单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活 疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是一种以人类为唯一自然宿主的双 链包膜DNA病毒，血清学分为HSV-I和HSV-2型。HSV-I主要感染口、眼、唇的皮肤和粘膜、中 枢神经系统以及外生殖器造成龈口炎、唇疱疹、角膜结膜炎、疱疹性脑炎、脑膜炎、生殖器疱 疹等疾病;HSV-2主要引起生殖器疱疹;疱疹病毒严重威胁着人类健康。目前，临床上常使用 疱疹净、阿糖腺苷、无环鸟苷、泛洛昔韦等抗毒药物治疗，虽能缓解临床症状，但不能彻底清 除潜伏于体内的病毒，且存在药物毒副作用大、易出现耐药、容易复发等缺点。HSV感染性疾 病常反复发作，迀延难愈，给病人造成极大痛苦，HSV疫苗的研究开发为预防和治愈HSV感染 性疾病带来了希望。
[0003] 病毒疫苗可分为传统疫苗和新型疫苗。传统疫苗主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗 和亚单位疫苗;新型疫苗是指利用基因工程技术构建的如基因缺失活疫苗、载体疫苗、病毒 样颗粒疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗等，其在多种病毒感染性疾病的治疗中得到广泛应用并 取得较好的疗效。减毒活疫苗基本包含病毒全部或大部分抗原，并具有和野生型病毒相同 的感染及复制特性，基本无致病性，故减毒后的活疫苗可以有效地诱导机体免疫应答，相对 于其它种类的疫苗而言，免疫原性强，保护效果好，在人类抵抗感染性疾病的历史上发挥了 不可替代的作用。
[0004] 中国专利申请201010253601.5公开了单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗及其 制备方法，该减毒活疫苗敲除了单纯疱疹病毒I型基因组中的UL43、UL44、UL45、UL46和UL47 基因。该减毒活疫苗是敲除了其基因组中的复制或感染非必需基因片段，能够诱导机体的 免疫应答系统，及时清除感染的病毒，抑制感染的进一步发展，但其制备方法有诸多不足之 处：（1)选取拟敲除基因序列上下游700bp至2000bp的同源侧翼序列和荧光蛋白基因组 成同源重组框，由于目的片段太长使PCR扩增困难；（2)选择pShuttle-CMV载体，同源重组框 整合到拟敲除基因的正确位置效率偏低，成功机率不大；（3)用荧光蛋白基因代替拟敲除病 毒基因用于筛选鉴定，虽然此方法快速、简便，但最终未能将荧光蛋白基因去除，构建的减 毒活疫苗仍表达该蛋白。
[0005] 因此，现有技术存在减毒活疫苗的制备方法复杂、成功效率偏低等缺点。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒 活疫苗，通过敲除特定基因制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生毒力回复等 优点，可有效防治HSV-I的感染。
[0007] 本发明提供一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，包含单纯疱疹病毒I型基 因敲除型病毒株，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒I型基因组的UL5、UL18、 UL40、UL41、US8、ICP8、ICP34 · 51 和 ICP34 · 52 基因中的至少一个。
[0008] 优选地，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒I型基因组的UL5、UL18、UL41 和US8中的至少一个。
[0009] 优选地，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒I型基因组的US8基因。
[0010] 相应地，本发明还提供单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗的制备方法，包括如 下步骤： 51、 BAC-HSV-1宿主菌的构建:扩大培养HSV-I病毒，提取HSV-I基因组，并与MC质粒重 组，构建得到MC-HSV-I重组质粒，BAC-HSV-I重组质粒电转化至宿主菌，得到BAC-HSV-I宿 主菌； 52、 BAC基因敲除系统的构建:将I-SceI插入至IjpREDI载体上，并将构建的pREDI重组质 粒电转化至Sl构建的BAC-HSV-I宿主菌，得到BAC基因敲除系统； 53、 同源重组片段替代拟敲除基因：以Kam-SacB全片段为模板，PCR扩增拟敲除基因的 同源重组框，先进行第一次PCR扩增，再以第一次PCR扩增产物为模板进行第二次PCR扩增， 得到同源重组片段，电转化至S2构建的MC基因敲除系统中进行第一次同源重组，由抗性基 因和SacB基因共同取代MC-HSV-I中的拟敲除基因；Kam-SacB全片段通过现有常规技术手 段构建得到； 54、 基因敲除病毒株的筛选:抗性基因筛选同源重组成功菌，鼠李糖诱导I-SceI内切酶 合成，切除抗性基因和SacB基因，发生第二次同源重组，得到含单纯疱疹病毒I型基因敲除 病毒株基因的宿主菌;扩大培养得到的含单纯疱疹病毒I型基因敲除病毒株基因的宿主菌， 提取ABAC-HSV-I质粒，并将该ABAC-HSV-I质粒电转至宿主细胞中，形成单纯疱疹病毒I型 基因敲除病毒株； 55、 将S4得到的单纯疱疹病毒I型基因敲除病毒株进行空斑纯化，得到单纯疱疹病毒I 型基因重组减毒活疫苗。
[0011] 优选地，所述同源重组框包括拟敲除基因上下游各50bp同源序列、抗性基因和 SacB基因。
[0012]优选地，所述拟敲除基因为UL5,其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为 CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA(SEQ ID NO · 1)，下游引物为GGCCGAGGCCTTITTAAATITTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAA GAATGGCGC(SEQ ID N0.2);第二次PCR的上游引物为GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGT AAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC(SEQ ID N0.3)，下游引物为GGCCGAGGCCTTITTA AATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQ ID N0.4)〇
[0013] 优选地，所述拟敲除基因为US8,其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为 TAAGGCGCCCCATCCCGAGGCCCCACGTCGGTCGCCGAACTGGGCGACCGCGATTTATTCAACAAAGCCA(SEQ ID NO · 5)，下游引物为ACGGAGCCGTTGGTGATAAGATCTCAAAGCCGGATCCATTGGTGGAGGGAGCATCTTGCAA GAATGGCGC(SEQ ID N0.6);第二次PCR的上游引物为TGTTGGGCTCCCAITTTACCCGAAGATCGGCTG CTATCCCCGGGACATGTAAGGCGCCCCATCCCGAGGC(SEQ ID N0.7)，下游引物为ACGGAGCCGTTGGTGA TAAGATCTCAAAGCCGGATCCATTGGTGGAGGGAGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQ ID N0.8)〇
[0014] 优选地，所述拟敲除基因为UL41，其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为 CTACATGTCAGGTCAATTGTAACTGCGGATCGGCCTAACTAAGGCGTGGTTCGATTTATTCAACAAAGCC(SEQ ID NO · 9)，下游引物为CGTCATGTACACGTTGGTGGTCAAATATCAGCGCCGATACCCCAGTTACGGCATCTTGCAA GAATGGCGC(SEQ ID NO. 10);第二次PCR的上游引物为TGGTGGGTCGITTGTTCGGGGACAAGCGCGCT CGTCTGACGITTGGGCTACATGTCAGGTCAATTGTAAC( SEQ ID NO · 11)，下游引物为CGTCATGTACACGT TGGTGGTCAAATATCAGCGCCGATACCCCAGTTACGGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQ ID NO.12)〇
[0015] 优选地，所述拟敲除基因为UL18,其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为 CTGGCAATTACCCTGTTATCCCTAGGCCCGTAGTCTGCAAATCCTTTT(SEQIDN0·13)，下游引物为 CATCGCGATACCCTCGGGCATCTCGCATCTTGCAAGAATGGGCCTCGTT(SEQIDN0·14);第二次PCR的 上游引物为TGGATGCCCACCCCCACCCCCCCGTGGGTCTAGCCGGGC(SEQ ID N0.15)，下游引物为 ATGCTGGCGGACGGCTTTGAAACTGACATCGCGATA CCCTCGGGCATCTCG (SEQ ID N0.16)。
[0016] Kam-SacB全片段可以通过PCR扩增得到，上游引物为CGATTTATTCAACAAAGCCACGTTG TGTCTCAA(SEQIDN0·17)，下游引物为GCATCTTGCAAGAATGGCGCTCGTTTAATAG(SEQID N0.18)。
[0017] 优选地，所述抗性基因选自kanamyc ine抗性基因 、Amp i c i 11 in抗性基因、 chloramphenicol抗性基因或焚光蛋白基因；所述宿主菌为DH5a大肠杆菌;所述宿主细胞为 Vero细胞。
[0018] 本发明以Genebank中的HSV-I基因组参考序列为蓝本，应用SiRNA干扰技术，对减 毒活疫苗构建的拟敲除基因进行初步筛选，并通过毒力测定及安全性评价等，筛选并构建 得到安全性高、免疫效果好的敲除型病毒株制备成减毒活疫苗。应用SiRNA干扰