一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产 方法。属于兽用生物制品领域。 技术背景
[0002] 牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)是黄病毒科痕病毒属牛病毒性腹泻 病毒/黏膜病病毒(Bovine viral diarrheaVirus，BVDV)引起的以腹泻为主要症状的重要 传染病，各年龄牛均易感。主要症状为:腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，母畜 流产、死胎和畸形。除感染牛外，还可感染猪、羊、鹿、骆驼及其它野生动物。〇lafson(1946) 等首先在美国纽约以消化道溃疡和下痢为特征牛中发现牛病毒性腹泻（BVD) Jansey和 Chiver( 1953)发现黏膜病（MD) AM Le等（1957)首次分离到病毒。GiIlespie和Barker (1959)分离出New-York株和Indiana株。GiIlespie(1960)分离出Oregon C24V株（标准毒 株）。1971年由美国兽医学会统一命名为BVD-MDV。我国李友民等（1981)在吉林省首次从国 外引进牛的流产胎儿脾脏中分离并鉴定出BVDV，证明该病在我国存在。目前，我国20多个省 市自治区检出此病。本研究使用的制苗毒株BVDV/NMG株，是2010年从内蒙古某牛场疑似病 例中采集血清样品，利用MDBK细胞培养分离出的一株BVDV。该分离株F2代即可在MDBK细胞 上产生细胞圆缩、聚合、出现空洞，大部分细胞脱落等BVDV的典型CPE，为CP型BVDV。电镜和 理化检测均符合BVDV特征，如为圆形，有囊膜直径约50nm左右病毒粒子，对5-碘脱氧尿核苷 不敏感，对乙醚、酸均敏感，56 °C作用70min可被完全灭活等。
[0003] 牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhino tracheitis，IBR)俗称"红鼻病"或 "坏死性鼻炎"，由牛痕疼病毒I型（BHV-1)牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起的一种急性、热性、接触性烈性传染病，OIE将其列为法 定报告动物疫病。其自然宿主是牛。病毒感染牛体后，可潜伏于神经系统，使感染变得呈间 歇性、持续性，而且病牛会长期或终身带毒。1995年本病最现发现于美国科罗拉多州的育肥 牛。1956年Madin等首次从患牛分离出病毒。1964年Huck鉴定BHV-I属于疱疹病毒。1990年 Edwards等将BHV-I分为2个型，其中BHV-1.1与IBR有关，BHV-1.2与(传染性脓疱性外阴阴道 炎)有关。我国最早在20世纪70年代在进口牛群中发现，而1981年周泰冲等首次在深圳海关 从新西兰进口奶牛中分离到病毒。1986年王则兴等从乳牛、水牛、黄牛中分离到此病毒，证 明IBR在我国存在。经流行病学发现，目前我国绝大部分省、市、区均有IBR感染的牛群，但感 染率高低不同，同时亦有病毒分离的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于解决微载体悬浮培养MDBK细胞繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病 毒、牛传染性鼻气管炎病毒以制备牛病毒性腹泻/黏膜病、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫 苗。
[0005] 本发明采用MDBK-种细胞繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病 毒，进而将此两种病毒作为制苗用抗原并制备成预防牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎的 二联灭活疫苗。。同时，本发明提供了一种牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病 毒适应微载体悬浮培养细胞MDBK的方法。
[0006] 本发明的技术方案
[0007] 1. 一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其特征在于该疫 苗含有灭活的牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)NMG株和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV)LY 株。
[0008] 2.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫 苗的生产方法，其特征在于该方法为：
[0009] (1)分别用BVDV NMG株病毒和IBRV LY株病毒作为生产种毒通过细胞繁殖获得制 备疫苗用病毒抗原；
[0010] (2)两种病毒抗原经灭活后按比例混合配制成水相；
[0011] (3)与油相混合乳化成二联灭活疫苗。
[0012] 3.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫 苗的生产方法，其特征在于其中BVDV NMG株病毒和牛传染性鼻气管炎病毒IBRV LY株病毒 均用传代细胞MDBK繁殖的；
[0013] 4.如权利要求2、3所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活 疫苗的生产方法，其特征在于其中病毒抗原是两种病毒分别通过生物反应器中微载体悬浮 培养传代细胞MDBK繁殖后获得的。
[0014] 5.如权利要求4所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫 苗的生产方法，其特征在于其中使用的微载体为Cytodex I。
[0015] 本发明【具体实施方式】
[0016] -、疫苗制备
[0017] 1.制苗毒株
[0018] 牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)NMG株(来自中 国兽医微生物菌种保藏管理中心)能被牛病毒性腹泻/黏膜病病毒标准阳性血清中和，且能 被BVDV IFA荧光抗体识别；针对常用BVDV基因分型的5' -UTR设计特异性引物，经RT-PCR可 扩增出288bp特异性片段。将该片段进行测序后与Genbank中已发表BVDV毒株序列的5'-UTR 进行同源性比较，该分离毒株与BVDV经典毒株NADL株和Singer株同源性均达到90.3%以 上，与BVDV经典毒株890株同源性仅为79.7 %。该分离株与2008年~2011年我国分离的BVDV 1BJ09-02、BVDV isolate NX 0803、BVDV isolate HZ 0602、BVDV isolate ZD05(2010)等4 个国内分离毒株同源性达到97.7%，与2012~2013年我国各地分离的BVDV毒株同源性为 82%~87%，说明该分离毒株具有一定的代表性。纯净性检测显示该毒株无菌、无支原体以 及无外源病毒污染，纯净性良好，对MDBK细胞适应性好，TCID 5Q稳定但对牛的毒力较弱，病毒 回归健康易感牛除鼻孔出现水样或粘性分泌物外，未见其它明显病理变化，鼻拭子采集样 品RT-PCR检测结果显示其排毒期持续约为11日。
[0019] 本发明用牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV)LY株(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心），攻毒毒株和生产用毒株为同一毒株， 是2010年从河南洛阳某牛场疑似IBR感染的鼻拭子分离而来。该分离株第一代即可在MDBK 细胞上产生细胞圆缩、聚合、出现空洞，甚至脱落等特异性CPE。电镜及理化检测均符合IBRV 特征，如病毒粒子近似球形，有囊膜，直径约150nm左右，对5-碘脱氧尿核苷敏感，对乙醚、酸 均敏感，56°C作用60min可使病毒滴度显著降低。IBRV LY株毒株可被牛传染性鼻气管炎病 毒标准阳性血清中和，且能被IBRV FA荧光抗体识别，通过针对gB基因特异性引物可扩增出 IBRV gB基因491bp片段，与Genbank中已发表的IBRV gB基因序列进行同源性比较，结果同 源性为93.0%~100%，与我国2012年北京分离株(DX)和新疆分离株(XJ)同源性为100%， 以上均证实分离到的毒株为IBRV。纯净性检测显示该毒株无菌、无支原体以及无外源病毒 污染，纯净性良好。动物回归试验表明该分离毒株对牛的毒力较强，按每头健康易感牛滴鼻 攻击IBRV/LY株强毒IOml (病毒含量为107'5TCID5〇/ml)，分两次滴鼻攻击(上午和下午各1 次），每次攻击时左右鼻孔各2.5ml，攻毒后2~14日陆续出现呼吸道症状(单侧或双侧鼻孔 出现粘性或脓性分泌物，部分牛出现呼吸困难、咳嗽等)或眼部症状(眼部有粘性或脓性分 泌物，或出现眼结膜炎、结膜充血，大量流泪，甚至出现坏死膜），部分牛出现体温升高(体温 2 40.(TC且至少持续2日）等典型的牛传染性鼻气管炎症状。采集鼻拭子进行排毒期监测显 示，约从攻毒后第3日开始排毒，最长可持续至14日，其中排毒高峰期为攻毒后8~10日。从 临床症状上看该分离株可划归为呼吸道型IBRV，因此选用IBRV/LY株毒株作为攻毒用毒株。
[0020] 2.抗原制备
[0021] 为了解决牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒适应微载体悬浮培 养细胞牛肾细胞系MDB