专利名称：牛、羊腐蹄病的基因检测方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种牛、羊腐蹄病的基因检测方法及检测试剂盒，通过聚合酶链式反应(PCR)利用牛、羊病料样品检测牛、羊腐蹄病的方法和试剂盒。该方法是以牛、羊腐蹄病的主要病原节瘤拟杆菌的DNA检测为基础的一种方法和试剂盒，具高度敏感性和特异性。
背景技术：
腐蹄病是由节瘤拟杆菌(D.nodosus)为主要病原引起的急慢性传染病，目前发病率牛、羊在8％～25％，严重地区达到60％，流行于几十个国家和地区，导致生产性能严重下降。节瘤拟杆菌有不同的血清型，在全世界范围内分布不一，一个群体内可能有多个血清型存在，毒力型引起绵羊、牛发生腐蹄病，病愈后常留下极小的损伤。该菌离开动物组织后，不能在自然界长期生存，落入草地的D.nodosus即使湿度很大，也只能保持毒力数天；它仅存在于感染蹄，可在其中保持活力数月，这是腐蹄病难以消灭的原因之一。该病多呈慢性经过，药物和外科治疗收效甚微，但随着腐蹄病免疫防制研究的突破，针对该病流行型的全菌灭活苗和菌体亚单位疫苗推出并使用，有效的防制了腐蹄病的流行。
防治腐蹄病，节瘤拟杆菌的早期检测是一个重要环节，鉴于该菌导致机体发病经过缓慢，到机体产生抗体时，用琼扩、对流免疫电泳才能有效检测，但是往往会延误防治时机，另外一些蹄部疾病，如白线病、蹄尖溃疡、蹄叶炎和蹄冠炎等，极易和腐蹄病混淆，使腐蹄病监测和疫苗应用长期受到困扰。国内外针对节瘤拟杆菌16SRNA序列，纤毛基因序列检测和分型工作已见报道，依据病原外膜蛋白的基因序列设计通用引物扩增，扩增片段进行酶切，用电泳分析序列长度多态性鉴定菌株血清型的PCR-RFLP方法也被报道过。University ofSydney的Dhungyel OP等发现各血清型纤毛基因序列的保守区，LincolnUniversity，U.S.A的Zhou Huitong等设计的单管多联PCR引物来扩增血清型的可变区，结合反向斑点杂交技术可确定亚型。而用针对病原遗传物质的PCR检测方法灵敏度高，在严格控制交叉污染条件下可实现病原菌的早期检测，也可准确对病原分型为腐蹄病预防提供免疫依据。由于纤毛蛋白是菌体的主要保护性抗原，是血清型分群的依据，因而针对纤毛开展的工作最多，已有大量的纤毛基因序列被测序和注释，对纤毛基因展开分子生物学研究。因此我们利用已知纤毛基因序列，经相似性序列比对，找出相似性高的序列并归类，用每类保守区段设计引物，最终特异检测病料中的节瘤拟杆菌。
发明内容
本发明的目的在于提供牛、羊腐蹄病的基因检测方法及检测试剂盒，是通过聚合酶链式反应即PCR方法检测生物学样品中的节瘤拟杆菌(D.nodosus)。我们根据节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的高度保守序列设计两对(3条)特异性引物，建立了聚合酶链式反应(PCR)检测方法，达到准确、快速诊断腐蹄病，使腐蹄病和其他蹄病区分开来，并从而指导疫苗和药物应用。
本发明的技术方案是这样实现的牛、羊腐蹄病的基因检测方法包括用于扩增节瘤拟杆菌纤毛蛋白的特异性引物，即FP5’TAATGAAAGGCRTCAGGCAACTGACTC3’DHRP5’CATITGTCCAGTTTCTGACATAACGCG3’RP5’ACGAGCGATGTAGTCGTTRTATGCAGG3’
其中R选自A或G或A和G。
具体的方法通过以下步骤来完成1.收集并处理待检样品；2.将第1阶段中的样品提取细菌DNA；3.用上述特异性引物扩增(2)中的DNA某一特异片段；4.通过电泳方法分离(3)中的扩增产物；5.对阶段4中的扩增产物进行检测；6.确定是否是节瘤拟杆菌感染，如果是，确定为I亚群，I亚群包括A、B、C、E、F、G、I型或II亚群，II亚群包括D、H型。
具体的步骤包括(1)样品采集在怀疑患病的牛羊蹄部，剔除脓汁及污物，用121℃30分钟灭菌拭子刮取蹄叉，将拭子放入灭菌小管中，备用。
(2)模板的采集病料悬液，自然沉淀5分钟，2000转/分离心3分钟，4000转/分离心1分钟，吸取上清液，10000转/分离心5分钟，弃上清液，沉淀加入STE，混匀10000转/分离心5分钟洗三次；弃上清液，沉淀加入2倍TE1％TritonX-100或TE配制的1％TritonX-100混匀煮沸15～20分钟，或用TE配制的1％TritonX-100混匀煮沸10分钟，加入蛋白酶K50ug/ml在56℃消化20分钟，再煮沸10分钟，4000/分离心5分钟，取上清液中层作模板；(3)聚合酶链式反应25ul，30ul，50ul反应体系MgSO40.2～0.25mM，引物0.2～0.3uM，50ul体系Taq聚合酶1.5～1.75U，30ul体系Taq聚合酶1U，25ul体系Taq聚合酶0.8U，MgSO40.2～0.25mM，用带有(NH4)2SO4的反应缓冲液。95℃2分钟；94℃35秒，60℃-0.2℃/循环30～40秒，70℃30～35秒，25循环；70℃5分钟。
(4)结果判断节瘤拟杆菌(D.nodosus)A型、B型、C型、E型、F型、G型、I型PCR反应扩增条带约185bp(I亚群)。D型、H型PCR反应扩增条带224bp(II亚群)。
为了方便上述的PCR检测，特制成了一种牛、羊腐蹄病的检测试剂盒，该试剂盒包含有下述的试剂(1)进行PCR扩增的所有必需试剂即特异性引物，模板DNA，4种三磷酸腺苷混合物，MgSO4，(NH4)2SO4反应缓冲液，PCR反应管，PCR反应液，琼脂糖(Agarose)，溴化乙锭，溴酚兰点样缓冲液，Taq酶，阳性对照，阴性对照，液体石蜡等；(2)进行PCR扩增所有的条件指标即特异性引物0.2～0.3uM，模板DNA 1～2ug，4种三磷酸腺苷混合物20mM，50ul体系taq聚合酶1.5～1.75U，30ul体系taq聚合酶1U，25ul体系taq聚合酶0.8U，MgSO40.2～0.25mM，10×(NH4)2SO4的反应缓冲液2～5ul。
PCR扩增95℃2分钟；94℃35秒，60℃-0.2℃/循环30～40秒，70℃30～35秒，25循环；70℃5分钟。
为了更好的说明用PCR方法进行腐蹄病检测的效果，下面结合附图和实验例来进一步的说明实验例1如图3所示，是30～50000个F型标准菌株DNA扩增获得的电泳图谱。DZ道阴性对照(无细菌)；F5道30个细菌；F4道50个细菌；F3道500个细菌；F2道5000个细菌；F1道50000个细菌；M道分子量标准；具有极高的敏感性。
实验例2如图4所示，PCR扩增温度中不同的亚群的温度选择均不相同，H型细菌PCR扩增延伸温度的选择、I+D型细菌PCR扩增延伸温度的选择。H7道H型细菌延伸温度57℃；H8道H型细菌延伸温度58℃；H9道H型细菌延伸温度57℃C；H0道H型细菌延伸温度60℃；H1道H型细菌延伸温度61℃；H2道H型细菌延伸温度62℃；H3道H型细菌延伸温度63℃；M道分子量标准；+7道I+D型细菌延伸温度57℃；+8道I+D型细菌延伸温度58℃；+9道I+D型细菌延伸温度59℃；+0道I+D型细菌延伸温度60℃；+1道I+D型细菌延伸温度61℃；+2道I+D型细菌延伸温度62℃；+3道I+D型细菌延伸温度63℃；实验例3如图5、6所示证明PCR方法检测腐蹄病的特异性，图5中直接以牛、羊、鹿圈泥和鲜粪直接取样。Nn道牛圈泥直接PCR电泳序列；Yn道羊圈泥直接PCR电泳序列；Ln道鹿圈泥直接PCR电泳序列；Nf道牛粪样直接PCR电泳序列；Yf道羊粪样直接PCR电泳序列；Lf道鹿粪样直接PCR电泳序列；dz道对照；M道分子量标准；A道A型节瘤拟杆菌；C道C型节瘤拟杆菌；E道E型节瘤拟杆菌；F道F型节瘤拟杆菌；G道G型节瘤拟杆菌；I道I型节瘤拟杆菌；D道D型节瘤拟杆菌；H道H型节瘤拟杆菌；DZ道对照；WN道产气荚膜梭菌A型(牛源)标准株；WY道产气荚膜梭菌A型(羊源)标准株；BX道变形杆菌标准株；W1道牛产气荚膜梭菌；W2道牛产气荚膜梭菌；W3道羊产气荚膜梭菌；M道标准分子量；Hs道A型坏死杆菌；Hs1道B型坏死杆菌；Hs2道AB型坏死杆菌；TL道铜绿假单胞菌；YQ道人牙垢分离物；39道节瘤拟杆菌；39′道节瘤拟杆菌2次PCR产物；
实验例4如图7所示的证明PCR方法检测腐蹄病的符合性，N1道牛圈泥厌氧培养物；N2道牛粪厌氧培养物；Y1道羊圈泥厌氧培养物；Y2道牛粪厌氧培养物；L1道鹿圈泥厌氧培养物；L2道鹿粪厌氧培养物；M道标准分子量；39道患病羊病料；E道E型节瘤拟杆菌标准株；42道患病羊病料；50道患病牛病料；D道D型节瘤拟杆菌标准株；本发明的积极效果在于用PCR方法检测腐蹄病具有较高的敏感性。从对30～50000个F型标准菌株DNA进行PCR可以确认，从30～50000个细菌均能检测出细菌的存在；PCR扩增温度的选择证明从57℃～63℃PCR方法检测腐蹄病的效果没有变化；从图5、图6证明PCR方法具有特异性；图7证明PCR方法检测腐蹄病和其他检测方法的符合性。
本方法检测快速，可以快速获得准确的结果。
图1显示扩增的节瘤拟杆菌保守的DNA序列(I亚群A、B、C、E、F、G、I型)。红色粗体为本发明所述特异性引物位置；图2显示扩增的节瘤拟杆菌保守的DNA序列(II亚群D、H型)。红色粗体为本发明所述特异性引物位置；图3证明PCR方法检测腐蹄病的敏感性图表；图4PCR扩增温度的选择图表；图5证明PCR方法检测腐蹄病的特异性图表；图6证明PCR方法检测腐蹄病的特异性图表；图7证明PCR方法检测腐蹄病的符合性图表；
具体实施例方式下面结合具体的检测实施例对本发明做进一步的描述实施例1(1)样品采集在怀疑患病的牛羊蹄部，剔除脓汁及污物，用121℃30分钟灭菌拭子刮取蹄叉，将拭子放入灭菌小管中，备用。
(2)模板的采集病料悬液，自然沉淀5分钟，2000转/分离心3分钟，4000转/分离心1分钟，吸取上清液，10000转/分离心5分钟，弃上清液，沉淀加入STE，混匀10000转/分离心5分钟洗三次；弃上清液，沉淀加入2倍TE1％TritonX-100或TE配制的1％TritonX-100混匀煮沸15～20分钟，或用TE配制的1％TritonX-100混匀煮沸10分钟，加入蛋白酶K50ug/ml在56℃消化20分钟，再煮沸10分钟，4000/分离心5分钟，取上清液中层作模板；(3)聚合酶链式反应25ul，30ul，50ul反应体系MgSO40.2～0.25mM，引物0.2～0.3uM，50ul体系Taq聚合酶1.5～1.75U，30ul体系Taq聚合酶1U，25ul体系Taq聚合酶0.8U，MgSO40.2～0.25mM，用带有(NH4)2SO4的反应缓冲液。95℃2分钟；94℃35秒，60℃-0.2℃/循环30～40秒，70℃30～35秒，25循环；70℃5分钟。
(4)结果判断节瘤拟杆菌(D.nodosus)A型、C型、E型、F型、G型、I型PCR反应扩增条带约185bp(I亚群)。
实施例2(1)样品采集在怀疑患病的牛羊蹄部，剔除脓汁及污物，用121℃30分钟灭菌拭子刮取蹄叉，将拭子放入灭菌小管中，备用。
(2)模板的采集病料悬液，自然沉淀5分钟，2000转/分离心3分钟，4000转/分离心1分钟，吸取上清液，10000转/分离心5分钟，弃上清液，沉淀加入STE，混匀10000转/分离心5分钟洗三次；弃上清液，沉淀加入2倍TE1％TritonX-100或TE配制的1％TritonX-100混匀煮沸15～20分钟，或用TE配制的1％TritonX-100混匀煮沸10分钟，加入蛋白酶K50ug/ml在56℃消化20分钟，再煮沸10分钟，4000/分离心5分钟，取上清液中层作模板；(3)聚合酶链式反应25ul，30ul，50ul反应体系MgSO40.2～0.25mM，引物0.2～0.3uM，50ul体系Taq聚合酶1.5～1.75U，30ul体系Taq聚合酶1U，25ul体系Taq聚合酶0.8U，MgSO40.2～0.25mM，用带有(NH4)2SO4的反应缓冲液。95℃2分钟；94℃35秒，60℃-0.2℃/循环30～40秒，70℃30～35秒，25循环；70℃5分钟。
(4)结果判断节瘤拟杆菌(D.nodosus)D型、H型PCR反应扩增条带224bp为II亚群。
权利要求
1.牛、羊腐蹄病的基因检测方法，包括用于扩增节瘤拟杆菌纤毛蛋白片段的特异性引物，即FP5’TAATGAAAGGCRTCAGGCAACTGACTC3’DHRP5’CATTTGTCCAGTTTCTGACATAACGCG3’RP5’ACGAGCGATGTAGTCGTTRTATGCAGG3’根据D.nodosus的纤毛蛋白基因序列，设计三条引物FP、DHRP、RP(2对，FP是上游公用引物)，上游引物在D.nodosus位于纤毛蛋白基因起始密码子上游一段非必需序列中，下游引物位于纤毛蛋白基因内。
2.根据权利要求1所述的牛、羊腐蹄病的基因检测方法，其特征在于所述的特异性引物FP5’TAATGAAAGGCRTCAGGCAACTGACTC3’RP5’ACGAGCGATGTAGTCGTTRTATGCAGG3’中的R选自A或G或A和G。
3.根据权利要求1所述的牛、羊腐蹄病的基因检测方法，其特征在于，它的检测步骤如下(1)收集并处理待检样品；(2)将第1阶段中的样品提取细菌DNA；(3)用上述特异性引物扩增(2)中的DNA某一特异片段；(4)通过电泳方法分离(3)中的扩增产物；(5)对阶段4中的扩增产物进行检测；(6)确定是否是节瘤拟杆菌感染，如果是，确定为I亚群，I亚群包括A、B、C、E、F、G、I型或II亚群，II亚群包括D、H型。
4.根据权利要求2所述的牛、羊腐蹄病的基因检测方法，其特征在于，具体的检测步骤具体如下(1)样品采集在怀疑患病的牛羊蹄部，剔除脓汁及污物，用121℃30分钟灭菌拭子刮取蹄叉，将拭子放入灭菌小管中，备用。(2)模板的采集病料悬液，自然沉淀5分钟，2000转/分离心3分钟，4000转/分离心1分钟，吸取上清液，10000转/分离心5分钟，弃上清液，沉淀加入STE，混匀10000转/分离心5分钟洗三次；弃上清液，沉淀加入2倍TE1％TritonX-100或TE配制的1％TritonX-100混匀煮沸15～20分钟，或用TE配制的1％TritonX-100混匀煮沸10分钟，加入蛋白酶K50ug/ml在56℃消化20分钟，再煮沸10分钟，4000/分离心5分钟，取上清液中层作模板；(3)聚合酶链式反应25ul，30ul，50ul反应体系MgSO40.2～0.25mM，引物0.2～0.3uM，50ul体系Taq聚合酶1.5～1.75U，30ul体系Taq聚合酶1U，25ul体系Taq聚合酶0.8U，MgSO40.2～0.25mM，用带有(NH4)2SO4的反应缓冲液。95℃2分钟；94℃35秒，60℃-0.2℃/循环30～40秒，70℃30～35秒，25循环；70℃5分钟。(4)结果判断节瘤拟杆菌A型、B型、C型、E型、F型、G型、I型PCR反应扩增条带约185bp是I亚群；D型、H型PCR反应扩增条带224bp是II亚群。
5.牛、羊腐蹄病的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含有下列的试剂(1)进行PCR扩增的所有必需试剂即特异性引物，模板，4种三磷酸腺苷混合物，MgSO4，(NH4)2SO4的反应缓冲液，PCR反应管，PCR反应液，琼脂糖(Agarose)，溴化乙锭，溴酚兰点样缓冲液，Taq酶，阳性对照，阴性对照，液体石蜡等；(2)进行PCR扩增所有的条件指标即特异性引物0.2～0.3uM，DNA模板1～2ug，4种三磷酸腺苷混合物20mM，50ul体系taq聚合酶1.5～1.75U，30ul体系taq聚合酶1U，25ul体系taq聚合酶0.8U，MgSO40.2～0.25mM，10×(NH4)2SO4的反应缓冲液2～5ul。PCR扩增95℃2分钟；94℃35秒，60℃-0.2℃/循环30～40秒，70℃30～35秒，25循环；70℃5分钟。
全文摘要
本发明涉及一种牛、羊腐蹄病的基因检测方法及检测试剂盒，通过聚合酶链式反应(PCR)利用牛、羊病料样品检测牛、羊腐蹄病的方法和试剂盒。根据节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的高度保守序列设计两对(3条)特异性引物，建立了聚合酶链式反应(PCR)检测方法，达到准确、快速诊断腐蹄病，并使腐蹄病和其他蹄病区分开来，从而指导疫苗和药物应用。
文档编号C12Q1/68GK1687452SQ200510016750
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月27日 优先权日2005年4月27日
发明者陈立志, 王克坚, 邵西群, 余兴龙, 刘晓颖, 苗利光, 张洪涛, 杨福合, 程世鹏, 徐敏, 刘艳环 申请人:陈立志