CABYR-a/b在调控YAP表达和磷酸化水平及调控p73表达中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及CABYR-a/b在调控YAP表达和磷酸化水平及调控 P73表达中的应用。
【背景技术】
[0002] f丐离子结合酪氨酸磷酸化调节蛋白（calcium-binding tyrosine phosphorylation-regulated protein，CABYR)，于 2002 年首次在精子中发现，其包括 6 个 转录本编码5种蛋白亚型，包括CABYR-a, -b, -c, -d,和-e(两个转录本同时编码相同的亚 型，CABYR-c)。CABYR具有睾丸特异性，其定位于精子细胞的胞质和成熟精子的鞭毛中。根 据文献报道，CABYR在多种癌症中表达，如脑癌、食管癌、肝癌和肺癌。然而关于CABYR生 物学功能上的作用，只有在肝癌和肺癌中有极少的报道，如在H印G2 (人肝癌细胞）中沉默 CABYR-c可使细胞生长速度减慢。CABYR的生物功能有待于后续的实验进程中慢慢发掘。
[0003] Hippo通路最早在果蝇里被发现，在生理状态下Hippo通路主要是调控细胞的增 殖和凋亡而限定组织器官生长的大小，并参与干细胞的自我更新。近期发现，Hippo信号途 径是一种新的抑制肿瘤发生的信号通路，而且YAP是Hippo信号途径的核心蛋白。在哺乳动 物中，Hippo通路由4个主要的激酶调控YAP的活性。当Hippo信号通路激活后引起Mst 1/2 活化，Mstl/2激酶与支架蛋白Savl组成复合物使Latsl/2 (Large tumor suppressor ; LATS)激酶磷酸化并被激活，磷酸化的Latl/2激酶又与另一支架蛋白Mobl组成复合物。 Latsl/2直接使YAP蛋白上S127被磷酸化后产生一个14-3-3的结合基序，从而可与胞浆中 的14-3-3蛋白结合滞留在胞浆中，导致YAP入核减少，或者进一步被磷酸化后通过蛋白酶 体途径被降解。由于YAP不具有DNA结合活性。因此，进入核的非磷酸化状态的YAP与其 他转录因子结合才能发挥其生物学作用。目前公认的是TEAD和p73。核内YAP与转录因 子TEAD (TEA-domain ;TEAD)结合，促进或抑制TEAD靶基因的表达，如CTGF和Cyr61，从而 调节多种生物学功能，如细胞生长、细胞接触抑制、控制组织器官的大小和干细胞的自我更 新等。YAP也可与p73结合调控与细胞凋亡相关基因的表达，如Bax和DR5等。此外也有 报道，在多种肿瘤组织中发现核内YAP的表达增高，这就提示YAP的活性与肿瘤的发生和发 展密切相关。YAP的活性除了受Hippo通路调节外，近几年也陆续报道了其他激酶也可调 节YAP磷酸化活性。如胞浆中YAP S127磷酸化后可进一步被CK1 S / e磷酸化，并通过蛋 白酶体使其降解。尽管这一领域正迅速发展，但有关Hippo信号途径上游信号调控仍知之 甚少。另外，除了 p63可直接结合到YAP的启动子上抑制YAP的转录外，至今未见其他能调 控YAP mRNA水平的报道。因此，YAP可能具有广泛的生理和病理方面的生物学作用。
[0004] 目前为止，尚未见关于CABYR与YAP之间关系的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供CABYR-a/b及其抑制剂或促进剂的新用途。
[0006] 本发明提供了 CABYR蛋白抑制剂在如下（al)-(a4)至少一种中的应用：
[0007] (al)抑制YAP蛋白磷酸化，和/或制备抑制YAP蛋白磷酸化的产品；
[0008] (a2)促进YAP蛋白表达，和/或制备促进YAP蛋白表达的广品；
[0009] (a3)促进p73蛋白表达，和/或制备促进p73蛋白表达的广品；
[0010] (a4)制备用于治疗和/或预防由于YAP蛋白磷酸化水平升高和/或YAP蛋白表达 降低和/或P73蛋白表达降低所致疾病的药物。
[0011] 活性成分为CABYR蛋白抑制剂，具有如下（a)-(d)功能中至少一种的产品也属于 本发明的保护范围：
[0012] (a)抑制YAP蛋白磷酸化；
[0013] (b)促进YAP蛋白表达；
[0014] (c)促进p73蛋白表达；
[0015] (d)治疗和/或预防由于YAP蛋白磷酸化水平升高和/或YAP蛋白表达降低和/ 或P73蛋白表达降低所致疾病。
[0016] 本发明还提供了如下（1)_(4)所示物质中的任一种在如下（bl)_(b4)至少一种中 的应用：
[0017] (1)CABYR 蛋白；
[0018] (2) CABYR蛋白的编码基因；
[0019] (3)含有所述编码基因的表达盒、重组载体或转基因细胞；
[0020] ⑷CABYR蛋白促进剂：
[0021] (bl)促进YAP蛋白磷酸化，和/或制备促进YAP蛋白磷酸化的产品；
[0022] (b2)抑制YAP蛋白表达，和/或制备抑制YAP蛋白表达的产品；
[0023] (b3)抑制p73蛋白表达，和/或制备抑制p73蛋白表达的广品；
[0024] (b4)制备用于治疗和/或预防由于YAP蛋白磷酸化水平降低和/或YAP蛋白表达 升高和/或P73蛋白表达升高所致疾病的药物。
[0025] 活性成分为如下（1)_(4)中至少一种，具有如下（e)-(h)功能中至少一种的产品 也属于本发明的保护范围：
[0026] (1)CABYR 蛋白；
[0027] (2) CABYR蛋白的编码基因；
[0028] (3)含有所述编码基因的表达盒、重组载体或转基因细胞；
[0029] (4) CABYR蛋白促进剂：
[0030] (e)促进YAP蛋白磷酸化；
[0031] (f)抑制YAP蛋白表达；
[0032] (g)抑制p73蛋白表达；
[0033] (h)治疗和/或预防由于YAP蛋白磷酸化水平降低和/或YAP蛋白表达升高和/ 或P73蛋白表达升高所致疾病。
[0034] 在本发明中，所述CABYR蛋白具体为a亚型CABYR蛋白和/或b亚型CABYR蛋白。
[0035] 相应的，所述CABYR蛋白抑制剂为抑制a亚型CABYR蛋白表达的物质和/或抑制 b亚型CABYR蛋白表达的物质；所述CABYR蛋白促进剂为促进a亚型CABYR蛋白表达的物 质和/或促进b亚型CABYR蛋白表达的物质。
[0036] 进一步，所述抑制a亚型CABYR蛋白表达的物质和所述抑制b亚型CABYR蛋白表 达的物质具体为如下（I)或（II)所示的shRNA或者编码所述shRNA的DNA : (I)将序列表 中序列7中的T均替换为U后所得序列所示的shRNA ; (II)将序列表中序列8中的T均替 换为U后所得序列所示的shRNA ;相应的，所述"编码所述shRNA的DNA"可为序列表中序列 7或序列8所示的DNA片段或含有所述DNA片段的表达盒或重组质粒。
[0037] 在本发明中，所述a亚型CABYR蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列3所示；所 述b亚型CABYR蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列4所示。
[0038] 所述YAP蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列1所示；所述YAP蛋白磷化酸为 序列表中序列1所示蛋白质的第127位丝氨酸的磷酸化。
[0039] 所述p73蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列2所示。
[0040] 所述CABYR蛋白的编码基因为所述a亚型CABYR蛋白的编码基因或所述b亚型 CABYR蛋白的编码基因。
[0041] 具体而言，所述a亚型CABYR蛋白的编码基因如序列表中序列5所示（其中序列 5的第188-1669位为⑶S);所述b亚型CABYR蛋白的编码基因如序列表中序列6所示（其 中序列6的第188-1615位为⑶S)。其中，序列5编码序列表中序列3所示的a亚型CABYR 蛋白；序列6编码序列表中序列4所不的b亚型CABYR蛋白。
[0042] 含有所述CABYR蛋白的编码基因的表达盒由能够启动所述编码基因表达的启动 子，所述编码基因，以及转录终止序列组成。含有所述CABYR蛋白的编码基因的重组载体具 体为pCMV-Myc-CABYR-a质粒；所述pCMV-Myc-CABYR-a质粒为在pCMV-Myc载体的酶切位点 EcoRI和Sail之间插入了序列表中序列5的第191-1669位所示DNA片段的重组质粒。
[0043] 在本发明中，所述YAP蛋白磷酸化为肺癌细胞中所述YAP蛋白的磷酸化；所述YAP 蛋白表达为肺癌细胞中所述YAP蛋白的表达；所述p73蛋白表达为肺癌细胞中所述p73蛋 白的表达。
[0044] 进一步，所述肺癌细胞具体为NCI-H460细胞。
[0045] 在本发明中，所述由于YAP蛋白磷酸化水平升高和/或YAP蛋白表达降低和/或 p73蛋白表达降低所致疾病可为肺癌。
[0046] 在本发明中，以上所有的所述产品均可为药物。
[0047] 实验证明，沉默CABYR-a/b可以提高YAP蛋白的表达量，同时降低YAP蛋白S127 位点的磷酸化，并提高P73蛋白在H460细胞中的表达。本发明对于防治由于YAP蛋白表达 量和磷酸化水平，以及P73蛋白表达量异常引起的疾病具有重要意义。
【附图说明】
[0048] 图1为沉默NCI-H460细胞中CABYR-a/b的沉默效果的RT-PCR和western blot检 测结果。其中，shRNAl表示转入沉默载体pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞；shRNA2 表示转入沉默载体pGPHl/Neo-CABYR-a/b-303的克隆细胞；sh-vec表示转入无义干扰序列 的克隆细胞。
[0049] 图2为沉默NCI-H460细胞中的CABYR-a/b对YAP的表达和磷酸化及p73的表达 水平的影响检测结果。其中，shRNAl表示转入沉默载体pGPHl/Neo-CABYR-a/b-121的克隆 细胞；shRNA2表示转入沉默载体pGPHl/Neo-CABYR-a/b-303的克隆细胞；sh-vec表示转入 无义干扰序列的克隆细胞。P-Yap表示第127位丝氨酸被磷酸化的YAP蛋白。
[0050]