。
【具体实施方式】
[0047] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0048] pRIlOl载体（又称"pRIlOl-AN DNA"）：Takala公司，Code No.3262。农杆菌GV3101: Tiangen公司，产品目录号:GV3101 JMACA:Sigma公司，PCode: 1001014823。
[0049] Τι代表不Το代自交产生的种子及由它所长成的植株，Τ2代表不Τι代自交产生的种 子及由它所长成的植株。
[0050] 实施例l、MsMYB6L蛋白及其编码基因的发现
[0051] 从"紫红1号"苹果中发现了一个新蛋白，如序列表的序列1所示，将其命名为 MsMYB6L蛋白。将编码MsMYB6L蛋白的基因命名为MsMYB6L基因，其开放阅读框如序列表的序 列2所示。
[0052] GENBANK中，与序列1同源性最高的蛋白如序列表的序列3所示。将序列表的序列3 所示的蛋白质命名为对照蛋白，其编码基因命名为对照基因，如序列表的序列4所示。
[0053] 实施例2、MsMYB6L蛋白的功能鉴定
[0054] 一、构建重组质粒
[0055] 将人工合成的序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pRIlOl载体的Nde I和EcoR 頂每切位点之间，得到重组质粒pRI 1 〇 1 -MsMYB6L。
[0056] 将人工合成的序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pRI 101载体的Nde I和EcoR 頂每切位点之间，得到对照质粒。
[0057]二、转基因植株的获得
[0058] 1、将重组质粒pRI101-MsMYB6L导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
[0059] 2、取步骤1得到的重组农杆菌菌体，用侵染液(含5g/100ml蔗糖和体积百分含量为 0 · 05%的Silwet L-77的水溶液)悬浮，得到pH5 · 8、0D_r?=0 · 8的菌悬液。
[0060] 3、在温室内进行(培养条件：25°C、16小时光照/8小时黑暗，光照时的光强为120-150μπι 〇1 π^?Γ1):培养哥伦比亚生态型拟南芥，花序抽苔约lcm时将主花序的顶端剪掉（以 诱导侧花序的生成），继续培养至侧花序生长至花蕾期。
[0061] 4、完成步骤3后，取植株，将花序完全浸入步骤2得到的菌悬液中，采用花芽浸泡法 (Clough and Bent,Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant Journall998，16:735-743·)将重组质 粒pRI101-MsMYB6L导入哥伦比亚生态型拟南芥，收获To代种子。
[0062] 5、将To代种子播种于含lOOmg/l卡那霉素的MS固体培养基平板上，进行筛选，对于 生长状态良好的植株取叶片进行PCR鉴定并收集1^代种子。
[0063] PCR鉴定所用的引物对如下：
[0064] 35s-F:5 '-GACGCACAATCCCACTATCC-3 '；
[0065] MYB6L-R:5 '-GACTACAACATTTTCTTGGG-3 '；
[0066] 35s-F对应于载体骨架上的35S启动子中的区段，MYB6L-R对应于MsMYB6L基因中的 区段，靶序列长度约为900bp。
[0067] 6、将1^代种子播种于含lOOmg/l卡那霉素的MS固体培养基平板上，进行筛选，对于 生长状态良好的植株取叶片进行PCR鉴定并收集1~ 2代种子。PCR鉴定方法同步骤5。
[0068] 7、将^代种子播种于含lOOmg/l卡那霉素的MS固体培养基平板上，进行筛选，对于 生长状态良好的植株取叶片进行PCR鉴定。PCR鉴定方法同步骤5。
[0069] 对于某一Ti代植株来说，如果该植株及其自交得到的!^代植株均为卡那霉素抗性 植株且PCR鉴定为阳性，该植株及其自交后代为一个纯合的转MsMYB6L基因株系。
[0070] 三、对照植株的获得
[0071] 将对照质粒代替重组质粒PRI101-MSMYB6L进行步骤二，得到纯合的转对照基因株 系。
[0072] 将pRIlOl载体代替重组质粒pRI101-MsMYB6L进行步骤二，得到纯合的转空载体株 系。
[0073]四、植株的鉴定
[0074] 1、定性鉴定(DMACA染色法）
[0075] DMACA染色法原理:在酸性条件下，对二甲氨基肉桂醛(DMACA)可以和黄烷醇类化 合物(黄烷醇类化合物包括三类:第一类为天然黄烷-3-醇类;第二类为黄烷-3，4-二醇类， 即无色花色素；第三类为原花青素）显色生成蓝色，其颜色与浓度呈正向关系。参考文献： 《茶树根原花青素提取工艺及检测方法的优化》。
[0076]待测种子分别为：纯合转MsMYB6L基因株系的T2代种子、纯合转空载体株系的T2代 种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子。
[0077]按照如下步骤进行操作：
[0078] (1)将1体积份甲醇和1体积份6Μ HC1水溶液混合，得到甲醇-盐酸混合液。
[0079] (2)将DMACA溶于甲醇-盐酸混合液，得到0.3g/100ml的DMACA溶液。
[0080] (3)取待测种子，在DMACA溶液中染色15min。
[00811照片见图1。转MsMYB6L基因株系种子的种皮被DMACA染成深蓝色，意味着有大量黄 烷醇类化合物的积累。哥伦比亚生态型拟南芥种子和转空载体株系种子的种皮均未被染成 深蓝色，保持原有的黄色。结果表明，MsMYB6L蛋白能调控黄烷醇类化合物的合成。
[0082]进行五次重复试验，结果一致。
[0083] 2、定量鉴定
[0084]待测种子分别为：纯合转MsMYB6L基因株系的T2代种子、纯合转对照基因株系的T2 代种子、纯合转空载体株系的!^代种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子。
[0085]按照如下步骤进行操作：
[0086] (1)取0.2g待测种子，液氮研磨后转移到离心管中。
[0087] (2)取步骤（1)得到的离心管，加入lml含lmg/ml抗坏血酸的70% (体积百分含量） 丙酮水溶液，4°C、黑暗条件下静置提取30min，收集上清液，离心管中剩余沉淀。
[0088] (3)取步骤(2)得到的离心管，加入lml含lmg/ml抗坏血酸的70% (体积百分含量） 丙酮水溶液，4°C、黑暗条件下静置提取30min，收集上清液，离心管中剩余沉淀。
[0089] (4)取步骤(5)得到的离心管，加入lml含lmg/ml抗坏血酸的70% (体积百分含量） 丙酮水溶液，4°C、黑暗条件下静置提取30min，收集上清液，离心管中剩余沉淀。
[0090] (5)取步骤(4)得到的离心管，加入lml含lmg/ml抗坏血酸的70% (体积百分含量） 丙酮水溶液，4°C、黑暗条件下静置提取10小时，收集上清液。
[0091] (6)将步骤(2)得到的上清液、步骤(3)得到的上清液、步骤(4)得到的上清液和步 骤(5)得到的上清液混合，得到混合液。
[0092] (7)取步骤(6)得到的混合液，加入3ml乙醚，-20°C、黑暗条件下静置(分相，上层为 乙醚相，下层为丙酮相，下层相含有黄烷醇类化合物），收集下层相。
[0093] (8)取2ml步骤(7)得到的下层相，加入1ml甲醇和0.5ml步骤1的（2)制备的DMACA溶 液，室温静置20min，然后643nm测量吸光度。
[0094] 以（ + )_Catechin(sigma产品）制作标准曲线，标准曲线方程如下：7 = 2.816叉-0.012，R2 = 0.996 (y:吸光值;X:黄烷醇类化合物的浓度、单位为mg/g)。
[0095] 将吸光度带入标准曲线方程，从而计算待测种子中的黄烷醇类化合物含量。
[0096] 进行五次重复试验，每次重复试验中取10粒待测种子的平均值。
[0097]转MsMYB6L基因株系的T2代种子的黄烷醇类化合物含量为83.115mg/kg。纯合转对 照基因株系的T2代种子的黄烷醇类化合物含量为52.785mg/kg。纯合转空载体株系的T2代种 子的黄烷醇类化合物含量为10.675mg/kg。哥伦比亚生态型拟南芥的黄烷醇类化合物含量 为10.424mg/kg。本段中的"kg"指的均为种子鲜重。
【主权项】
1. 一种蛋白质，是如下(al)或(a2): (al)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 与植物黄烷醇类化合物含量相关的由序列1衍生的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白质的基因。3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因为如下（1)或(2)或(3): (1) 编码区序列表中序列2所示的DNA分子； (2) 在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码与植物黄烷醇类化合物含量相关的 蛋白质的DNA分子； (3) 与（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与植物黄烷醇类化合物含量相关 的蛋白质的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5. 权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(bl)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6): (bl)调控植物的黄烷醇类化合物含量； (b2)促进植物的黄烷醇类化合物含量增加； (b3)调控植物种子的黄烷醇类化合物含量； (b4)促进植物种子的黄烷醇类化合物含量增加； (b5)调控植物种皮的黄烷醇类化合物含量； (b6)促进植物种皮的黄烷醇类化合物含量增加。6. 权利要求2或3所述基因在培育黄烷醇类化合物含量增加的转基因植物中的应用。7. -种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:将权利要求2或3所述基因导入出发植 物，得到黄烷醇类化合物含量高于所述出发植物的转基因植物。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。9. 权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述基因，或，权利要求7或8所述方法，在 植物育种中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于:所述育种的目的在于获得黄烷醇类化合物 含量增加的植物。
【文档编号】C12N15/29GK105949288SQ201610298233
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】王楠, 陈学森, 姜生辉, 许海峰, 王意程, 毛志泉, 姜远茂
【申请人】山东农业大学