牛病毒性腹泻病毒i型e2蛋白的表达及应用
【专利摘要】本发明涉及牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的表达及应用。其优点为：(1)建立了高效获取BVDV E2蛋白的表达、纯化方法，可制备纯的BVDV E2蛋白；(2)仅用BVDV的E2蛋白免疫兔子制备抗体，比用全病毒免疫牛本身制备的抗体特异性好，背景浅，易判定；使用FITC标记二抗，建立了间接荧光法，因此敏感性更好；操作简单：采用预混液，减少操作时间；(3)用纯的BVDV E2蛋白包被，优化了封闭条件、血清及抗体保存液，建立了BVDV抗体间接ELISA方法，组装了敏感且价格低廉的BVDV抗体间接ELISA试剂盒，可改变长期依赖进口BVDV抗体ELISA试剂盒的局面。CGMCC No.1254420160601
【专利说明】
牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的表达及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的表达及在牛病毒性腹泻病毒抗体间接 ELISA试剂盒的组装和牛病毒性腹泻病毒间接免疫荧光检测试剂盒的组装应用，属兽用生 物制品领域。 技术背景
[0002] 牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV)与猪痕病毒 (Classical swine fever virus，CSFV)均属黄病毒科（Flaviviridae)痕病毒属 (Pestivirus)成员。而BVDV有I型和II型两种生物型，在我国主要为I型。我国近几年来牛感 染BVDV而持续带毒现象非常普遍。猪瘟活疫苗在生产过种中要用到牛血清、胰酶、牛睾丸等 材料，这些材料中若带有低滴度的BVDV，会造成猪瘟细胞苗的污染。另外，用含BVDV抗体的 牛血清也会干扰猪瘟病毒的体外培养。更为严重的是，猪使用被BVDV污染的猪瘟疫苗后可 感染BVDV，出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化。为了有效防控BVDV在牛群中的流行，控 制猪用活疫苗的生物原料质量，开发BVDV抗体和抗原检测试剂具有重要意义。
[0003] 目前，检测BVDV方法主要有病毒分离、血清中和试验和电镜检查等，这些方法耗时 费力，需6~7d甚至更长时间才能获得检测结果，不利于实验室样品检测工作。目前一般使 用免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验检测BVDV。但目前商品化的免疫荧光抗体是用BVDV全 病毒免疫牛制备的，试验时背景深，效价低，给结果判定带来困难。酶联免疫吸附试验敏感 性低，往往造成漏检。另外，BVDV抗体和抗原检测试剂主要依赖国外进口试剂，不利于我国 BVDV防控工作的顺利开展。因此，急需开发价格低廉、敏感特异的BVDV抗体和病原检测试 剂。
[0004] E2蛋白是BVDV的主要结构蛋白，可产生保护性免疫反应。因此，是开发BVDV亚单位 疫苗和检测试剂的首选靶蛋白。国内已采用了多种方式对其进行原核表达(如:徐兴然等， 牛病毒性腹泻病病毒Changchunl84株E2基因的克隆及在大肠杆中的高效表达，中国预防兽 医学报，2005，27(2):98-101;杨有武等，牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达及多克隆抗体制 备，动物医学进展，2013,34(9) :128-132)，但原核表达产物为包涵体，无正确结构，活性差。 因此，需进一步研究BVDVE2蛋白的表达方法，以获取可溶性的高活性蛋白。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是建立BVDV E2蛋白的表达方法，开发BVDV抗体和抗原检测试剂。本 发明的
[0006] 技术方案
[0007] 1.一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于该牛病毒性腹泻病毒(BVDV)I型 E2蛋白是由含有BVDV E2基因与分泌信号肽Mels和六聚组氨酸纯化标签的融合基因全序列 (序列3)的重组杆状病毒表达，该重组病毒被命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(简称杆 状病毒)BacVME2-His株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.12544。
[0008] 2 .如权利要求1所述一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的应用，其特征在于用该 BVDV的E2蛋白免疫动物制备抗体，并用此抗体为基础组装的BVDV病原间接免疫荧光染色试 剂盒。
[0009] 3.如权利要求1所述一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于用该BVDV的E2 蛋白作为包被抗原，以及优化的封闭液、血清稀释液等组装成BVDV抗体间接ELISA试剂盒。 [0010]本发明的主要技术原理
[0011] 参考BVDVI型E2基因序列，设计合成引物，从标准毒株BVDV BA株(CVCC AV69,中国 兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版），中 国农业科学技术出版社，2002年，pl44)感染材料中提取病毒RNA，通过RT-PCR扩增获得天然 的BVDV E2基因；
[0012] BVDE2F:5'-CAGTCGACCA CCTAGACTGC AAACCTG-3'27(序列 1)
[0013] BVDE2R:5'-ACCGGTACCT ATGGACTCGG CGAAGTAATC CTTGTG-3'36(序列2)
[0014] 再通过叠合PCR技术将天然的BVDV E2基因与分泌信号肽Mels基因及6聚组氨酸 (6Hi s)纯化标签融合，获得转移载体；
[0015] 将转移载体通过转座技术克隆至杆状病毒基因组中，构建重组杆状病毒，获得 BVDV E2蛋白；
[0016]将获得的BVDV E2蛋白加上适宜佐剂，乳化后免疫动物，制备高免血清，用于组装 BVDV间接免疫荧光检测试剂盒；
[0017]或者将纯化的BVDV E2蛋白包被抗原，经封闭后加入适宜二抗组装BVDV抗体间接 ELISA试剂盒。
[0018]本发明【具体实施方式】
[0019] -、牛病毒性腹泻病毒(BVDV) I型E2蛋白的表达
[0020] 1 .BVDV E2基因序列的获得
[0021] 提取BVDV BA株(CVCC AV69)感染材料中提取病毒RNA，通过常规RT-PCR技术，获得 BVDV E2基因，克隆至pMD 18载体，命名为:pMD-E2。
[0022] 2.E2基因与信号肽序列和6His融合
[0023] 分别提取pMD-E2,通过叠合PCR技术获得与信号肽Mels基因和6His的融合基因 Mels-E2-6His(序列1)，克隆至pMD 18载体。构建的融合基因质粒命名为pMD-ME2-His。
[0024] 质粒pMD-ME2-His中携带的Mels-E2-6His序列（序列3):
[0025] 起始 "ACCATG ……TCGAC"为 Me 1 s 序列（1 -7 8)
[0027] 6His序列 "GGTG……CATG"（1157-1210)
[0028] 3.亚克隆至杆状病毒转移载体
[0029] 将pMD-ME2_His和pFastBacl分别进行双酶切，纯化回收，酶切片断ME2_His与 pFastBacl线性质粒连接，转化，鉴定，获得的新质粒命名为pFB-ME2-His。
[0030] 4.转座获得重组杆粒DNA
[0031] 将 pFB-ME2-His 转化 DH10Bac(Invitrogen 公司）构建出的杆粒 DNA 命名为：bME2-His〇
[0032] 5.重组病毒的获得
[0033] 将重组杆粒bME2-His用转染试剂Cellfectin(Invitrogen)转染sf9细胞，扩大培 养，收集培养上清进行PCR鉴定。获得杆状病毒BacVME2-His株，其建议的分类命名为苜蓿银 蚊夜蛾核型多角体病毒，该毒株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.12544。
[0034] 6.表达分析
[0035]将鉴定好的病毒传代扩大培养，第二代记为P2Stock，第三代记为P3Stock。前三代 均做为种毒，取第3代培养上清接种48孔板中的sf9细胞，同时设不接毒对照。60小时后弃上 请，用预冷的固定液(丙酮：甲醇= 1:1)固定。弃固定液，加鼠抗6Hi s抗体，37 °C孵育50min， 用PBS洗3遍，加 FITC标记的羊抗鼠抗体，37°C孵育50min，用roS洗3遍，荧光显微镜下观察 (图1)。结果表明，接毒sf9细胞孔出现明显的亮绿色荧光（图la)，而未接毒sf9细胞孔未显 荧光（图lb)。说明重组病毒能表达BVDV E2蛋白。
[0036] 7.蛋白纯化
[0037] 将鉴定正确的种毒用sf9细胞扩增至P6代，测定病毒滴度。用ExpressFive培养基 (Invitrogen公司）悬浮培养High Five昆虫细胞（Invitrogen公司）（27°C，180r/min震荡培 养），待High Five昆虫细胞长至对数生长期时，更换新的ExpressFive培养基，调整细胞浓 度为2~5X10_6/ml，将重组杆状病毒以10M0I剂量感染细胞，96小时后收获。2000r/min离心 lOmin，取上清，加入0.1 %的甲醛溶液灭活病毒后，用Ni离子柱HisTrap HP(GE产品）纯化， 按产品说明书进行，获得的产物为E2重组蛋白，测定蛋白浓度，分装后-80°C冻存备用。
[0038] 8.BVDV高免血清的制备
[0039] 将纯化的蛋白按l:l(v/v)比例加入完全弗氏佐剂，乳化后免疫大耳白兔，皮下多 点注射，每只lml (约50ug/只），28天后加免一次。加免14天后心脏采血，分离血清。56 °C热灭 活40min，加入20%甘油PBS后分装冻存备用。使用前用PBS稀释至一定浓度。
[0040] 二、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)I型E2蛋白应用
[00411 1.BVDV间接免疫荧光方法的建立
[0042]将处于对数生长期的MDBK细胞系传代，加至24孔板，待细胞长至60-80 %满时，吸 干培养基，接种稀释好的BVDV，每孔0.5mL，37 °C 5 % C02培养箱中吸附1.5h后换2 % FBS的MEM 维持液每孔〇. 5mL，37 °C 5 % C02培养箱中培养48h后，吸干培养液，加入预冷的丙酮：甲醇（1: 1) 0.5mL，固定30min，吸干，风干后每孔加入0.5mL PBS漂洗一次。将制备的BVDV E2抗体用 5 % 马血清的 PBS按 1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 稀释，各稀释度每孔加 200uL， 37 °C温育lh，弃抗体液，PBS漂洗三次，然后加入FITC标记羊抗兔抗体(Sigma公司）（1:500稀 释），每孔200uL，37°C温育lh后，用PBS漂洗三次。置倒置荧光显微镜下观察（图3)。同时用 AHVLA McAb染色液作对照。结果表明，随着稀释度的增加，免疫荧光逐渐减弱，而1:50有轻 微非特异性背景。1:100和1:200倍稀释效果最佳。
[0043] 2 · BVDV抗体间接ELISA方法的建立
[0044] (1)抗原包被浓度和血清稀释度的确定
[0045] 采用棋盘滴定法。将纯化的E2蛋白在酶标板上从左到右的按照4yg/mL、2yg/mL、1μ g/mL……19ng/mL浓度稀释，每孔100yL，4 °C放置16h。用TOST洗液洗板1次，每孔加入5 %马 血清PBS，4°C封闭24h。阳性对照血清和阴性对照血清分别进行10倍、50倍、100倍稀释，加入 反应板中，每孔l〇〇yL。37°C反应lh，PBST洗液洗涤3次，每孔加入100yL兔抗牛酶标二抗（1: 30000)，37°C反应lh，PBST洗液洗涤3次，每孔加入底物显色液100yL，避光显色10min，每孔 加入100yL终止液，于450nm处读数仪读取0D值，620nm作为参考波长。结果见下图4〇 [00 46]从图中阳性对照血清的0D值可以看出，当包被抗原浓度在4yg/mL~0.25yg/mL浓 度之间时，阳性血清的0D值维持在一个较稳定的范围内。随着抗原包被浓度的进一步下降， 0D值与包被蛋白的浓度出现一定的线性关系。因此，选择拐点浓度作为抗原包被的最佳浓 度，即0 · 25yg/mL。
[0047] 当包被抗原浓度为0.25yg/mL时，综合考虑阴阳性血清0D值，P/N值等，将血清的最 终稀释倍数确定为100倍。
[0048] (2)封闭液的选择
[0049] 分别采用3 % BSA、5 % PVP、10 %马血清、3 %明胶作为封闭剂进行封闭，封闭条件为 4°C24h。比较标准阳性对照血清和标准阴性对照血清的0D值的比值(P/N值），确定最佳的封 闭液成分。
[0050] 通过对多种封闭液封闭效果的比较，选择阳性血清0D值和P/N值都较高的作为本 方法的封闭剂，结果见下图5。
[0051] 从图5中可以看出3%明胶作为封闭剂时，阳性血清的P/N值最高，因此，选择3%明 胶作为本方法的封闭剂。
[0052] (3)酶标二抗的最适浓度
[0053] 将酶标二抗进行10000X、20000X、30000X和40000X稀释，对阴阳性对照血清进 行检测，比较S/N值，确定酶标二抗的最适稀释倍数，结果见下图6。
[0054] 从图中可以看出，酶标二抗稀释20000 X时，S/N值最高，因此，确定酶标二抗的最 适稀释倍数为20000 X。
[0055] (4)临界值的确定
[0056] 采用本研究建立的ELISA方法对45份田间阴性血清进行检测，并用IDEXX试剂盒进 行比较。经R0C曲线分析，本方法0D值的临界值暂定为0.1935,结果见下图7。
[0057] 3.试剂组装
[0058] (1 )BVDV间接免疫荧光检测试剂盒
[0059] 1)BVDV间接免疫荧光检测试剂盒的组份配制
[0060] PBS:NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2P〇4 0.2g，Na2HP〇42.83g，溶于 1L去离子水中。
[0061 ] 稀释液：5ml马血清稀释至100ml PBS中。
[0062] BVDV高免血清:将纯化的蛋白按l:l(v/v)比例加入完全弗氏佐剂，乳化后免疫大 耳白兔，皮下多点注射，每只lml (约50yg/只），28天后加免一次。加免14天后心脏采血，分离 血清。56 °C热灭活40min，加入20 %甘油后分装冻存备用。使用前用PBS稀释至一定浓度。 [0063] FITC标记羊抗兔抗体:为商品化试剂，用稀释液稀释至一定浓度。
[0064] 2)BVDV间接免疫荧光检测试剂盒的组装
[0065]将准备好的BVDV荧光抗体染色试剂盒的组份按下表(表1)组装：
[0066]表1 BVDV荧光抗体染色试剂盒的组份
[0068] (2) BVDV抗体间接EL ISA试剂盒的组装
[0069] 1 )BVDV抗体间接ELISA试剂盒的组分
[0070] 试剂盒组成包括:包被抗原的ELI SA板、10 X PBS、10 X PBST、3 %明胶PBS液、TMB显 色液A和B、0.75 %过氧化氢尿素溶液、终止液、阳性血清对照、阴性血清对照。
[0071] 包被液：Na2C〇31 · 59g，NaHC032 · 93g，溶于 1L 双蒸水。
[0072] PBS:NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2P〇4 0.2g，Na2HP〇42.83g，溶于 1L去离子水中。
[0073 ] PBST: PBS 中加入0 · 05 % Tween-20，用于洗涤液。
[0074] 3%明胶PBS液:PBS中加入3%明胶，用于封闭液，和血清稀释液。
[0075] TMB 显色液：
[0076] 显色液A:200mgTMB加入到100mL无水乙醇中，充分溶解。
[0077] 显色液B: Na2HP〇4 14 · 6g、梓檬酸9 · 33g，加注射用水至900mL，调pH至5 · 0~5 · 4，补 加注射用水定容至lOOOmL。
[0078] 工作液：10mL显色液B加入9mL双蒸水，再加入lmL显色液A，混勾后加入50yL 0.75 %过氧化氢尿素溶液。
[0079] 终止液：2M H2SO4。
[0080] 包被抗原的ELISA板：将纯化的BVDV E2蛋白用包被液按一定浓度稀释后，包被 ELI SA板，每孔包被100μ1，4 °C包被12h。用PBS洗涤3次，每次300μ1/孔，用3 %明胶PBS液进行 封闭，每孔300μ1，37 °C封闭40min，用roS洗涤3次，每次300μ1/孔，在洗板机上进行。室温凉 干，加入封口袋中，抽真空封好。
[0081 ] 2)BVDV抗体间接ELISA试剂盒的组装
[0082]将准确好的ELISA板、10 X PBS、10 X PBST、3 % 明胶PBS液、TMB显色液A和B、0.75 % 过氧化氢尿素溶液、终止液、阳性血清对照、阴性血清对照等一一放入试剂盒中，封闭，帖 签，4°C保存。
【附图说明】
[0083]图1 6His荧光抗体染色结果图中显示重组病毒能表达BVDV E2蛋白的检测结果， 其中图la显示接毒sf9细胞孔出现明显的亮绿色荧光；图lb显示未接毒sf9细胞孔未显荧 光。
[0084]图2纯化的BVDV E2蛋白，显示本发明构建的重组杆状病毒表达纯化所得的BVDV E2蛋白。
[0085]图3 BVDV免疫荧光染色结果，其中图la显示本发明BVDV抗体荧光染色结果；图lb 显示AHVLA McAb染色液染色结果。
[0086]图4包被抗原浓度比较 [0087]图5不同封闭剂效果比较 [0088]图6酶标二抗的最适浓度 [0089]图7临界值分析 [0090]图8本发明技术路线
[0091]本发明涉及的微生物资源信息
[0092] 本发明涉及的微生物有:牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BVDV BA株(CVCC AV69,中国兽 医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版），中国 农业科学技术出版社，2002年，pl44);重组杆状病毒BacVME2-His株，其父本为来自DHlOBac 菌（Invitrogen公司）中的杆状病毒基因组，通过将外源基因 BVDV E2基因与分泌信号肽 Mels和六聚组氨酸纯化标签的融合基因全序列克隆入pFastBacl质粒后与DHlOBac菌中的 杆状病毒基因组后获得的重组干状病毒BacVME2-His株，其建议的分类命名为苜蓿银蚊夜 蛾核型多角体病毒，该菌株已于2016年06月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.12544。
[0093] 本发明的优点
[0094] 本发明涉及牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的表达及应用。其优点为：
[0095] 1.建立了高效获取BVDV E2蛋白的表达、纯化方法，可制备纯的BVDV E2蛋白。
[0096] 2.仅用BVDV的E2蛋白免疫兔子制备抗体，比用全病毒免疫牛本身制备的抗体特异 性好，背景浅，易判定;使用FITC标记二抗，建立了间接荧光法，因此敏感性更好;操作简单： 采用预混液，减少操作时间。
[0097] 3.用纯的BVDV E2蛋白包被，优化了封闭条件、血清及抗体保存液，建立了BVDV抗 体间接ELISA方法，组装了敏感且价格低廉的BVDV抗体间接ELISA试剂盒，可改变长期依赖 进口 BVDV抗体ELI SA试剂盒的局面。 实施例
[0098] 实施例1
[0099] --重组杆状病毒的构建 [0100] 1.转座获得重组杆粒DNA
[0101] 将 pFB-ME2-His 转化 DHlOBac 构建出的杆粒 DNA 命名为:bME2-His。
[0102] 试剂配制：
[0103] S0C培养基:2 %蛋白胨，0.5 %酵母提取物，10.0 mM Nac 1，2.5mMKCl，将以上组分高 压灭菌后，加入滤菌的Mg2+溶液和葡萄糖溶液，调至浓度为：20mM MgS〇4、10mM MgCl2、20mM 葡萄糖。
[0104] LA-Bac抗性琼脂平板:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，琼脂12g，1000ml去 离子水溶解，高压灭菌，冷却后加入卡那霉素至50μg/ml，庆大霉素至7μg/ml，四环毒至10μ g/ml，IPTG至40μg/ml，Bluo gal至100μg/ml。
[0105] 抗性LB培养基:胰蛋白胨lOg，酵母提取物5g，Nacl lOg，1000ml去离子水溶解，高 压灭菌，冷却至55°C左右，加入卡那霉素至50μg/ml，庆大霉素至7μg/ml，四环毒至10μg/ml。
[0106] 具体操作如下：
[0107] 将 1 管DHlOBac感受态细胞（Invi trogen公司）和5μ1 pFB-ME2-Hi s 质粒混匀，-20 °C 冷冻30min，取出后冰上静置10min，加入lml S0C培养基，37°C 180r/min培养lh，取100μ1涂 LA-Bac抗性琼脂平板。37 °C培养24h。取白斑接种5ml抗性LB培养基，37 °C培养过夜。PCR鉴 定。
[0108] 2.重组病毒的获得
[0109]将重组杆粒bME2-His用转染试剂Cel If ectin转染sf 9细胞，扩大培养，收集培养上 清进行PCR鉴定。获得重组病毒命名为杆状病毒BacVME2-His株。该毒株已于2016年03月22 日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会 普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.。
[0110] 试剂：
[0111] 转染试剂：cellfectin(Invitrogen)，10362-100
[0112] Grace培养基（Invitrogen)，11595-030
[0113] Sf900II 培养基（Invitrogen)，10902-088
[0114] 操作过程：
[0115] 1)将处于对数生长期的sf9细胞用弯头巴氏吸管吹散后转移至60mm组织培养皿 中，吸附约0.5h。数量约2 X 106个细胞，约可铺满70 %~80 %的面积。
[0116] 2)准备转染液：
[0117] ① lOOylGrace 培养基与 9μ1 cellfectin 混合
[0118] ②lOOylGrace培养基与4μ1质粒混合
[0119] ③将Α、Β液轻轻混合，室温静置30min后加入800μ1 Grace培养基。
[0120] 3)小心地吸走60mm组织培养板上的培养基，并用Grace培养基轻轻漂洗两遍。并吸 走所有培养基。
[0121] 4)将转染混合物轻轻地全部加入到60mm组织培养板中，与sf9细胞室温作用4h。期 间要轻轻摇动数次。
[0122] 5)4h后将lml Sf900II培养基加至60mm组织培养皿中，用封口膜封口后于细胞培 养箱中27°C培养。转染后每天观察转染细胞单层的形态变化及生长特征，细胞出现明显的 细胞病变，72h后收集上清，做为病毒基础种子液，记为PIStock，获得的重组杆状病毒 BacVME2-His株，其建议的分类命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒，该毒株已于2016年06 月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委 员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No. 12544。
[0123] 6)提取病毒DNA进行PCR测序鉴定。
[0124] 实施例2
[0125] --BVDV间接免疫荧光检测试剂盒的检测
[0126] 采集田间牛血清样本180份，将处于对数生长期的MDBK细胞系传代，加至24孔板， 待细胞长至60 %~80 %满时，吸干培养基，接种稀释好的牛血清样本，每个样本接种4孔，每 孔0.5mL，37 °C 5 % C02培养箱中吸附1.5h后换2 % FBS的MEM维持液每孔0.5mL，37 °C 5 % C02培 养箱中培养48h后，吸干培养液，加入预冷的丙酮：甲醇（1:1 )0.5mL，固定30min，吸干，风干 后每孔加入0.5mL PBS漂洗一次。用用本研究建立的BVDV间接免疫荧光检测试剂盒和AHVLA McAb染色液同步检测田间牛血清样本180份，各检测2孔，统计BVDV检出率。结果，共检测出6 份阳性样本，符合率为100 %。
[0127] 实施例3
[0128] --BVDV抗体间接ELISA试剂盒与IDEXX试剂盒比较
[0129] 用本研究开发的BVDV抗体间接ELISA试剂盒检测牛血清样本749份，统计二者的符 合率。结果自建BVDV抗体间接ELISA试剂盒与IDEXX ELISA试剂盒阳性符合率为92.9 %，阴 性符合率为97.7%，总符合率为95.7% (表2)。
[0130] 表2自建BVDV抗体间接ELISA试剂盒与IDEXX ELISA试剂盒符合率
【主权项】
1. 一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于该牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白是由 含有BVDV E2基因与分泌信号肽Mels和六聚组氨酸纯化标签的融合基因全序列（序列3)的 重组杆状病毒表达，该重组病毒被命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒（简称杆状病毒） BacVME2-His株已于2016年06月Ol日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No. 12544。2. 如权利要求1所述一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白的应用，其特征在于用该BVDV的 E2蛋白免疫动物制备抗体，并用此抗体为基础组装的BVDV病原间接免疫荧光染色试剂盒。3. 如权利要求1所述一种牛病毒性腹泻病毒I型E2蛋白，其特征在于用该BVDV的E2蛋白 作为包被抗原，以及优化的封闭液、血清稀释液等组装成BVDV抗体间接ELISA试剂盒。
【文档编号】C07K14/18GK105949286SQ201610518191
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】范学政, 徐璐, 赵启祖, 宁宜宝, 丁家波, 姚文生, 王芳, 王琴, 邹兴启, 朱元源, 朱良全, 蒋卉
【申请人】中国兽医药品监察所