方法。 实施例
[0060]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0061 ] 实施例1
[0062] 一一微载体生物反应器悬浮培养繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病毒NMG株 [0063] 1.选择导入载体所需要的种细胞MDBK(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心）；
[0064] 2.细胞工厂繁殖细胞传代的方法:首先复苏步骤1所选择的种细胞到T225的细胞 瓶中，生长48h左右，按照1:3的比例进行传代;然后把7个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞 传到1个细胞（10层)工厂(体积为33.5cm X 20.5cm X 19. Ocm = 13048.25cm3)进行培养;48小 时左右按照1:3的比例进行细胞传代培养;该过程中使用的培养基为DMEM高糖培养基，血清 为胎牛血清，使用量为10 % ;
[0065] 3 .收获细胞工厂中的细胞：将步骤2所得细胞用PBS洗涤2-3次，然后加入胰酶- EDTA溶液消化；1个细胞（10层）工厂（体积为33· 5cmX2〇 · 5CmX I9.Ocm= 13〇48· 25Cm3)加入 1000 ml胰酶-EDTA溶液，其它类型的细胞工厂按照类似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后 收集细胞；
[0066] 4.收获的细胞计数后，选用的微载体为Cytodex I，按照每个微载体添加20个细胞 的比例进行细胞接种;每升培养基中加入4克微载体;细胞接种后在24h、48h、60h取样观察 细胞在微载体上的生长状况，如图1 -3所示。
[0067] 5.生物反应器培养细胞的条件为：
[0068] 选用5L的NBS生物反应器，其工作体积为5L，培养基为DMEM高糖培养基(Gibco);血 清使用浓度为10% ;溶氧量为35%的溶液饱和溶氧量;温度为36.7°C ;搅拌速度为50r/min， pH为7.3;培养时间为60h。
[0069] 6.步骤5培养的细胞达到接种BVDV NMG株病毒的要求后，进行下述步骤:生物反应 器中的搅拌桨叶上方连接有一个100目不锈钢筛网的旋转滤器，旋转滤器能够阻隔微载体， 旋转滤器的底部含有一个排液出口；在搅拌状态下，容器中的培养基通过排液出口排掉;然 后用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并通过容器的底部排液出口排出PBS;如上反复2~3 次，停搅拌，15~20min后通过罐底的排出口将PBS和培养基混合液排出，只留下沉积在罐底 部的微载体；
[0070] 7.然后关闭排液出口，把BVDV NMG株病毒接种液加入到生物反应器中，同时改变 搅拌速度，以便病毒均匀接种；
[0071] 8.细胞接种病毒后，向步骤7所得装有微载体的容器加入2%血清的DMEM高糖培养 基(Gibco)，然后进行病毒繁殖，病毒在生物反应器中繁殖的条件为:培养基为DMEM高糖培 养基(Gibco);溶氧量为25%的溶液饱和溶氧量;温度为36.7°C ;搅拌速度为60r/min，pH为 7.4；
[0072] 9.培养45h后收集BVDV NMG株病毒，（病变图片见附图4)，收获量为5L，TCID50为 8 · 0/lml〇
[0073] 实施例2
[0074] -一微载体生物反应器悬浮培养繁殖牛传染性鼻气管炎LY株 [0075] 1.选择导入载体所需要的种细胞MDBK;
[0076] 2.细胞工厂繁殖细胞传代的方法:首先复苏步骤1所选择的种细胞到T225的细胞 瓶中，生长48h左右，按照1:3的比例进行传代;然后把7个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞 传到1个细胞（10层)工厂(体积为33.5cm X 20.5cm X 19. Ocm = 13048.25cm3)进行培养;48小 时左右按照1:3的比例进行细胞传代培养;该过程中使用的培养基为DMEM高糖培养基，血清 为胎牛血清，使用量为10 % ;
[0077] 3.收获细胞工厂中的细胞：将步骤2所得细胞用PBS洗涤2~3次，然后加入胰酶- EDTA溶液消化；1个细胞（10层）工厂（体积为33· 5cmX2〇 · 5CmX I9.Ocm= 13〇48· 25Cm3)加入 1000 ml胰酶-EDTA溶液，其它类型的细胞工厂按照类似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后 收集细胞；
[0078] 4.收获的细胞计数后，选用的微载体为Cytodex I，按照每个微载体添加20个细胞 的比例进行细胞接种;每升培养基中加入4g微载体;细胞接种后在24h、55h取样观察细胞在 微载体上的生长状况，如图5-6所示。
[0079] 5.生物反应器培养细胞的条件为：
[0080] 选用5L的NBS生物反应器，其工作体积为5L，培养基为DMEM高糖培养基(Gibco);血 清使用浓度为10% ;溶氧量为35%的溶液饱和溶氧量;温度为36.7°C ;搅拌速度为50r/min， pH为7 · 35;培养时间为55h。
[0081] 6.步骤5培养的细胞达到接种IBRV/LY株病毒的要求后，进行下述步骤:生物反应 器中的搅拌桨叶上方连接有一个100目不锈钢筛网的旋转滤器，旋转滤器能够阻隔微载体， 旋转滤器的底部含有一个排液出口；在搅拌状态下，容器中的培养基通过排液出口排掉;然 后用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并通过容器的底部排液出口排出PBS;如上反复2~3 次，停搅拌，15~20min后通过罐底的排出口将PBS和培养基混合液排出，只留下沉积在罐底 部的微载体；
[0082] 7.然后关闭排液出口，把IBRV/LY株病毒接种液加入到生物反应器中，同时改变搅 拌速度，以便病毒均匀接种；
[0083] 8.细胞接种病毒后，向步骤7所得装有微载体的容器加入2%血清的DMEM高糖培养 基(Gibco)，然后进行病毒繁殖，病毒在生物反应器中繁殖的条件为:培养基为DMEM高糖培 养基(Gibco);溶氧量为25 %的溶液饱和溶氧量;温度为36.7 °C ;搅拌速度为60转/分，pH为 7.4；
[0084] 9.培养50h后收集IBRV LY株病毒液（细胞病变见附图7)，收获量为5L，TCID50为 8.25/lml〇 [0085] 实施例3
[0086] --牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗(BVDV/NMG株+IBRV/LY株)的 制备及检验
[0087] 1设备寄原材料
[0088] 1.1主要设备5L搅拌式反应器(NBS生物反应器BF-310CELLIGEN)。
[0089] 1.2Cytodex 1微载体(购自 GE 公司）。
[0090] 1.3传代细胞MDBK工作种细胞(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心）。
[0091] 1.4种毒BVDV NMG株生产种毒;IBRV LY株生产种毒(来自中国兽医微生物菌种保 藏管理中心）。
[0092] 1.5攻毒用强毒BVDV W株和IBRV LY(来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心） 株。
[0093] 1.6培养基DMEM培养基;硫乙醇酸盐(TG)、酪胨琼脂培养基(GA)、葡萄糖蛋白胨培 养基(GP)、支原体液体培养基、支原体固体培养基。
[0094] 1.7新生牛血清经检验BVDV和IBRV血清中和抗体均不高于1:4，BVDV和IBRV抗原 检测均为阴性。
[0095] 1.9其它化学试剂灭活剂2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)(西格玛奥德里奇（上海）贸易 有限公司），206佐剂(购自赛彼科(上海)特殊化学品有限公司）。
[0096] 2 方法
[0097] 2.1 5L反应器微载体培养细胞的制备复苏MDBK工作种细胞1~2支，按T25、T75、 Τ225、转瓶逐级扩大贴壁培养，生长至致密单层后用胰蛋白酶消化分散，细胞活力不低于 95 %时，接种密度转移至生物反应器中，设定反应器细胞培养的参数，定时取样进行细胞观 察、计数。
[0098] 2.2抗原的制备待反应器中细胞在微载体上长成单层，沉淀排出细胞营养液，更 换维持液，分别按1%〇种毒含量接种BVDV/NMG株、IBRV/LY株生产种毒，设定反应器病毒培养 的参数同实例2所述，进行病毒的繁殖，待70%以上细胞脱落时收获培养物(见表1)。
[00"] 1.配苗用抗原
[0100]实施例1和实施例2制备所收获的两种病毒作为制苗用抗原(见表1)。
[0101] 表1 BVDV、IBRV抗原生产情况汇总
[0103] 2.抗原液灭活和检验
[0104] (1)抗原灭活将纯化抗原液中加入BEI溶液，30 °C连续灭活28小时，其间定时搅拌。 灭活结束后，立即在灭活病毒液中