一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸的制作方法

一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种黄病毒科瘟病毒属的动物病毒鉴别检测器具，特别是涉及一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸，由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，检测膜上含有猪瘟病毒检测线T1“│”，牛病毒性腹泻病毒检测线T2“│”和质控线C“│”印迹。鉴别检测时，在检测膜显现三条红色条带“│││”为猪瘟病毒感染或免疫并混合牛病毒性腹泻病毒感染，在猪瘟病毒检测线和质控线显现两条红色条带“│ │”为猪瘟病毒感染或免疫，在牛病毒性腹泻病毒检测线和质控线显现两条红色条带“││”为牛病毒性腹泻病毒感染，只显现一条红色条带“│”为猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒阴性。本鉴别检测试纸特异性强，敏感性高，反应谱广，且操作简便、快速，可广泛用于猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的鉴别检测，易于在生产实践中推广应用。
【专利说明】一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种黄病毒科瘟病毒属的动物病毒鉴别检测器具，特别是涉及一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸。

【背景技术】
[0002]猪痕病毒(ClasscalSwine Fever Virus, CSFV)和牛病毒性腹?写病毒(BovineViral Diarrhea Virus, BVDV)同属于黄病毒科(Flaviridae)痕病毒属的成员，它们所引起的传染病给养猪、养牛业造成了巨大的经济损失。
[0003]猪痕((Classical swine fever, CSF))是由猪痕病毒引起的一种以高热、出血和高死亡率为特征的高度接触性传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疫病名录，为须申报的动物传染病，我国列为一类动物疫病。猪瘟只感染猪和野猪，猪瘟病毒可以在其它动物体内增值，但不引起发病。CSFV基因组为线状单股正链RNA，长约1.23X 104nt，含有一个大的开放阅读框架(0RF)，编码4种结构蛋白(C、Ems、El和E2)以及8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B)。CSFV 只有一个血清型，可分为 3 个基因群和10个基因亚群，虽然不同毒株间存在显著的抗原差异，但目前还没有找出毒力强弱的抗原标志。猪痕兔化弱毒疫苗(hog cholera lapinized vaccine, HCLV)是我国上世纪五十年代研制的世界公认的优良疫苗，安全性好、免疫原性好、遗传性状稳定，可同时诱导体液免疫和细胞免疫，能对不同基因亚群产生免疫保护，预防和控制了 CSF的大规模流行，至今地位和价值无可动摇。但是，近年来CSF的流行和发病特点又发生了新变化，多表现为非典型、慢性和隐性感染，出现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”，仍是危害养猪业的主要传染病之一。引起非典型猪瘟主要原因，是猪群免疫活疫苗后，猪群个体间抗体水平参差不齐，猪群中有的猪瘟抗体水平远高于发病保护临界点，有的仅稍高于或低于发病保护临界点，使猪瘟野毒株与只有部分免疫力猪体组织互相作用，达到一种动态平衡作用，两者相互作用在体内长期存在，对猪瘟免疫系统产生持续性损害，造成非典型猪瘟。因此，加强免疫监测手段，并在免疫监测下进行有效的疫苗接种是防制猪瘟的重要措施。
[0004]牛病毒性腹泻病毒主要引起牛的病毒性腹泻，表现为腹泻、急慢性黏膜病、免疫耐受和持续性感染、免疫抑制、繁殖障碍、血小板减少和出血症等，它不仅感染牛，而且能够感染猪、绵羊、山羊、鹿、骆驼及其他野生动物。本病呈世界性分布，严重危害牛、羊、猪、鹿等养殖业的发展。BVDV基因组为单股正链RNA，全长约1.23~1.25X 104nt，包括5’非翻译区(untranslatedreg1n, 5’UTR)—个大开放阅读框，编码4种结构蛋白(C、E?s、El和E2)以及8种非结构蛋白(Npr。、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B),以及一个3，非翻译区(3’UTR)。根据5’UTR序列的差异，BVDV可分为BVDV-1型和BVDV-2型，BVDV-1型和BVDV-2型引起的临床症状和发病特点有明显不同。BVDV-1型普遍用于疫苗生产、诊断和研究，包括许多经典株和常见的疫苗株，所引起的症状常常为一过性发热、下痢和急慢性粘膜病；而BVDV-2型大多是弱毒或无毒，是产生持续性感染的重要原因。目前国外主要采取疫苗接种和淘汰持续感染牛为主的综合防治措施。我国由于试制的疫苗效果不理想，且对该病的重视程度不够等多方面的因素，尚无有效的BVDV疫苗使用，使得该病在我国呈逐渐扩大的趋势。
[0005]CSFV和BVDV在核苷酸序列上约66%具有同源性，氨基酸约85%同源性，二者在病毒粒子结构、基因组结构和抗原特性方面均很接近，在免疫学上存在广泛的交叉性。Fernelius等(1973)首次从自然感染发病的猪体内分离到BVDV，从而在病原学上证明BVDV可以自然感染猪。近年来的流行病学调查结果表明我国猪群中BVDV感染已经比较严重，送检的样品中部分批次样品阳性率高达80.72%。造成这种情况的原因是由于猪通过与BVDV牛群的直接接触或通过污染BVDV的猪瘟疫苗而感染了 BVDV，感染BVDV后产生类似慢性猪瘟的临床症状和病理变化，并可产生猪瘟病毒的交叉中和抗体，单凭临床症状病理变化及常规的血清学方法是难以鉴别的，给猪病的诊断和防治带来新的难题。
[0006]针对当前国内畜群中猪瘟及牛病毒性腹泻流行状况，迫切需要建立快速、简单、特异的病原检测及抗体水平检测方法。目前用于CSF、BVDV抗原检测的方法很多，主要为病毒分离、中和试验和免疫组化试验等，这些方法操作繁琐、费时，均不便于大批量样品检测。酶联免疫吸试验(ELISA)、RT-PCR方法虽然敏感、准确、快速，但对仪器设备及操作人员技术要求高，不适于基层实验室操作。免疫层析试纸是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一种新型体外检测技术，是理想的即时检测(point-of-care test, P0CT)和现场检测技术,其具有更加灵敏、特异、简便、快速等优点，尤其是可实现“傻瓜式”操作，即不需要任何附加仪器设备即可进行现场检测，并在1-5分钟内判定结果，广泛应用于各种分析物的定性和半定量快速检测，包括抗原、半抗原、抗体和核酸，已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一。河南省动物免疫学重点实验室从1995年开始系统开展免疫试纸快速检测技术研究，率先在国际上研制成功动物疫病病原和抗体检测胶体试纸产品一鸡传染性法氏囊病快速诊断试纸和猪旋毛虫抗体检测纸，建立了动物疫病快速检测试纸研发技术平台，截至目前已成功开发出动物疫病抗原、抗体以及药物残留检测等系列快速检测试纸产品，大大推动了该技术的应用和发展。本发明针对猪瘟病毒和牛流行性腹泻病毒鉴别诊断的关键技术问题，筛选鉴定可区分CSFV和BVDV的高亲和力配对单克隆抗体，建立基于免疫层析试纸的蛋白芯片技术平台，研制猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸，建立适用于养殖基层和临床检测的快捷、简便的猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒联检技术，实现对畜群疫病感染的实时监测，为我国猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒防控与净化提供技术支撑，对猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒疫情监测和防控具有重要意义。


【发明内容】

[0007]本发明的目的是:研制适用于猪群或牛群中猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病感染的鉴别诊断检测试纸，本试纸特异、敏感、快捷、简便，易在生产实践中推广应用。
[0008]本发明的技术方案是:一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸，由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，金标垫为吸附胶体金标记的同时识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体玻璃纤维，检测膜为猪瘟病毒检测线Tl、牛病毒性腹泻病毒检测线T2和质控线C的硝酸纤维素膜，由样品端至手柄端的排列为猪瘟病毒检测线Tl/牛病毒性腹泻病毒检测线T2/质控线C I I I ”，猪瘟病毒检测线Tl为特异识别猪瘟病毒但不与牛病毒性腹泻病毒交叉反应的单克隆抗体mAb2印迹“ I ”，牛病毒性腹泻病毒检测线T2为特异识别牛病毒性腹泻病毒但不与猪瘟病毒交叉反应的单克隆抗体mAb3印迹“ I ”，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAbl或金黄色葡萄球菌SPA印迹“ I ”。鉴别检测时，猪瘟病毒感染或免疫并混合牛病毒性腹泻病毒感染时在检测膜显现猪瘟病毒检测线Tl，牛病毒性腹泻病毒检测线T2和质控线C三条红色条带“ I I I ”，猪瘟病毒感染或免疫在检测膜显现猪瘟病毒检测线Tl和质控线C两条红色条带“ I I ”，牛病毒性腹泻病毒感染在检测膜显现牛病毒性腹泻病毒检测线T2和质控线C两条红色条带“ I I ”，无猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒则只显现质控线c 一条红色条带“丨”。
[0009]分别以猪瘟病毒石门系标准强毒株、牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1) BA株为免疫抗原，通过杂交瘤细胞技术生产鉴定抗猪瘟病毒、抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体，利用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选同时识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的单克隆抗体以及能区分猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的单克隆抗体。用于胶体金标记的识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的单克隆抗体mAbl能同时识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒，猪瘟病毒检测线Tl的单克隆抗体mAb2能特异性识别猪瘟病毒但不与牛病毒性腹泻病毒交叉反应，用于牛病毒性腹泻病毒检测线T2的单克隆抗体mAb2能特异识别牛病毒性腹泻病毒但不与猪瘟病毒交叉反应；以IPMA筛选与猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒反应谱广的单克隆抗体，胶体金标记单克隆抗体mAbl可识别猪瘟病毒石门系强毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株和多数猪瘟病毒流行毒株以及牛病毒性腹泻病毒I型BA株和多数牛病毒性腹泻病毒流行毒株。猪瘟病毒检测线Tl单克隆抗体mAb2可识别猪瘟病毒石门系强毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株及多数猪瘟病毒流行毒株，牛病毒性腹泻病毒检测线T2单克隆抗体mAb3可识别牛病毒性腹泻病毒I型BA株及多数牛病毒性腹泻病毒流行毒株。以小鼠IgG为免疫抗原制备羊抗小鼠IgG多克隆抗体pAbl, PAbI和金黄色葡萄球菌SPA均可用于质控线C印迹。
[0010]本发明有益的积极效果，猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸实现了猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的同步联检，可有效鉴别临床上表现为非典型猪瘟或温和型猪瘟症状猪是否由BVDV感染所致，还可检测CSFV兔化弱毒(细胞源)疫苗是否污染BVDV以及牛群中BVDV的感染。本方法操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。检测试纸条具有下列各项优点:
(I)猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒联检。猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸在检测膜上含有特异识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒检测线，可同步进行猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒联检，实现猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的鉴别检测。
[0011](2)特异性强，敏感性高。猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸以同时识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的单克隆抗体及可区分猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的高亲和力配对单克隆抗体为基础制备而成，单克隆抗体的特异性强和敏感性高，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对标记抗体的反应性影响很小，且具有较高的标记率。因此，鉴别检测试纸具有较高的特异性和敏感性。
[0012](2)操作简便快速。使用鉴别检测试纸时无需任何其它试剂，只要将其插入待检样品10秒左右，在2分钟内即可判定检测结果。
[0013](3)显示检测结果形象、直观准确。鉴别检测试纸以显示红棕色“ I ”、“ I I ”、“I I”和“I I I ”印迹作为检测的阴性、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒以及猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒阳性标记，即在检测膜上显示一条棕红色条带“ I ”为猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒阴性，表示被检测样品为无猪瘟病毒感染或免疫及牛病毒性腹泻病毒感染；两条棕红色条带“ I I ”为猪瘟病毒阳性，表示被检样品为猪瘟病毒感染或免疫，无牛病毒性腹泻病毒感染；两条棕红色条带“ I I ”为牛病毒性腹泻病毒阳性，表示被检样品为牛病毒性腹泻病毒感染，无猪瘟病毒感染或免疫；三条棕红色条带“ I I I ”为猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒阳性，表示被检样品为猪瘟病毒感染或免疫混合牛病毒性腹泻病毒感染，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
[0014](4)成本低，投资少。使用鉴别检测试纸，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
[0015]【专利附图】

【附图说明】下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0016]图1是猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸侧视结构示意图。
[0017]图2是猪瘟病和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸俯视结构示意图。
[0018]图中，1.支撑板，2.样品垫，3.金标垫，4.检测膜，5.吸水垫，6.猪瘟病毒检测线Tl印迹，7.牛病毒性腹泻病毒检测线T2印迹，8.质控线C印迹，9-1.样品端保护膜，9-2.手柄端保护膜，10.标记线。
[0019]【具体实施方式】猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸可广泛应用于猪群中猪瘟病毒感染或免疫和牛病毒性腹泻病毒感染的鉴别检测、猪瘟疫苗是否污染牛病毒性腹泻病毒的鉴别检测以及牛群中牛病毒性腹泻病毒感染的检测。制备猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸，首先需制备猪瘟病毒及牛病毒性腹泻病毒免疫抗原，进而制备抗猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的单克隆抗体、筛选同时识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的单克隆抗体以及能区分猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的单克隆抗体。同时识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的单克隆抗体mAbl用于制备胶体金标记物，识别猪瘟病毒但不与牛病毒性腹泻病毒交叉反应的单克隆抗体mAb2用于印制猪瘟病毒检测线印迹“ I ”，识别牛病毒性腹泻病毒但不与猪瘟病毒交叉反应的单克隆抗体mAb3用于印制牛病毒性腹泻病毒检测线印迹“ I ”，其次需制备羊抗小鼠IgG抗体pAbl或金黄色葡萄球菌SPA，用于印制质控线印迹“I”。
[0020](I)猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒免疫抗原的制备。
[0021](1.1)猪瘟病毒免疫抗原的制备
以猪瘟病毒标准强毒株石门株接种猪肾细胞(PK-15)，48-60小时收取病毒培养液，4°C 3000 r/min低速离心30 min去除杂质,利用50 kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose 4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量(TCID5tl)达10_7以上，荧光定量PCR测定纯化病毒拷贝数达1ltl以上。
[0022](1.2)牛病毒性腹泻病毒免疫抗原的制备
以牛病毒性腹泻病毒I型BA株接种牛肾细胞(MDBK)，48?96小时收取病毒培养液，4°C 3000 r/min低速离心30 min去除杂质,利用50 kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose 4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪痕病毒进行凝胶过滤层析纯化,测定牛病毒性腹泻病毒的半数细胞培养物感染量(TCID5tl)达10_8以上，荧光定量PCR测定纯化病毒拷贝数达101°以上。
[0023](2)抗猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备。
[0024](2.1)杂交瘤细胞株的建立
分别将猪瘟病毒及牛病毒性腹泻病毒免疫抗原与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化，以50mg-100mg/只分别免疫BALB/c系小鼠3次，每次间隔15-30天；第3次加强免疫后3-4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75%酒精浸泡5-10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将I X 18的脾细胞与2-5 X 10 7的SP2/0骨髓瘤细胞混合，1000 r/min离心10 min，弃上清，在37°C的水浴中将0.7_1 ml的40%-50% PEG 4000 (pH8.5-9.0)缓缓加入细胞，温育I min后，缓慢加入无血清1640培养基15 ml，以终止PEG的作用，37°C水浴5-10 min, 1000 r/min离心10 min，弃上清，将细胞重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100 ml-200 ml/孔)，置37°C 5% CO2培养箱中培养。培养7-10天后，取杂交瘤细胞培养上清以免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选阳性杂交瘤细胞。分别以猪瘟病毒石门系标准强毒株感染PK-15细胞、牛病毒性腹泻病毒I型BA株感染MDBK细胞，经甲醇固定后，5%脱脂奶37°C封闭I h ;加待检细胞培养上清50mL/孔，设HAT培养基和小鼠免疫血清为阴性和阳性对照；加I: 500辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG抗体(50 mL/孔)，37°C作用30 min ;每步反应后均用含0.05% Tween-20的PBS充分洗涤；以底物AEC室温显色10-20 min，用水冲洗中止显色后，在显微镜下观察显色结果。选取强阳性、细胞生长旺盛的克隆孔进行连续3次有限稀释克隆化，扩大培养后冻存细胞，建立抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株6株、抗牛病毒性腹泻单克隆抗体杂交瘤细胞株8株。
[0025](2.2)单克隆抗体的制备:以体内诱生腹水制备单抗。取经降殖烷或液体石蜡致敏的经产Balb/c小鼠，腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞17个/只，7 d?10 d后抽取腹水，离心后取上清，分装，冻存。
[0026](2.3)单克隆抗体的鉴定 (2.3.1)单克隆抗体的抗体效价
以免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价，单抗上清和腹水的IPMA效价分别在1:16和1:1600以上。
[0027](2.3.2)单克隆抗体的特异性
用CSFV石门系强毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株感染猪肾细胞(PK-15)，用牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株感染牛肾细胞(MDBK)，以免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定单抗与CSFV、BVDV流行毒株的反应性，筛选获得同时识别CSFV石门系强毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株、牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株的单克隆抗体2株，而特异性识别CSFV石门系强毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株但不与牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株发生交叉反应的单克隆抗体2株，特异性识别牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1) BA株、BVDV流行毒株但不与CSFV石门系强毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株以及CSFV流行毒株发生交叉反应的单克隆抗体3株。以免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定上述7株单克隆抗体与CSFV、BVDV标准株和流行毒株的反应谱，证明用于胶体金标记的单克隆抗体可识别猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒标准株及猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒流行毒株，用于猪瘟病毒检测线Tl可检测CSFV石门系强毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株以及多数流行毒株，用于牛病毒性腹泻病毒检测线T2可检测牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1) BA株及多数牛病毒性腹泻病毒流行毒株，均具有较广的CSFV或BVDV反应谱。
(2.4)单克隆抗体的纯化:以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。取I mL小鼠腹水，加入2 mL 0.06 mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.0),以0.1 mol/L HCl调至pH 4.5 ;于室温搅拌下，逐滴加入33 mL辛酸，4°C静置2 h, 15000 r/min离心30 min,弃沉淀；在离心上清中加入 1/10体积0.01 mol/L PBS (ρΗ7.4)，#0.1 mol/L NaOH调至pH 7.4 ;于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至终浓度45%，4°C静置2 h，10000 r/min离心30 min，弃上清；以适量PBS重悬沉淀，对PBS透析过夜，换液3次。以分光光度计法或考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定纯化单克隆抗体IgG的蛋白含量在lmg/ml以上，以免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定小鼠腹水和纯化IgG的抗体效价在1:1000以上，分装，冻存。
[0028](3)兔抗小鼠IgG多克隆抗体的制备
以纯化小鼠IgG免疫2.0 kg左右健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射50mg/只，每次加强免疫间隔3 w,以弗氏不完全佐剂乳化抗原肌肉注射，最后一次加强免疫2 w后，以琼脂扩散试验(AGP)测定免疫血清抗体效价高于1:40时，采集高免兔全血，分离血清，以辛酸-硫酸铵法纯化兔抗小鼠IgG，方法同(2.4)单抗纯化，辛酸用量为45 mL/mL血清，测定抗体效价和蛋白浓度(10-20 mg/ml )，所制备兔抗小鼠IgG多克隆抗体PAbl可用于检测试纸质控线C印迹的印制。
[0029](4)单克隆抗体的胶体金标记
(4.1)胶体金的制备:取100 mL超纯水置于500 mL洁净的锥形瓶，加入I mL I % (w/V)氯金酸煮沸；在搅拌状态下迅速加入新鲜配制的I mL 1% (w/v)柠檬酸钠溶液，煮沸约3min至溶液颜色由黄色变为紫红色，继续煮沸2 min;待溶液凉至室温，补超纯水至100 mL,以0.2 mol/L K2C03iI pH至9.0，4°C避光可保存数月。
[0030](4.2)最适标记蛋白浓度测定:取待标记mAbl IgG对20 mmol/L硼酸钠溶液(pH8.0)4°C过夜透析。在微孔板中以25 mL超纯水1:2、1:4、1:8……倍比稀释待标记单抗；各孔加入125 mL胶体金溶液，RT静置5 min ;加入125 mL I mol/L NaCl溶液；各孔颜色随蛋白浓度的降低而由红色变为蓝色。以颜色未变蓝的单抗最高稀释度的蛋白浓度为胶体金最适标记浓度，胶体金标记时，蛋白浓度增加20%。
[0031](4.3)单克隆抗体的胶体金标记:取2 mL最适蛋白浓度的mAbl待标记IgG,加入10 mL胶体金溶液(pH 9.0)，迅速混匀，室温作用10 min?15 min ;加入1/10体积含10%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的20 mmol/L硼酸钠溶液,迅速混勻,RT作用10 min?15 min ；40C 15000 g离心30min，小心移去上清；以含1% (w/v)BSA的20 mmol/L硼酸钠溶液重悬胶体金，同上离心，弃上清；重复洗漆I次，以I mL含1% (w/v) BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬胶体金，4°C保存备用。
[0032](5)检测膜的制备
将硝酸纤维素检测膜切成2.5X30 cm2的长条，置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；用PBS (pH 7.2)分别将特异识别猪瘟病毒毒株但不与牛病毒性腹泻毒株反应的单抗mAb2 IgG、特异识别牛病毒性腹泻病毒毒株而不识别猪瘟病毒毒株的单抗mAb3IgG稀释至I mg/mL,并分别放于忙存池；利用B1jet Quanti 3000以I mL/cm分别将抗CSFV mAb2单抗、BVDVmAb3单抗和兔抗鼠IgG溶液喷点于检测膜中央，形成猪瘟病毒检测线Tl、牛病毒性腹泻病毒检测线T2和质控线C印迹，检测线与质控线相距0.5 cm ;置42°C干燥箱30 min或室温自然干燥；将检测膜置塑料袋，加干燥剂4°C密闭保存备用。
[0033](6)结合垫的制备
将玻璃棉切成1.5X30 cm2的长条，置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；取ImL 胶体金标记物加入 2 mL 含 2% (w/v) BSA>3% (w/v)鹿糖、0.6 mol/L NaCl、0.2% Tween20 (v/v)和 0.1% (w/v)叠氮钠的 20 mmol/L 硼酸钠溶液(pH 8.0);利用 Airjet Quanti3000以15 mL/cm将抗胶体金标记物溶液喷点于玻璃棉；置50°C干燥箱30 min干燥；将胶金垫置塑料袋，加干燥剂4°C密闭保存备用。
[0034](7)样品垫的制备
将玻璃棉切成1.5X30 cm2的长条，以将含0.1 mol/L NaCl、0.2% Tween 20 (v/v)和0.1% (w/v)叠氮钠的PBS (pH 7.2)溶液浸泡玻璃棉条；置50°C干燥箱30 min干燥；将样品垫置塑料袋，加干燥剂RT密闭保存备用。
[0035](8)吸水垫的制备
将玻璃棉切成2.5X30 cm2的长条，将吸水垫置塑料袋，加干燥剂RT密闭保存备用。
[0036](9)支撑板的制备
将双面胶贴于PVC支撑板，切成7.5X30 Cm2的长板，制备支撑板。
[0037](10)试纸的组装
利用LM5000试纸装配仪或手工将上述材料装配成试纸板。先将检测膜粘贴于支撑板中央，然后将胶金垫和样品垫依次粘贴于检测膜的样品端，各层间重叠I mm?2 mm，再将吸水垫粘贴于检测膜的另一端，与检测膜重叠I mm?2 mm，在样品端以白色塑胶膜包裹样品垫和胶金垫，塑胶膜上印有检测方向及检测溶液上限标记，在手柄端以蓝色塑胶膜包裹吸水垫。
[0038](11)切割与包装
利用CM4000切割仪将装配好的试纸板切成0.3 cm的试纸条，将试纸条分装入塑料袋，加干燥剂4°C密闭保存。
[0039]( 12)猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸的实施结构
参见图1，图2，图中，I为支撑板用不吸水薄片条，实施中可采用塑胶薄片条或采用不吸水的硬质纸片材，反应试剂载体吸附层由2，3，4，5，组合而成，从样品端2开始，到手柄端5依次粘贴在支撑层I上面；其中2为样品端样品垫，实施中可使用玻璃纤维棉简称玻璃棉，3为吸附胶体金标记同时识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的金标玻璃纤维棉，可采用精制玻璃纤维棉，简称为金标垫，4为检测膜，实施中可采用硝酸纤维素膜，5为手柄端吸水垫，采用吸水纸，如滤纸或其它吸水纸均可，试纸条总长8 cm，宽度0.4 cm, 6为用特异识别猪瘟病毒但不与牛病毒性腹泻病毒发生交叉反应的单克隆抗体mAb2在硝酸纤维素膜上印制的猪瘟病毒检测线印迹“ I ”，7为特异识别牛病毒性腹泻病毒但不与猪瘟病毒发生交叉反应的单克隆抗体在硝酸纤维素膜上印制的牛病毒性腹泻病毒检测线印迹“ I ”，8为兔抗小鼠IgG多克隆抗体pAbl或金黄色葡萄球菌SPA在硝酸纤维素膜上印制的质控线印迹“ I ”，在检测膜上的猪瘟病毒检测线印迹、牛病毒性腹泻病毒检测线印迹和质控线印迹组合排列为“ III”。9为保护膜，覆盖在玻璃棉及金标玻璃棉的保护膜为9-1，覆盖在吸水层滤纸上的保护膜为9-2。在玻璃棉和金标玻璃棉交界处对应位置的白色保护膜上偏向玻璃棉一方0.5 cm处的保护膜上印有一条标记线10，在标记线10右边印有箭头和Max字样，手柄端保护膜可用黄色或其它颜色，2，3，4，5各层彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。
[0040]( 13)猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸实施检测反应原理
当猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸带动待检CSFV、BVDV抗原及金标抗体mAbl —起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中，在扩散过程中金标抗体mAbl分别与待检CSFV、BVDV抗原相结合，形成金标抗体-抗原复合物，CSFV、BVDV抗原的金标复合物可分别与检测膜上的猪瘟病毒检测印迹mAb2和牛病毒性腹泻病毒检测印迹mAb3结合，生成红棕色“ I I ”标记及“ I I ”，部分未与抗原结合的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上与质控印迹中的PAbl或PSA，生成红棕色标记“ 两种标记组合叠加，形成三条红棕色阳性标记“ I I |”，表示样品中同时含有猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒；CSFV病毒的金标复合物不能与检测膜上的BVDV检测印迹mAb3结合，只能与CSFV检测印迹mAb2结合，生成红棕色“ I ”标记，部分未与抗原结合的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上与质控印迹中的PAbl或PSA，生成红棕色标记“ I ”，两种标记组合叠加，形成两条红棕色阳性标记“ I I ”，表示样品中只含有猪瘟病毒；BVDV的金标复合物不能与检测膜上的CSFV检测印迹mAb2结合，只能与BVDV检测印迹mAb3结合，生成红棕色“ I ”标记，部分未与抗原结合的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上与质控印迹中的PAbl或PSA，生成红棕色标记“ I ”，两种标记组合叠加，形成两条红棕色阳性标记“ I I ”，表示样品中只含有牛病毒性腹泻病毒；当样品中不含猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒时，没有金标抗体-抗原复合物形成，不能与CSFV检测印迹和BVDV检测印迹结合，则生成阴性标记“ I ”。如果检测膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。
(14)猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸检测实例操作方法(14.1)检测样品溶液的制备:采集病(死)猪、牛的病变组织，包括肺、肝、脾、肾、气管、小肠、大肠和淋巴结等，以1:5或1:10加适量PBS或水进行简单研磨，制备待检溶液。
[0041](14.2)试纸检测:将猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸样品端浸入待检溶液10 S?20 S ;取出试纸水平放置5 min?10 min观察结果。
[0042](14.3)检测结果判定:试纸显现三条红棕色条带(CSFV检测线、BVDV检测线和质控线)“I I I ”为CSFV、BVDV阳性，表示待检样品中同时含有CSFV、BVDV抗原；两条红棕色条带(CSFV检测线和质控线)“ I I ”为CSFV阳性，表示待检样品中仅含有CSFV抗原；两条红棕色条带(BVDV检测线和质控线)“ I I ”为BVDV阳性，表示待检样品中仅含有BVDV抗原；仅显现一条红棕色条带(质控线)“ I ”为CSFV、BVDV阴性，表示待检样品未检出CSFV、BVDV抗原；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
[0043]实施例一，猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒快速诊断，采集病(死)猪、牛的病变组织，包括肺、肝、脾、肾、气管、小肠、大肠和淋巴结等，以1:5或1:10加适量PBS或水进行简单研磨，制备待检溶液，以猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸按(14)操作方法进行检测和结果判定，鉴别诊断病(死)猪、牛CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染、CSFV感染或CSFV免疫、BVDV感染。试纸显现三条红棕色条带(猪瘟病毒检测线、牛病毒性腹泻病毒检测线和质控线)“I I I ”为CSFV、BVDV阳性，表示待检猪、牛为CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染；两条红棕色条带(猪瘟病毒检测线和质控线)“I I ”为CSFV阳性，表示待检猪、牛为CFSV感染或免疫，无BVDV感染；两条红棕色条带(牛病毒性腹泻病毒检测线和质控线)“I I ”为BVDV阳性，表示待检猪、牛为BVDV感染，无CFSV感染或免疫；仅显现一条红棕色条带(质控线)“ I ”为CSFV、BVDV阴性，表示待检猪、牛无BVDV感染、CSFV感染或免疫；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
[0044]实施例二，外表健康及发热期病猪、牛检验检疫，采集外表健康猪、牛拭子(咽拭和肛拭)、粪便或发热期血样，以1:5或1:10加适量PBS或水进行简单混悬，以猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸按(14)操作方法进行检测和结果判定，鉴别外表健康及发热期病猪、牛的CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染、CSFV感染或CSFV免疫、BVDV感染。试纸显现三条红棕色条带(猪瘟病毒检测线、牛病毒性腹泻病毒检测线和质控线)“ I I I”为CSFV、BVDV阳性，表示待检猪、牛为CSFV感染或CSFV免疫混合BVDV感染；两条红棕色条带(猪瘟病毒检测线和质控线)“ I I ”为CSFV阳性，表示待检猪、牛为CFSV感染或免疫，无BVDV感染；两条红棕色条带(牛病毒性腹泻病毒检测线和质控线)“ I I ”为BVDV阳性，表示待检猪、牛为BVDV感染、无CFSV感染或免疫；仅显现一条红棕色条带(质控线)“ I ”为CSFV.BVDV阴性，表示待检猪、牛无BVDV感染、无CFSV感染或免疫；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
[0045]实施例三,猪痕病毒兔化弱毒疫苗(细胞源)的质量检测，以1:5或1:10加适量PBS或水溶解猪瘟兔化弱毒疫苗(细胞源)，制备待检疫苗溶液，以猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸按(14)操作方法进行检测和结果判定，检测猪瘟兔化弱毒疫苗(细胞源)的病毒含量和鉴别检测疫苗的牛病毒性腹泻病毒污染情况。试纸显现三条红棕色条带(猪瘟病毒检测线、牛病毒性腹泻病毒检测线和质控线)“ I I I ”为CSFV、BVDV阳性，表示待检疫苗为BVDV污染；两条红棕色条带(猪瘟病毒检测线和质控线)“I I ”为CSFV阳性，表示待检疫苗无BVDV污染，猪瘟病毒检测线的显色强度与CSFV疫苗含量成正比；两条红棕色条带(牛病毒性腹泻病毒检测线和质控线)“ I I ”为BVDV阳性，表示待检疫苗有BVDV污染，疫苗无CSFV ;仅显现一条红棕色条带(质控线)“ I ”为CSFV、BVDV阴性，表示待检疫苗无BVDV污染，同时也不含疫苗毒；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
【权利要求】
1.一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸，由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，其特征是:金标垫吸附胶体金标记同时识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的单克隆抗体mAbl，检测膜的猪瘟病毒检测线Tl为特异识别猪瘟病毒但不与牛病毒性腹泻病毒交叉反应的单克隆抗体mAb2印迹“ I ”，牛病毒性腹泻病毒检测线T2为特异识别牛病毒性腹泻病毒但不与猪瘟病毒交叉反应的单克隆抗体mAb3印迹“ I ”，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAbl或金黄色葡萄球菌SPA印迹“丨”。
2.根据权利要求1所述的鉴别检测试纸,其特征是:猪瘟病毒感染或免疫并混合牛病毒性腹泻病毒感染时在检测膜显现猪瘟病毒检测线Tl，牛病毒性腹泻病毒检测线T2和质控线c三条红色条带“ III”，猪瘟病毒感染或免疫时在检测膜显现猪瘟病毒检测线Tl和质控线c两条红色条带“ I I ”，牛病毒性腹泻病毒感染时在检测膜显现牛病毒性腹泻病毒检测线T2和质控线C两条红色条带“ I I ”，无猪瘟病毒或牛病毒性腹泻病毒则只显现质控线c 一条红色条带“丨”。
3.根据权利要求1所述的鉴别检测试纸，其特征是:单克隆抗体mAbl同时识别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒，单克隆抗体mAb2特异识别猪瘟病毒但不与牛病毒性腹泻病毒发生交叉反应，单克隆抗体mAb3特异识别牛病毒性腹泻病毒但不与猪瘟病毒发生交叉反应。
4.根据要求I或3所述的鉴别检测试纸，其特征是:鉴别检测试纸的猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒反应谱广，猪瘟病毒检测线TI可检测CSFV石门系强毒株(Shimen)、猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)以及多数猪瘟病毒流行毒株，牛病毒性腹泻病毒T2可检测牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1) BA株及多数牛病毒性腹泻病毒流行毒株，可实现对猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的鉴别检测。
【文档编号】G01N33/577GK104459143SQ201410763134
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】王丽, 柴书军, 杨苏珍, 孙亚宁, 杨继飞, 史西保, 李青梅, 郅玉宝, 赵东, 梁跃, 郭军庆, 杨艳艳, 邓瑞广, 张改平 申请人:河南省农业科学院