一种牛羊腐蹄病油乳剂疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种牛羊腐蹄病疫苗及其制备方法，具体涉及一种牛羊腐蹄病油乳剂 疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 腐蹄病（Foot rot)是反刍动物的一种常见病，在我国除在东北和西北及西藏、内 蒙奶牛的腐蹄病发病率相对较低外，其余地区尤其在南方，奶牛、山羊、绵羊腐蹄病广泛流 行，其发病率高达8%~20%，甚至30%~50%。由于不科学的饲养管理、不良的环境条 件、产后疾病、遗传等因素造成奶牛和绵羊蹄裂、蹄漏、蹄底或蹄踵溃疡等损伤，降低蹄部抵 抗力，最终引发病原菌感染，加重蹄部损伤。而且牛羊腐蹄病治愈率低、淘汰率高，治疗时间 长、药费高，治疗期用药导致废弃牛奶而导致经济损失严重。可见，牛羊腐蹄病是困扰奶牛、 羊养殖的严重问题。
[0003] 奶牛和羊腐蹄病的病原有多种，既有需氧菌又有厌氧菌及兼性菌，多数学者认 为牛和羊腐蹄病的主要病原是坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum)和柿瘤拟 杆菌（Bacteroides nodosus)，腐蹄病的发生主要是二者共同感染而引起的。其中，坏 死梭杆菌是牛羊腐蹄病的最重要病原，可引起多种器官化脓病变（如牛肝脓肿、人的 Lemierre's综合症、脑炎等疾病）和其他偶蹄动物的蹄部感染。坏死梭杆菌属于梭杆菌属 (Fusobacterium Knorr 1922)是一种多形性细菌，培养特性严格厌氧，Feldman等报道，在 14株从牛的肝脓肿分离出的坏死梭杆菌中，有4种不同的抗原群。
[0004] 目前，国内外预防牛、羊腐蹄病的发生主要是定期采用硫酸铜、硫酸锌、多聚甲醛 或福尔马林等药浴和定期修蹄，减少蹄部损伤等。治疗采用硫酸铜或碘包扎，全身注射抗生 素，但由于其蹄部一直接触地面，处于感染状态，治疗效果差。国外有商品灭活疫苗，但因为 腐蹄病病原复杂在不同地域使用效果差异大。油乳剂疫苗是国内外疫苗市场上产量最多 的灭活疫苗，其免疫性能稳定、生物安全性高、较小的免疫剂量和较少的免疫次数就能达到 延长免疫刺激时间，使机体获得足够的保护性抗体。而传统油乳剂疫苗在生产过程中将司 班-80加入白油中作为油相，吐温-80、硬脂酸铝加入抗原水溶液中作为水相，二者混合乳 化获得的油乳剂疫苗稳定性高，免疫后可获得持久的较高水平的免疫抗体；但是该油乳剂 疫苗粘度大，免疫注射引起的应激反应较大，可形成无菌性化脓灶，在接种部位出现肿胀、 硬结，或形成肉芽肿，免疫效果差；同时对动物肉制品质量也产生了不良的影响。由此可见， 硬脂酸铝含量、油相、水相，油相水相比例、剪切时间、自油的品质是影响油乳剂疫苗黏度的 重要因素，油乳剂疫苗存在着菌株大量培养困难、免疫效果以及引起的不良副反应等缺点。 因此，探索一种具有低粘度、良好稳定性、免疫效果好、副作用小的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗， 必将对牛、羊养殖业和我国畜牧业的健康发展具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有低粘度、良好稳定性、免疫效果好、 临床不良反应小、成本低的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗及其制备方法。
[0006] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种牛羊腐蹄病油乳剂疫苗，由油相 与水相按重量份比为1.5-3 : 1(优选2 : 1)，终浓度为0.005%~0.01% (优选1%)硫 柳汞溶液构成，其中，所述油相由高压灭菌的药用白油、10 %的Span-80白油混合液、10 % 的甘露醇单油酸酯白油混合液按照1.8~2.2 : 1 : 1(优选2 : 1 : 1)的比例构成；所 述水相将4%~7% (优选5. 7%)的蔗糖酯溶于含10%吐温80和10%聚氧乙烯蓖麻油 衍生物水溶液，然后与抗原溶液按照1:2. 5~3 (优选1:2. 8)的比例构成；所述抗原溶液是 将坏死梭杆菌经过坏死梭杆菌传代培养培养基传代，坏死梭杆菌扩大培养培养基放大培养 后，进行浓缩，灭活得到每毫升菌液菌数不低于4X K^CFU的菌液。
[0007] 进一步，所述坏死梭杆菌传代培养培养基为牛脑心浸液培养基；所述坏死梭杆菌 扩大培养培养基为改良心脑浸液培养基。
[0008] 本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种牛羊腐蹄病油乳剂疫苗的 制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)生产用种子的制备：采用坏死梭杆菌传代培养培养基先将坏死梭杆菌进行一 级种子繁殖，鉴定合格后，再进行二级种子繁殖得到二级种子；
[0010] (2)抗原溶液的制备：在发酵罐内的坏死梭杆菌扩大培养培养基中按培养基总量 的5~10 %接种二级种子培养，收获菌液，取样进行纯粹检验，应纯粹，同时作活菌计数，活 菌数应不低于4 X 109CFU ;然后菌液浓缩，使每毫升菌液菌数不低于4 X K^CFU ;再灭活；
[0011] ⑶油相的制备：将高压灭菌的药用白油、10%的Span-80白油混合液、10%的甘 露醇单油酸酯白油混合液按照1. 8~2. 2 : 1 : 1的比例混合，35~38°C水浴片刻，充分 摇匀，即得油相；
[0012] (4)水相的制备：将4%~7%的蔗糖酯溶于含10%吐温80和10%聚氧乙烯蓖麻 油衍生物水溶液，然后与抗原溶液按照1:2. 5~3的比例混匀，即得水相；其中，聚氧乙烯 蓖麻油衍生物是由不同量环氧乙烷和蓖麻油或氢化蓖麻油反应得到的一系列物质，两种主 要衍生物为聚氧乙烯35蓖麻油（EL-35)和聚氧乙烯40氢化蓖麻油（RH-40)，其HLB值为 13~15,主要应用于水不溶性药物或其他脂溶性药物的增溶剂和乳化剂，可防止溶血，并 能很快通过尿液排泄，中国药典未收载，收录于欧洲药典和美国药典。TW-80作为增溶剂、乳 化剂和稳定剂已收入多国药典，随着近年来药理学研究的深入，人们认识到吐温80是具 有一定生物和药理活性的物质，并与药物临床上出现的不良反应相关，并且浓度为4%时 有轻微的溶血作用。
[0013] (5)乳化：将油相与水相按重量份比为1. 5~3 : 1进行剪切10~15min后，在 终止前加入2 %硫柳汞溶液，使其最终浓度为0. 005 %~0. 01%。
[0014] 进一步，所述牛羊腐蹄病油乳剂疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0015] (1)种子的制备：将坏死梭杆菌接种于牛脑心浸液培养基中，在37~39°C厌氧培 养48小时，取样接种心脑浸液琼脂平板，37~39°C厌氧培养48~96小时，纯粹检验合格 后，作为一级种子；取一级种子接种于pH7. 6心脑浸液培养基，37~39°C厌氧培养36~48 小时，取样做纯粹检验，合格后作为二级种子；
[0016] (2)疫苗抗原溶液的制备：将发酵罐内的改良心脑浸液培养基预热至37~39°C， 按培养基总量的5~10%接种二级种子，37~39°C培养10小时；收获菌液，取样进行纯 粹检验，应纯粹，同时作活菌计数，活菌数应不低于4X 109CFU ;用0. 22 y m的中空纤维超滤 器将纯检合格的菌液浓缩，使每毫升菌液菌数不低于4X K^CFU ;调节培养液pH至6. 8~ 7. 2,按菌液总量的0. 3%加入甲醛溶液，置37°C灭活24小时，期间每隔6~8小时搅拌1 次；
[0017] (3)油相的制备：将高压灭菌的药用白油、10%的Span-80白油混合液、10%的甘 露醇单油酸酯白油混合液按照2 : 1 : 1的比例混合，37°C水浴片刻，充分摇匀，即得油 相；
[0018] (4)水相的制备：将5. 7%的蔗糖酯溶于含10%吐温80和10%聚氧乙烯40氢化 蓖麻油水溶液，然后与疫苗抗原溶液按照1:2. 8的比例混匀，即得水相；
[0019] (5)乳化：取油相2份放于胶体磨内，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完 后再以8000r/min搅拌10~15分钟，在终止搅拌前加入2%硫柳汞溶液，使其最终浓度为 0? 01%〇
[0020] 本发明通过培养基优化，筛选出坏死梭杆菌扩大培养的条件，降低了坏死梭杆菌 的培养成本；在疫苗乳化油相配方上，选用优质高效乳化剂蔗糖