一种鸡新城疫、禽流感二联灭活苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鸡新城疫、禽流感二联灭活苗的制备方法，为一种新型的病毒液 纯化工艺。属于兽用生物制品制造领域。
【背景技术】
[0002] 禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒所引起的禽类的感染和/或疾病 综合征。该病1878年首次发生于意大利，当时称之为"鸡瘟"，现已几乎遍布世界各地。AI 可引起大多数家禽、野禽及水禽的感染，其中以鸡和火鸡最为易感，水禽被认为是流感病毒 的自然宿主（Hinshaw et al.，1980)。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV)最显著 的生物学特征之一就是亚型众多，不同亚型病毒之间可以通过交换某些基因片段发生基因 重排，出现具有新的生物学特征的病毒，而且其抗原变异频繁，包括由点突变引起的抗原漂 移（Antigenic drift)和不同亚型毒株同源重组产生新亚型所引起的抗原转变（Antigenic shift) (Wiley et al.，1981 ;Webster et al.，1981)，因此为禽流感的有效防制带来了极 大的困难和挑战。近年来，禽流感以越来越快的变异速度在我国甚至世界范围内流行，给养 禽业带来了不可估计的损失，在严重影响国内禽类产品市场的同时更制约着我国禽类的出 口。控制禽流感的蔓延，避免禽流感在人类社会的大流行成为科学界乃至各国政府关注并 急待解决的首要任务之一。
[0003]新城疫（Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV)引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。以 高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血为特征。该病死亡率高，对养鸡业危害严 重，0IE将其列为A类疾病。
[0004] 我国防控禽流感和新城疫主要依靠疫苗免疫。目前，控制禽流感发病的主要手段 是接种灭活苗，控制新城疫发病的主要手段是接种灭活苗或弱毒苗，其生产主要依靠鸡胚 法实现。提高疫苗抗原含量、纯度，能够有效提高疫苗的免疫原性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为在疫苗制备过程中提高疫苗抗原的含量和纯度，使之有效提高 疫苗的免疫效力和安全性。
[0006] 本发明的技术方案为：
[0007] 1.-种鸡新城疫、禽流感二联灭活苗的制备方法，其特征在于该方法包括以下步 骤：制苗用病毒液的制备，使用深层过滤装置进行过滤，病毒液的浓缩与灭活，油佐剂灭活 苗的制备，分装。
[0008] 2.如权利要求1所述的鸡新城疫、禽流感二联灭活苗的制备方法，其特征在于具 体包括以下步骤：
[0009] (1)病毒液的制备：将生产用种毒接种10日龄SPF鸡胚，收获鸡胚液；
[0010] (2)病毒液经深层过滤装置处理，即：鸡胚液与深层过滤装置接触，以300L/m2/ hr~500L/m2/hr的流速过滤具有大粒径分布的蛋壳碎片、壳膜和血液，分离目的抗原与杂 质；
[0011] (3)病毒液的浓缩与灭活：使用病毒超滤浓缩系统将病毒液浓缩至原体积的1/2， 加入10%甲醛灭活；
[0012] (4)油佐剂灭活苗的制备：白油、硬脂酸铝和司本-80混合，加入两种抗原等量混 合的抗原液，即得油佐剂疫苗。
[0013] 3.如权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽流感二联灭活苗疫苗的制备方法，其特 征在于步骤（4)所述白油、硬脂酸铝与司本-80的体积比为94:2:6,病毒液与油相体积比为 3:7〇
[0014] 4.如权利要求1和2所述的一种鸡新城疫、禽流感二联灭活苗的制备方法，其特征 在于其中的病毒经深层过滤装置和病毒超滤浓缩系统处理方法在用禽蛋作为病毒复制原 料制备的灭活疫苗中的应用。
[0015] 本发明详细描述
[0016] 为了完成上述技术方案，本发明提供了一种高效的禽病病毒液浓缩纯化抗原工 艺，包括以下步骤：
[0017] 1.提供禽病病毒培养液和深层过滤装置：分别使病毒培养液与深层过滤装置接 触，以300L/m2/hr~500L/m 2/hr的流速过滤具有大粒径分布的蛋壳碎片、壳膜和血液，分离 目的抗原与杂质。
[0018] (1)本发明提供一种深层过滤装置（瑞士 FILTR0X公司），AF09深层过滤滤滤膜， 包括具有30~10 y m多个分级的深层滤器介质，用于初步澄清和去除聚集的壳膜和血液团 块，提高未澄清的进料流的通量而没有不期望的滤饼过滤效应；
[0019] (2)AF09滤膜有非常高的深度以分散尿囊液中的杂质，防止会导致介质中的内部 滤饼过滤的内部絮状物桥接，在介质的外部或内部以避免压力的浓度降低引起絮状物分 解；
[0020] (3)具有各向异性深层滤器层，即孔径逐步减少，匹配料液中絮状物大小的群体；
[0021] (4)对于平均粒径大于10 ym的目标抗原的初步澄清（通常是采用絮凝剂和化学 处理的料液的初步澄清）；
[0022] (5) AF09滤膜具有开放标称孔径评级的非织造纤维和纤维素/硅藻土 (diamatoceous earth)的复合分级层，能够过滤具有大量固体的聚合物絮凝剂处理的进料 流；
[0023] (6) AF09滤膜具有较大通透性，但对于聚合物絮凝剂处理的进料流有较好的保持 特性。
[0024] 2.对经AF09滤膜过滤处理后的抗原液再用截留分子量为100kd的膜包进行病毒 超滤浓缩（购自德国默克密理博），对过滤的抗原液进行纯化。
[0025] 3.用10%甲醛分别处理制苗用抗原液进行灭活；灭活后的两种抗原等量混合。
[0026] 4.经以上浓缩纯化处理、并经灭活的病毒抗原液按（V/V)96:4与吐温-80混合制 成水相；水相与油相再按（V/V)3:7的比例混合乳化制成（灭活）油乳剂疫苗（单价）。
[0027] 使用两种或以上病毒抗原液制备多价疫苗，是根据禽流感病毒型的种类，可分别 制备不同亚型禽流感病毒株的鸡胚培养液经以上浓缩纯化处理、灭活后病毒抗原液按相同 等体积混合，再将混合后病毒抗原液按（v/v)96:4与吐温-80混合制成水相；水相与油相按 (V/V) 3:7的比例混合乳化制成（灭活）油乳剂疫苗（多价）。
[0028] 本发明使用微生物资源信息
[0029] 本发明疫苗生产用禽流感病毒为A型流感病毒（AIV)A/Chicken/Hebei/ WD/98(H9N2)株（以下称禽流感病毒WD株），生产用新城疫病毒（(Newcastle disease virus，NDV)为La Sota株，均购自北京市农林科学院畜牧兽医研究所；禽产蛋下降综合症 病毒CVCC AV70,中国兽医微生物菌种保藏管理中心保藏。
[0030] 本发明积极意义
[0031] 本发明提供了一种鸡新城疫、禽流感二联灭活苗的制备方法。该方法包括以下步 骤：（1)制苗用毒液的制备。（2)病毒的鸡胚液使用深层过滤装置以300L/m 2/hr~500L/ m2/hr的流速进行过滤；（3)使用超滤系统进行抗原液的超滤浓缩；(4)使用10%甲醛灭活； (5)油佐剂灭活苗的制备，分装。此方法制备的疫苗产量和安全性得到提高且具有良好的免 疫效果。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过实施例对本发明进行进一步说明。
[0033] 实施例1
[0034] 一一禽流感、新城疫二联灭活疫苗制备
[0035] 将SPF鸡胚分别接种禽流感病毒WD株、新城疫病毒La Sota株，经以下方法浓缩纯 化处理、并经灭活后的抗原液稀释，再加入油佐剂混合乳化制成疫苗，用于禽流感H9亚型、 新城疫的预防。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
[0036] 1.提供禽流感、新城疫病毒液和深层过滤装置。
[0037] (1)本发明疫苗生产用禽流感病毒为WD株，系北京市农林科学院畜牧兽医研究所 动物免疫与预防研究室1998年从河北省望都分离；新城疫病毒为La Sota株，来自北京市 农林科学院畜牧兽医研究所。两种毒株分别接种10日龄SPF鸡胚培养获得抗原液。
[0038] (2)用于深层过滤的装置使用硅藻土作助滤剂，病毒抗原液与深层过滤装置接触， 以300L/m2/hr~500L/m 2/hr的流速过滤具有大粒径分布的蛋壳碎片、壳膜和血液，分离目 的抗原与杂质。本实施例所用的深层过滤装置适用病毒抗原液最佳流速为300L/m 2/hr。
[0039] 2.用截留分子量为100kd的膜包（购自德国默克密理博）处理步骤以上深层过滤