专利名称：中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法
技术领域：
本发明属于一种经济动物的输卵管分泌细胞培养方法，尤其是针对该种细胞的体外培养。
背景技术：
中国林蛙(Rana chensinensis David)俗称“哈士蟆”，是一种重要的药用两栖类经济动物，广泛分布于东北长白山脉及小兴安岭等地区，雌蛙的输卵管干制品即是闻名遐迩的“哈什蚂油”，是名贵的食疗性中药，内含多种饱和脂肪酸、氨基酸、维生素和微量元素，具有养阴润肺，补肾益精，健脑抗疲劳等功效。近些年来，由于大量捕捉，中国林蛙的资源遭到严重破坏，并且以其作为药用原料的需要也供不应求，不能满足及国内外市场的要求。
发明内容
本发明提供一种中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法，以解决目前为了取得雌蛙的输卵管干制品，而使中国林蛙的资源遭到严重破坏的问题。本发明采取的技术方案是一、输卵管分泌细胞的培养基的制备通过试验筛选到适合中国林蛙输卵管分泌细胞的基础培养基有DMEM/Ham’sF12、F10/DMEM、RPMI1640，将上述培养基每份溶于1000ml四馏水中，再补加抗生素其中青霉素10万单位/L、链霉素100mg/L，培养基用0.22μm滤膜滤过除菌，调整pH为7.4-7.6备用；条件培养基，包括作为营养物质的血清和添加的促生长类激素，其中新生牛血清为每100mL基础培养基中加入5～15ml，胰岛素为5～10mg/L基础培养基；10-6mol/L的雌二醇为5～10μl/ml基础培养基；二、输卵管分泌原代细胞的获取无菌采取输卵管，采用直接剪切法解离细胞，从而减小对细胞的损伤程度且为体外存活提供更好的前提条件；本发明采用直接剪切法的一重要实施方式案是用解剖针破坏脑脊髓处死林蛙，在无菌环境中，剪下中国林蛙雌性的排卵前期输卵管壶腹部至于灭菌的小平皿中，用含青链霉素的D-Hank’s液漂输卵管2～3次，洗去血污后分离、剪去周围粘连组织，于平皿中将输卵管纵向剪开，把剪开的输卵管进一步剪碎，经纱网滤过后800r/min离心10分钟，弃上清，沉淀部分再用基础培养液漂洗、离心细胞2次，弃上清液获得林蛙输卵管分泌原代细胞；三、输卵管分泌原代细胞的培养将获取得原代细胞加入含15％血清培养液制成细胞悬液，经台盼蓝染色行细胞计数，调整细胞浓度为2×105～5×105个/ml接种于6孔培养皿中，每孔加入细胞悬液3ml，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。每3～4天换一次培养液。
四、输卵管分泌细胞的传代培养待原代细胞长满单层后，即可进行传代，吸去培养皿中原培养液，用基础培养液洗涤细胞1-2次，洗去残留的血清成分。加0.125％-0.25％胰蛋白酶2ml，放入37℃温箱中消化5-10分钟，倒置显微镜下观察贴壁细胞收缩变圆即可吸去消化酶液，加入含15％血清终止液终止消化，弃终止液，加入基础培养液，吹打制成细胞悬液，调节细胞数为105～2×105个/ml接种于新培养皿中。根据细胞生长情况每2-3天换液，换液时注意留下1/4原培养液，完成一次传代。
通过试验确定林蛙输卵管分泌细胞的的传代培养宜在3-4代。
本发明的有益效果是针对中国林蛙输卵管的特殊药用价值和广泛的应用前景，本发明对中国林蛙的输卵管分泌细胞，进行原代与传代培养，并对其形态及生长增殖能力等生物学特性研究，成功地摸索出输卵管分泌细胞体外培养技术，为今后进一步研究林蛙输卵管分泌细胞的生长、分化代谢，各种激素、细胞因子对其作用提供理想的实验模型，为今后利用细胞工程技术生产林蛙输卵管分泌物质奠定基础。通过本发明寻找出适合林蛙输卵管分泌细胞的分离方法，将细胞从组织中分离出来；选择了适合林蛙输卵管分泌细胞的培养基用于培养，并摸索出一些营养物质的添加条件，确定了林蛙输卵管分泌细胞体外培养的条件培养基；实现了林蛙输卵管分泌细胞的体外的原代培养和传代培养，并采用免疫组化等方法对所得的细胞进行鉴定。
本发明的有益效果还包括，利用细胞工程等生物技术方法，在体外培养具有独特生物功能林蛙输卵管分泌细胞，为将来大量并获得“人工哈什蚂油”奠定技术基础，是为了更好地开发、应用及保护中国林蛙的天然资源，为保护生态平衡起促进作用
图1是林蛙输卵管分泌细胞的原代细胞照片，刚解离状态10×10。
图2是林蛙输卵管分泌细胞的原代细胞照片，培养24小时后状态10×10。
图3是林蛙输卵管分泌细胞的原代细胞照片，刚解离状态25×10。
图4是林蛙输卵管分泌细胞的原代细胞照片，培养24小时后状态25×10。
图5是林蛙输卵管分泌细胞的传代细胞照片，培养24小时后状态10×10。
图6是林蛙输卵管分泌细胞的免疫组化照片，胞浆着棕黄色、胞核着深蓝色10×10。
具体实施例方式
实施例1材料与仪器实验动物选用体重为0.1-0.15kg，产卵前的雌性中国林蛙，作为输卵管分泌细胞供体。
试剂胰蛋白酶(1∶250)、D-Hank’s、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；新生牛血清(NBS)、台盼蓝为Sigma公司产品，青、链霉素等为国产常规试剂。
仪器MCO-17AI型CO2培养箱(日本，SANYO公司)；CQIC型倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；SW-CJ-IF型超净工作台；细胞培养板(丹麦NUCO公司)。
一.林蛙输卵管分泌细胞培养基的配制将一份标准包装的RPMI1640培养基定溶于1000ml四馏水中，再补加抗生素，其中青霉素10万单位/L、链霉素100mg/L。充分混匀后培养基调整pH为7.4，用0.22μm滤膜滤过除菌后备用，林蛙输卵管分泌细胞条件培养液的配制在以RPMI-1640为基础培养液，添加该体积5％小牛血清、胰岛素5mg/L、浓度为10-6mol/L的雌二醇10μl/ml组成条件培养液。
二.林蛙输卵管分泌原代细胞的获取用解剖针破坏脑脊髓处死林蛙，蛙体用75％酒精浸泡在无菌环境中，剖腹取出输卵管，切取中间粗大盘曲较多的壶腹部，切除后立刻投入盛有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的低温D-hanks液中，漂洗输卵管2～3次，洗去血污后于平皿中将输卵管纵向剪开，把剪开的输卵管进一步剪碎，加入基础培养基反复吹洗组织碎块，吸取洗涤后的基础培养基，经纱网滤过后，1000r/min离心10分钟，弃上清，沉淀部分再用基础培养基漂洗、离心细胞2次，获得林蛙输卵管分泌原代细胞。(见图1)三.林蛙输卵管分泌原代细胞的培养将获取得原代细胞加入含15％血清培养液制成细胞悬液。经台盼蓝染色行细胞计数，调整细胞浓度为2×105个/ml接种于6孔培养皿(丹麦产Nunc)中，每孔加入细胞悬液3ml，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。每3～4天换一次培养液(见图2)。一直培养不进行传代，原代细胞能够存活20天左右。
四.林蛙输卵管分泌细胞的传代培养待原代细胞长成单层后，即进行传代。吸去培养皿中原培养液，用基础培养基洗涤细胞1次，洗去残留的血清成分，每孔加0.125％胰蛋白酶2ml，放入37℃温箱中消化10分钟，倒置显微镜下观察贴壁细胞收缩变圆即吸去消化酶液，加入含15％血清基础培养液2分钟终止消化，弃培养液，加入基础培养液，吹打制成细胞悬液，调节细胞数为2×105个/ml接种于新培养皿中，完成一次传代过程，传代培养共进行3代。
实施例2材料与仪器实验动物选用体重为0.1-0.15kg，产卵前的雌性中国林蛙，作为输卵管分泌细胞供体。
试剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、D-Hank’s、DMEM/Ham’sF12培养基购自美国Gibco公司；新生牛血清(NBS)、台盼蓝为Sigma公司产品，青、链霉素等为国产常规试剂。
仪器MCO-17AI型CO2培养箱(日本，SANYO公司)；CQIC型倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；SW-CJ-IF型超净工作台；细胞培养板(丹麦NUCO公司)。
一.林蛙输卵管分泌细胞培养基的配制将一份标准包装的DMEM/Ham’sF12培养基定溶于1000ml四馏水中，再补加抗生素，其中青霉素10万单位/L、链霉素100mg/L。充分混匀后培养基调整pH为7.5，用0.22μm滤膜滤过除菌后备用。
林蛙输卵管分泌细胞条件培养液的配制在以DMEM/Ham’sF12为基础培养液，添加其体积10％小牛血清、胰岛素8mg/L、浓度为10-6mol/L的雌二醇7μl/ml组成条件培养液。
二.林蛙输卵管分泌原代细胞的获取用解剖针破坏脑脊髓处死林蛙，蛙体用75％酒精浸泡在无菌环境中，剖腹取出输卵管，切取中间粗大盘曲较多的壶腹部，立刻投入盛有100IU/ml青霉素100μg/ml链霉素的低温D-hanks液中，漂洗输卵管2～3次，洗去血污后于平皿中将输卵管纵向剪开，把剪开的输卵管进一步剪碎，加入基础培养基反复吹洗组织碎块，吸取洗涤后的基础培养基，经纱网滤过后，1100r/min离心10分钟，弃上清，沉淀部分再用基础培养基漂洗、离心细胞2次，获得林蛙输卵管分泌原代细胞。
三.林蛙输卵管分泌原代细胞的培养将获取得原代细胞加入含15％血清培养液制成细胞悬液。经台盼蓝染色行细胞计数，调整细胞浓度为3×105个/ml接种于6孔培养皿(丹麦产Nunc)中，每孔加入细胞悬液3ml，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。每3～4天换一次培养液，一直培养不进行传代，原代细胞能够存活20天左右。
四.林蛙输卵管分泌细胞的传代培养待原代细胞长成单层后，即进行传代。吸去培养皿中原培养液，用基础培养基洗涤细胞1次，洗去残留的血清成分。每孔加入细胞解离剂0.02％EDTA-Na 3ml，放入37℃温箱中消化10分钟，倒置显微镜下观察贴壁细胞收缩变圆，收取细胞悬液，加入离心管中，1000r/min离心10分钟。弃上清，加入基础培养液洗涤2次，弃洗涤用基础培养液，加入条件培养基重悬细胞，轻轻吹打制成细胞悬液，调节细胞数为105个/ml接种于新培养皿中扩大培养，进行一次传代，传代培养共进行4代。
实施例3材料与仪器实验动物选用体重为0.1-0.15kg，产卵前的雌性中国林蛙，作为输卵管分泌细胞供体。
试剂胰蛋白酶、D-Hank’s、F10/DMEM培养基购自美国Gibco公司；新生牛血清(NBS)、台盼蓝为Sigma公司产品，青、链霉素等为国产常规试剂。
仪器MCO-17AI型CO2培养箱(日本，SANYO公司)；CQIC型倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；SW-CJ-IF型超净工作台；细胞培养板(丹麦NUCO公司)。
一.林蛙输卵管分泌细胞培养基的配制将一份标准包装的F10/DMEM培养基定溶于1000ml四馏水中，再补加抗生素，其中青霉素10万单位/L、链霉素100mg/L。充分混匀后培养基调整pH为7.6，用0.22μm滤膜滤过除菌后备用。
林蛙输卵管分泌细胞条件培养液的配制在以F10/DMEM为基础培养液，添加其体积15％小牛血清、胰岛素l0mg/L、浓度为10-6mol/L的雌二醇5μl/ml组成条件培养液。
二.林蛙输卵管分泌原代细胞的获取用解剖针破坏脑脊髓处死林蛙，蛙体用75％酒精浸泡在无菌环境中，剖腹取出输卵管，切取中间粗大盘曲较多的壶腹部，立刻投入盛有100IU/ml青霉素100μg/ml链霉素的低温D-hanks液中，漂洗输卵管2～3次，洗去血污后于平皿中将输卵管纵向剪开，把剪开的输卵管进一步剪碎，加入基础培养基反复吹洗组织碎块，吸取洗涤后的基础培养基，经纱网滤过后，1200r/min离心10分钟，弃上清，沉淀部分再用基础培养基漂洗、离心细胞2次，获得林蛙输卵管分泌原代细胞。
三.林蛙输卵管分泌原代细胞的培养将获取得原代细胞加入含l5％血清培养液制成细胞悬液。经台盼蓝染色行细胞计数，调整细胞浓度为5×105个/ml接种于6孔培养皿(丹麦产Nunc)中，每孔加入细胞悬液3ml，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。每3～4天换一次培养液。一直培养不进行传代，原代细胞能够存活20天左右。
四.林蛙输卵管分泌细胞的传代培养待原代细胞长成单层后，即进行传代。吸去培养皿中原培养液，用基础培养基洗涤细胞1次，洗去残留的血清成分。每孔加入0.25％胰蛋白酶2ml，放入37℃温箱中消化5分钟，倒置显微镜下观察贴壁细胞收缩变圆，收取细胞悬液，加入离心管中，1000r/min离心10分钟。弃上清，加入基础培养液洗涤2次，弃洗涤用基础培养液，加入条件培养基重悬细胞，轻轻吹打制成细胞悬液，调节细胞数为2×105个/ml接种于新培养皿中扩大培养，进行一次传代，传代培养共进行3代。
实验例1、林蛙输卵管分泌细胞的观察倒置显微镜下可见，刚刚分离的林蛙输卵管分泌原代细胞为卵圆形，，胞浆饱满，核圆大，呈悬浮状态(见图3)。细胞接种24小时后大都贴壁，伸展呈橄榄形，类似眼睛状(见图4)。传代细胞贴壁伸展快，约4～5d汇合成单层(见图5)，随着传代次数增加，细胞逐渐变为长梭形细胞。
2、林蛙输卵管分泌细胞的鉴定CD34是一种内皮细胞粘附分子，其结构属于免疫球蛋白超家族成员，是一种内皮细胞的表面标记物。抗CD34单克隆抗体对内皮细胞稳定性及敏感性都较强。用抗CD34单克隆抗体免疫组化试剂盒。按免疫组化染色方法按试剂盒内的说明进行，免疫细胞化学染色结果显示，输卵管分泌细胞阳性着色，其他细胞组织均未染色。输卵管分泌细胞对抗CD34单克隆抗体呈阳性反应，细胞浆被染成棕色或棕黄色，细胞核着深蓝色(见图6)，呈上(内)皮源性。
权利要求
1.一种中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法，包括下列步骤一、输卵管分泌细胞的培养基的制备包括基础培养基、条件培养基；选择适合中国林蛙输卵管分泌细胞的基础培养基有DMEM/Ham’sF12、F10/DMEM或RPMI1640，将上述培养基每份定溶于1000ml四馏水中，再补加抗生素其中青霉素10万单位/L、链霉素100mg/L，培养基用0.22μm滤膜滤过除菌，调整pH为7.4-7.6备用；条件培养基，包括作为营养物质的新生牛血清和添加的促生长类激素，其中新生牛血清为每100mL上述基础培养基中加入5～15ml，胰岛素为5～10mg/L基础培养基；10-6mol/L的雌二醇为5～10μl/ml基础培养基；二、输卵管分泌原代细胞的获取无菌采取输卵管，采用直接剪切法解离细胞，从而减小对细胞的损伤程度且为体外存活提供更好的前提条件；三、输卵管分泌原代细胞的培养将获取得原代细胞加入含15％新生牛血清培养液制成细胞悬液，经台盼蓝染色行细胞计数，调整细胞浓度为2×105～5×105个/ml接种于6孔培养皿中，每孔加入细胞悬液3ml，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养，每3～4天换一次培养液；四、输卵管分泌细胞的传代培养待原代细胞长满单层后，即可进行传代，吸去培养皿中原培养液，用基础培养液洗涤细胞1-2次，洗去残留的血清成分，加0.125％或0.25％胰蛋白酶2ml或0.02％乙二胺四乙酸二钠3ml，放入37℃温箱中消化5-10分钟，倒置显微镜下观察贴壁细胞收缩变圆即可吸去消化酶液，加入含15％血清终止液终止消化，弃终止液，加入基础培养液，吹打制成细胞悬液，调节细胞数为105～2×105个/ml接种于新培养皿中，完成一次传代。
2.根据权利要求1所述的中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法，其特征在于在步骤二输卵管分泌原代细胞的获取中，可采取用解剖针破坏脑脊髓处死林蛙，在无菌环境中，剪下中国林蛙雌性的排卵前期输卵管壶腹部至于灭菌的小平皿中，用含青链霉素的D-Hank’s液漂输卵管2～3次，洗去血污后分离、剪去周围粘连组织，于平皿中将输卵管纵向剪开，把剪开的输卵管进一步剪碎，经纱网滤过后1000-1200r/min离心10分钟，弃上清，沉淀部分再用基础培养液漂洗、离心细胞2次，弃上清液获得林蛙输卵管分泌原代细胞。
3.根据权利要求1或2所述的中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法，其特征在于在步骤四输卵管分泌细胞的传代培养中，传代培养宜在3-4代。
全文摘要
本发明涉及一种中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法，属于一种经济动物的输卵管分泌细胞体外培养方法。包括下列步骤输卵管分泌细胞的培养基的制备包括基础培养基、条件培养基；输卵管分泌原代细胞的获取输卵管分泌原代细胞的培养输卵管分泌细胞的传代培养。本发明的有益效果是针对中国林蛙输卵管的特殊药用价值和广泛的应用前景，确定了林蛙输卵管分泌细胞体外培养的条件培养基，实现了林蛙输卵管分泌细胞的体外的原代培养和传代培养，利用细胞工程等生物技术方法，在体外培养具有独特生物功能林蛙输卵管分泌细胞，能更好地开发、应用及保护中国林蛙的天然资源。
文档编号C12N5/06GK1670192SQ20051001661
公开日2005年9月21日 申请日期2005年3月9日 优先权日2005年3月9日
发明者刘景圣, 郑鑫 申请人:刘景圣, 郑鑫