过氧化氢脱毒的无细胞百日咳疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种百日咳疫苗的脱毒方法，具体涉及一种采用过氧化氢脱毒无细胞 百日咳疫苗抗原的方法，本发明还涉及采用过氧化氢脱毒的无细胞百日咳疫苗及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 百日咳（pertussis)是由百日咳鲍特氏杆菌（Bordetellapertussis)引起的一 种具有高度传染性的严重急性呼吸道传染病，传染性较强，人群普遍易感，其中尤以婴幼儿 多见，是严重威胁人类健康的主要传染病之一。
[0003] 百日咳的病原菌是鲍特菌属（Bordetella)中的百日咳鲍特菌（B.pertussis)，常 称百日咳杆菌。百日咳杆菌能产生许多毒性因子，可以因环境条件改变而发生表型变化， 毒力因子的表达水平也不同，这些因子包括百日咳外毒素（PT);丝状血凝素（filamentous hemagglutinin，FHA);百日咳杆菌粘着素（pertactinPRN);耐热的内毒素（endotoxin， ET);不耐热毒素（HLT);气管细胞毒素（TCT);腺苷环化酶毒素（ACT)等多种生物活性物 质。当细菌随空气飞沫浸入易感者的呼吸道后，细菌的丝状血凝素黏附于咽喉至细支气管 黏膜的纤毛上皮细胞表面；继之，细菌在局部繁殖并产生多种毒素如百日咳外毒素、腺苷环 化酶等引起上皮细胞纤毛麻痹和细胞变性，使其蛋白合成降低，上皮细胞坏死脱落，以及全 身反应。近来研究还表明百日咳发生机制与百日咳杆菌毒素类物质损害宿主细胞免疫功能 有关。但目前对于百日咳的发病机理的认识还不完全清楚。
[0004] 接种百日咳疫苗是目前预防百日咳最有效、最经济的手段。已用于预防接种的百 日咳菌苗有全细胞菌苗和无细胞菌苗，全细胞百日咳疫苗是将百日咳全菌体用适当灭活剂 灭活后，与佐剂配合，直接用做免疫用疫苗。其简单生产过程为：将细菌大量培养增殖后，沉 降菌体，用适量浓度的甲醛溶液，在一定温度下，使其灭活成无传染性、但具有免疫原性的 菌体液，将不同血清型的菌体原液按一定比例配合后，即成为百日咳原液。
[0005] 百日咳全菌体疫苗在20世纪30年代首次临床证实具有免疫保护作用，并用于免 疫以来，迄今已使用了近70年，其在控制和降低儿童百日咳发病方面发挥了巨大作用，但 由于副反应太高，以至于在日本、英国均有抵制疫苗接种情况的出现。由于接种率下降，导 致百日咳流行出现反弹，鉴于此种情况，日本于80年代率先研制并使用了以PT和FHA为主 要有效成分的无细胞百日咳疫苗[张庶民，徐颖华，等.中国药事2005，19(11) :685-686]。
[0006] 我国企业采用的无细胞百日咳疫苗工艺主要是沿用日本的无细胞百日咳生产工 艺进行生产。工艺基本上包括大发酵罐培养细菌、硫酸铵沉淀、高盐浓度抽取、透析和蔗糖 梯度超离心等步骤，在生产过程中去除了百日咳菌体中的有害成分，提取纯化出有效抗原 PT和FHA部分（可能含有少量PRN和Agg)，使无细胞百白破疫苗在保持免疫原性的基础上 大大减少了副反应的发生。这种纯化方式简便快捷，但不能对无细胞百日咳疫苗的各组分 抗原精确定量，得到有效组分PT、FHA的含量不确定，且其纯度很难达到90%以上。
[0007] 欧美国家主要采用柱层析法分别纯化每个组分，按照一定比例配制成疫苗，成分 明确，纯度高。这种采用分别纯化的组分aPV，纯度达到90%以上，成分明确，副作用小。临 床观察显示，APV和DTaP在免疫效果上与百日咳全菌体疫苗相当，且副反应明显降低[田秀 梅，朱凤才，张艺飓，等.吸附无细胞百白破联合疫苗安全性观察[J].中国初级卫生保健， 2007,21(11) ：52-54]〇
[0008] 百日咳疫苗的生产过程中，传统的脱毒方法是采用甲醛或戊二醛和赖氨酸脱毒 法。用甲醛解毒的无细胞百日咳菌苗，经37°C处理后，大部分出现明显毒性逆转。戊二 醛是具有间臂作用的交联剂，可以自由的与毒素的两个结合位点或两个毒素分子结合，从 而形成稳定的结合物。赖氨酸可能有两方面的作用，其一是防止毒素分子间过度交联形成 凝块；其二是封闭残余活性醛基以终止脱毒作用，防止毒性逆转或脱毒过度而影响免疫原 性[刘德铮，肖詹蓉，李万臣，王兴宇，赵宝明，等.应用戊二醛对百日咳抗原进行解毒的研 究[J].生物制品学杂志，1990,3(4) :181-184]。戊二醛具有良好的脱毒效果，但是由于戊 二醛本身的交联作用，脱毒过程中的百日咳原液容易出现抗原凝集沉淀，使脱毒后的百日 咳原液不能除菌过滤，这在百日咳疫苗的生产工艺中是一个潜在风险。
[0009] CN87104279采用过氧化氢脱毒、EDTA、金属盐、硫酸铵共同脱毒，脱毒反应速率取 决于过氧化氢、EDTA和金属盐。该方法脱毒过程中EDTA还会与金属盐螯合，反应复杂不易 控制；同时由于缺乏抗聚集剂，在脱毒过程中蛋白质由于疏水作用聚集沉淀而不易除菌过 滤，产量低，不适合大规模工业化生产。
【发明内容】
[0010] 针对现有技术中的上述问题，本发明的目的是提供一种采用过氧化氢脱毒的无细 胞百日咳疫苗，以及包含该无细胞百日咳疫苗的联合疫苗，脱毒后的疫苗特异性毒性较低， 免疫原性较高。
[0011] 本发明的另一目的是提供采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，采用 过氧化氢作为脱毒剂，甘油作为抗聚集剂，尿素作为稳定剂，脱毒过程中不产生抗原凝集沉 淀，脱毒后可以除菌过滤，抗原回收率高。
[0012] 本发明的又一目的是提供制备上述无细胞百日咳疫苗的方法。
[0013] 为达上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0014] -种无细胞百日咳疫苗，包含百日咳鲍特氏杆菌（Bordetella pertussis)液体培 养物上清部分的PT抗原和FHA抗原以及百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体部分的PRN抗 原，其中所述PT抗原和FHA抗原采用过氧化氢作为脱毒剂进行脱毒。
[0015] 本发明还可采用以下技术方案进一步实现：
[0016] 所述的无细胞百日咳疫苗，其中，所述PT抗原和FHA抗原采用甘油作为抗聚集剂， 采用尿素作为稳定剂。
[0017] 所述的无细胞百日咳疫苗，其中，所述疫苗按照每剂含PT抗原10-40 yg、FHA抗原 5-40 y g、PRN抗原1-15 y g的抗原含量配制。
[0018] 本发明还提供了一种百日咳-白喉-破伤风联合疫苗，其中，所述联合疫苗的抗原 包括如权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗的抗原以及白喉类毒素和破伤风类毒素。
[0019] 所述的联合疫苗，其中，所述联合疫苗抗原的含量为每剂含PT抗原10-40 y g ;FHA 抗原5-40 y g ;PRN抗原1-15 y g ;白喉类毒素10-30Lf ;破伤风类毒素l-10Lf。
[0020] 本发明提供的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，采用过氧化氢分 别脱毒百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的PT抗原和FHA抗原，其具体包括如下步 骤：
[0021] a)置换纯化后的PT抗原和FHA抗原缓冲体系，采用摩尔浓度为20-200mmol/L的 磷酸盐、碳酸盐或醋酸盐作为缓冲盐水，将pH值调节到7. 0-9. 0 ;
[0022] b)将步骤a中置换缓冲体系后的抗原稀释至100-500 y g/ml ;
[0023] c)在步骤b稀释后的抗原中加入抗聚集剂甘油和稳定剂尿素，使甘油终体积浓度 达到10% (V/V)-60% (V/V)，尿素终摩尔浓度达到l-2mol/L;
[0024] d)在步骤c后加入终浓度为0. 5 % (W/V) -1. 5 % (W/V)的过氧化氢，将缓冲体系 pH 值调至 7. 0-9.0 ;
[0025] e)在20-40°C条件下，脱毒2-5小时；
[0026] f)通过透析或超滤方式去除过氧化氢，完成脱毒，除菌过滤。
[0027] 进一步的，所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步 骤a中采用超滤方式置换缓冲体系，采用浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲盐水，将体系pH 值调节为8.0。
[0028] 所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤b中的 抗原稀释至250 y g/ml。
[0029] 所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤c中甘 油终体积浓度为30% (V/V)，尿素终摩尔浓度为2mol/L。
[0030] 所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤d中PT 抗原脱毒加入过氧化氢终浓度为1. 〇% (W/V)，FHA抗原脱毒加入过氧化氢终浓度为0. 5% (W/V)，pH 均调至 8. 0。
[0031] 所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤e中脱 毒温度为37°C，PT抗原脱毒时间为4小时，FHA抗原脱毒时间为2小时。
[0032] 所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤f?中采 用超滤的方式去除过氧化氢。
[0033] 本发明还提供了一种制备无细胞百日咳疫苗的方法，采用柱层析法制备抗原，包 括如下步骤：
[0034] 1)将百日咳博德特氏菌经离心分离为上清部分和菌体部分；
[0035] 2)将步骤1中的上清部分经层析纯化分离得到PT抗原和FHA抗原；
[0036] 3)将步骤1中的菌体部分经热释放后经过层析纯化得到PRN抗原；
[0037] 4)将步骤2中的PT抗原和FHA抗原采用过氧化氢作为脱毒剂进行脱毒；
[0038] 5)将步骤3中的PRN抗原和步骤4中脱毒后的PT抗原和FHA抗原经0. 22 y m的 滤膜微孔过滤后，用铝佐剂分别吸附PT、FHA、PRN抗原；
[0039] 6)将步骤5