重组人psp94蛋白在大肠杆菌中分泌表达的方法

专利名称：重组人psp94蛋白在大肠杆菌中分泌表达的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用大肠杆菌分泌表达有生物活性的人PSP94蛋白的方法。
背景技术：
前列腺癌是老年男性代表性疾病。1996年起美国前列腺癌的发病率已居男性恶性肿瘤的第一位，而死亡率仅次于肺癌位居癌症死亡第二位。因为，前列腺位置隐蔽，癌多发生在远离尿道的周边区，现代检测技术血清PSA检测难以满足早期诊断的需要，使很多患者失去治疗的机会。
迄今，我国临床前列腺癌仍是晚期才能诊断。1999年起，本课题组所在的“前列腺疾病防治研究中心”在中日政府间专项技术合作项目的援助下，应用血清PSA对长春市16500余名50岁以上男性进行了前列腺癌集团普查，前列腺癌的发现率超过1.7％。其中，中晚期病例占42％，伴有骨转移者占18.8％。我们认为PSA＞10.0ng/ml的可疑人群中PSA对前列腺癌诊断有明显的特异性。譬如，PSA含量＞40.0ng/ml的可疑人群中前列腺癌诊断率超过95％，而PSA＞20.0ng/ml的人群中诊断率超过75％。然而，在PSA含量≥4.0ng/ml-10.0ng/ml，所谓“灰色区”的可疑人群经超声引导下活检，前列腺癌的诊断率仅15％上下。因此，为提高PSA灰色区域的前列腺癌诊断效率，急需探索新的肿瘤标志物。
近年国内外的研究结果表明，前列腺上皮细胞合成分泌的一种含有94个氨基酸的蛋白，即PSP94，在治疗和监测前列腺癌进展方面具有良好的应用前景。因PSP94主要存在于前列腺液中，天然的PSP94很难大量获得。目前国内外对PSP94的表达多采用重组融合蛋白形式，这种融合表达虽然具有表达效率较高、蛋白降解较少等优点，但表达后需酶切或化学裂解去除融合蛋白，并且产生的蛋白以无活性的包涵体形式存在，需要体外变性再复性的过程，大大增加了产品下游的工作量。由于PSP94为多半胱氨酸蛋白，体外复性，难以形成正确的二硫键，所得蛋白的几乎无生物活性。
现有的蛋白分泌表达技术，是在载体编码信号肽序列的DNA下游连接多克隆位点。连入目的基因后，多克隆位点的DNA也翻译成氨基酸，从而有可能使表达的分泌蛋白失去生物活性，作为药物有可能引起人体的免疫反应，产生各种副作用。

发明内容
为了克服现有的PSP94表达后处理繁琐，工作量大，活性产品得率低的不足，本发明提供一种重组人PSP94蛋白在大肠杆菌中分泌表达的方法。通过对信号肽的基因突变，将酶切位点设计到信号肽内部，去除多克隆位点引起的多余氨基酸问题。重组蛋白直接分泌到杂蛋白较少的周质空间，不但避免了菌体内各种蛋白酶对重组蛋白的降解，增高了表达水平，易于纯化。而且在周质空间的氧化型环境下蛋白可以形成天然情况下的二硫键，直接得到具有天然结构的蛋白质，细胞学实验证明了其生物学活性。采用温控型表达，避免了使用诱导剂的成本。
本发明采用的技术方案是一、PSP94 cDNA的克隆扩增提取前列腺组织总RNA，通过RT-PCR方法钓取中国人PSP94cDNA序列，插入克隆载体pUC19中，PCR粗筛后进行序列测定；二、重组分泌型表达载体的构建将双酶切后的PSP94蛋白编码基因、信号肽和pBV220质粒进行连接，构建重组质粒pBV-PSP94；
三、重组PSP94蛋白表达阳性重组质粒pBV-PSP94分别转化大肠杆菌菌株，如JM109、HB101、LB21菌株，优选JM109表达效果最好，故PSP94蛋白选取JM109作为宿主菌进行表达，经摸索蛋白诱导表达最适温度为40℃，最佳表达时间为5小时。
步骤二信号肽采取经修饰过的天然白喉毒素信号肽。
步骤二经修饰过的天然白喉毒素信号肽为ES1为含EcoR I酶切位点的信号肽有意链引物5’-CGGAATTCGTGAGCAGAAAACT-3’ES25’-GATGC ATG CGC TGA AGG TGG GGC CCC TAT CCCCAG TAG CGC CCC TAT TAA GAT TGA CGC AAA CAG TTT TCTGCT CAC GAATTCCG-3’我们利用pBV220质粒作为表达载体，其含有受温度调控的强启动子PRPL。引入了改造的白喉毒素信号肽顺序。利用氨基酸密码字的兼并性，即利用基因编码多个密码子对应一种氨基酸的性质，在不改变氨基酸序列的前提下突变白喉毒素的信号肽的基因，将限制性内切酶位点SphI引入到信号肽序列内，便于PSP94基因的连接。利用RT-PCR技术从人前列腺组织中克隆人PSP94基因。采用PCR技术在PSP94蛋白编码基因的N端引入SphI位点。C端引入连接的限制性内切酶位点并设计了双终止密码子，可保证蛋白翻译的正确终止。经酶切，连入改造后含有白喉毒素信号肽顺序的载体。筛选具有插入基因的克隆质粒。优化表达的菌株和表达条件。利用半透膜的截留性质，分离纯化PSP94。采用SDS-PAGE电泳技术检验其纯度，细胞学实验验证其生物学活性。
本发明的有益效果是，通过分子生物学技术，突变分泌表达载体的信号肽，在信号肽上引入酶切位点，克服了传统分泌表达载体在表达的蛋白前添加多余氨基酸的问题，获得了一级结构与人PSP94天然蛋白完全相同的产物，使表达的PSP94在人体内没有免疫排斥反应，有可能成为新的抗前列腺癌的药物。重组得到的PSP94分泌型表达质粒可使表达的重组蛋白分泌到大肠杆菌周质空间中，避免了菌体内蛋白酶的降解作用，周质空间内含量极微的菌体本身蛋白又使得重组蛋白的分离纯化更加容易，并且周质空间中的氧化型环境还可以模拟真核细胞的内质网，形成天然PSP94蛋白中的二硫键，使蛋白空间结构更加接近天然状态。这种表达方式避免了传统的包涵体技术在菌体内表达蛋白后复杂的复性纯化过程，重组蛋白也具有更高的生物学活性。在得到分泌型重组蛋白的基础上，又通过活性验证证明，重组蛋白具有非常明显的抑制细胞增殖、促进细胞凋亡并使癌细胞良性转化的活性


图1、所示为RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，在480bp左右处可见到一条明显的条带，图2、重组质粒PCR验证结果图，在280bp左右处有一条明显DNA带，与PSP94蛋白编码基因长度一致。
图3、重组质粒DNA测序图，下划线部分为PSP94 cDNA序列，与预期结果完全相同。
图4、构建重组分泌型表达质粒pBV-PSP94流程图。
图5、重组质粒pBV-PSP220的PCR粗筛后电泳结果图。
图6、重组质粒pBV-PSP94的测序结果图。
图7、重组分泌型PSP94蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析。
图8、不同剂量PSP94处理48h后PC-3细胞的抑制率。
图9、PSP94处理不同时间对于PC-3细胞的抑制率。
图10、a，b部分，重组PSP94蛋白处理48h后PC-3细胞的形态学改变。
图11、PSP94处理后PC-3细胞DNA含量变化直方图。
图12、PBV220的物理图谱。
具体实施例方式
材料、菌株、细胞株和试剂所用人正常前列腺组织前列腺癌组织均由吉林大学临床医学院泌尿外科提供。
各种工具酶包括逆转录酶、限制性内切酶、连接酶、TaqDNA聚合酶为TaKaRa公司产品。
DNA凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司，蛋白定量试剂盒为Bio-Rad公司产品。
菌株E.coli JM109和质粒pUC19、pBV220由本实验室传代保存。E.coli JM109和质粒pUC19是可购买到的商品，关于pBV220本实施例中提供全序列和物理图谱。
PC-3细胞株由原北京医科大学泌尿外科研究所提供，已经可以购买到。
各种引物自行设计后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，分别包括RT-PCR扩增PSP94 cDNA的引物CP1和CP2；成熟PSP94蛋白基因引物EP1和EP2和信号肽序列ES1和ES2。
其它常规化学试剂为进口或国产分析纯产品。
实施例一、PSP94 cDNA的克隆扩增利用异硫氰酸胍一步法提取人正常前列腺组织总RNA，在引物Oligo(dT)15引导下，经AMV逆转录酶作用合成cDNA，再以CP1、CP2为引物PCR扩增PSP94 cDNA。
CP1(5’TTACTGATAGGCATGGCTAC-3’)
CP2(5’-TGCTTATCACAATGAATGTTCTCCTGGGG-3’)扩增产物凝胶回收后与经SmaI酶切的pUC19质粒连接，构建克隆质粒pUC-PSP94。连接产物转化感受态且E.coli JM109细菌，铺于含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的LB琼脂平板上，37℃倒置培养过夜后，选择白色菌落接种于含氨苄的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜后，用碱裂解法小量提取质粒，以EP1和EP2为引物扩增PSP94蛋白基因片段对阳性重组质粒进行粗筛，之后将选出的重组质粒送上海生工牛物工程技术服务有限公司进行序列测定。
EP1(5’-GCGCATGCATCATGCTATTTCATACCTAAT-3’)EP2(5’-CGGGATCCTTATCAGATTATCCATTCACT-3’)将测序证明为正确重组的pUC-PSP94质粒以EP1和EP2为引物扩增PSP94蛋白基因，经BamHI/SphI双酶切后，凝胶回收备用。
图1所示为RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，在480bp左右处可见到一条明显的条带，与PSP94 cDNA序列长度一致。
重组质粒PCR验证结果见图2，在280bp左右处有一条明显DNA带，与PSP94蛋白编码基因长度一致。重组质粒DNA测序结果见图3，下划线部分为PSP94 cDNA序列，与预期结果完全相同。说明我们克隆获得了正确的PSP94 cDNA序列。
二、重组分泌型表达载体的构建a.)信号肽序列的设计天然白喉毒素信号肽含25个氨基酸，DNA编码序列为GTG AGC AGA AAA CTG TTT GCG TCA ATC TTA ATA GGG GCGCTA CTG GGG ATA GGG GCC CCA CCT TCA 天然白喉毒素信号肽氨基酸序列的-1、-2和-3位，即氨基酸序列Ala-His-Ala构成信号肽酶的识别位点(编码碱基序列为GCCCATGCA，如方框内所示)，白喉毒素分泌到胞外后，信号肽酶将从此位点切去信号肽序列，只留下成熟蛋白质。
根据白喉毒素的天然序列，设计了以下分泌PSP94重组蛋白的信号肽序列ES1和ES2。
ES15’-CGGAATTCGTGAGCAGAAAACT-3’ES25’GATGC ATG CGC TGA AGG TGG GGC CCC TAT CCCCAG TAG CGC CCC TAT TAA GAT TGA CGC AAA CAG TTT TCTGCT CACGAATTCCG-3’上述信号肽引物中，ES1为含EcoR I酶切位点的信号肽有意链引物，ES2中下划线部分为白喉毒素信号肽全序列，与天然碱基序列惟一不同之处是在不影响编码氨基酸(丙氨酸)的前提下，将信号肽-3位氨基酸的密码子由GCC变为GCG。同时，这种改变还引入了Sph I酶切位点(GCATGC)，就将信号肽与PSP94编码基因连接的位点设计到信号肽序列内部，使得蛋白分泌到周质空间后信号肽完全被切除，避免了构建重组蛋白时接头处引起的多余氨基酸问题。
ES1和ES2在Klenow DNA聚合酶作用下，以dNTP为材料，室温延伸，产物经EcoRI/SphI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收备用。
b.)重组人PSP94分泌型表达质粒的构建质粒pBV220经BamHI/EcoRI双酶切后，与上述双酶切的PSP94蛋白基因产物及信号肽，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，构建重组分泌型表达质粒pBV-PSP94。构建流程如图4所示。pBV220质粒序列全长(3666bp)1aattcccggg gatccgtcga cctgcagcca agcttctgtt ttggcggatg agagaagatt61 ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct121 cccggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt181 agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ccaactgcca ggcatcaaat241 aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa
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三、重组PSP94蛋白表达a.)表达含阳性重组质粒pBV-PSP94及空的pBV220质粒的JM109菌种分别接种于100ml含氨苄的LB液体培养基中，31℃振荡培养，待菌液OD600达到0.6时，将温度调至40℃，继续培养5h。
b.)纯化及鉴定上述菌液在12000rpm、4℃离心10分钟收集菌体，弃去上清，沉淀悬于新配制的溶菌酶溶液中，冰浴10分钟，10,000rpm、4℃离心10分钟收集上清，即为周质空间部分，周质空间液依次通过透析(分子量为7000)和半透膜离心法(截留分子量为30KD)进行纯化，蛋白SDS-PAGE电泳结果见图7，含pBV-PSP94的菌株周质空间液在11kD左右处有一明显蛋白条带，与PSP94蛋白分子量一致，纯化后在电泳图上几乎表现为单一条带，密度分析表明纯化后的该条带可占纯化后总蛋白的93％，而含pBV220空质粒的细菌周质空间产物纯化后在11kD处几乎看不到条带，Western blotting结果表明所得蛋白为PSP94，重组蛋白表达量可达100mg/L。
实验例 本发明重组PSP94蛋白活性分析采用Bio-Rad Protein Assay对纯化后的重组蛋白进行定量，用RPMI-1640培养液将PSP94调成浓度分别为(1000，500，100，50，10，5，0)×10-4M，过滤除菌。
(1)MTT法测定将前列腺癌PC-3细胞浓度调至2×105/mL，接种于96孔平底培养板，每孔100μl。培养24小时后弃上清，各孔分别加入含不同浓度PSP94的培养液200μl，每组设3复孔，阴性对照为同期培养的相同浓度的仅含质粒pBV220的细菌周质空间上清纯化物。细胞培养44小时后，各孔分别加入新鲜配制的5μg/mLMTT，37℃温箱孵育4小时，弃去上清，分别加入100μl的DMSO，在37℃继续孵育4小时，在酶联检测仪上检测波长570nm处的吸光度(A)值。各组抑制率计算公式为抑制率(％)＝(对照组A平均值-实验组A平均值)/对照组A平均值×100％。
通过体外细胞增殖实验(MTT法)和流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析表明，重组的分泌型PSP94具有很强的生物活性，能以时间和剂量依赖性的方式对前列腺癌PC-3细胞产生生长抑制作用，如图8和图9所示，重组蛋白浓度1000ug/ml作用24小时，抑制率能达到50％以上，作用48小时后出现凋亡。相差显微镜下，对照组细胞贴壁生长，状况良好，多为梭形，大小适中，核仁清晰，可见核分裂相；PSP94作用细胞数量明显减少，形态不规则，细胞皱缩，颗粒增多，细胞碎片增加(图10)。以上结果表明rshPSP94具有抑制前列腺癌细胞增殖的活性。
(2)流式细胞技术检测对细胞周期的影响将PC-3细胞分成两组，实验组加入重细PSP94蛋白，终浓度为1×10-4M，对照组加入相同浓度的含空质粒的细菌周质空间上清产物。细胞培养24小时和48小时后，分别制成单细胞悬液，经碘化丙啶染色流式细胞仪分析，计算各细胞周期内细胞所占比例，分析细胞凋亡情况。
流式细胞仪分析PSP94对PC-3细胞周期的影响，结果见表1，10ug/ml作用细胞24小时后，细胞周期发生紊乱，表现为S、G2+M期细胞数减少，G1期细胞数明显增多，作用48小时后，G1期细胞数增加更为明显，占总细胞数的85％，表明细胞周期受抑，主要抑制在G1期。DNA含量分布如图11所示。G1峰前面出现亚2倍体峰，表明细胞出现凋亡(细胞凋亡时，DNA断裂生成小的DNA片段，从细胞内释放，导致亚2倍体峰出现)。
表1重组PSP94对PC-3M细胞周期的影响

▲▲P＜0.01，▲P＜0.05 vs Control
权利要求
1.一种重组人PSP94蛋白在大肠杆菌中分泌表达的方法，包括下列步骤一、PSP94cDNA的克隆扩增提取前列腺组织总RNA，通过RT-PCR方法钓取中国人PSP94cDNA序列，插入克隆载体pUC19中，PCR粗筛后进行序列测定；二、重组分泌型表达载体的构建将双酶切后的PSP94蛋白编码基因、信号肽和pBV220质粒进行连接，构建重组质粒pBV-PSP94；三、重组PSP94蛋白表达阳性重组质粒pBV-PSP94分别转化大肠杆菌菌株，如JM109、HB101、或LB21菌株，经摸索蛋白诱导表达最适温度为40℃，最佳表达时间为5小时。
2.如权利要求1所述重组人PSP94蛋白在大肠杆菌中分泌表达的方法中，步骤二信号肽采取经修饰过的天然白喉毒素信号肽。
3.如权利要求2所述重组人PSP94蛋白在大肠杆菌中分泌表达的方法中，步骤二经修饰过的天然白喉毒素信号肽为ES1为含EcoRI酶切位点的信号肽有意链引物5’-CGGAATTCGTGAGCAGAAAACT-3’ES25’-GATGC ATG CGC TGA AGG TGG GGC CCC TAT CCCCAG TAG CGC CCC TAT TAA GAT TGA CGC AAA CAG TTT TCTGCT CAC GAATTCCG-3’
4.如权利要求1所述重组人PSP94蛋白在大肠杆菌中分泌表达的方法中，步骤三含阳性重组质粒pBV-PSP94及空的pBV220质粒的JM109菌种分别接种于100ml含氨苄的LB液体培养基中，31℃振荡培养，待菌液OD600达到0.6时，将温度调至40℃，继续培养5h。
全文摘要
本发明涉及一种重组人PSP94蛋白在大肠杆菌中分泌表达的方法，属于采用大肠杆菌分泌表达有生物活性的人PSP94蛋白的方法。提取前列腺组织总RNA，通过RT－PCR方法钓取中国人PSP94 cDNA序列，插入克隆载体pUC19中，PCR粗筛后进行序列测定；将双酶切后的PSP94蛋白编码基因、信号肽和pBV220质粒进行连接，构建重组质粒pBV－PSP94；阳性重组质粒pBV－PSP94分别转化大肠杆菌菌株，蛋白诱导表达最适温度为40℃，最佳表达时间为5小时。本发明的有益效果是，通过分子生物学技术，突变分泌表达载体的信号肽，在信号肽上引入酶切位点，克服了传统分泌表达载体在表达的蛋白前添加多余氨基酸的问题。
文档编号C12N15/12GK1673377SQ20051001662
公开日2005年9月28日 申请日期2005年3月15日 优先权日2005年3月15日
发明者田长生, 高瑞娟, 李扬, 赵丹, 刘喜春, 赵雪俭 申请人:吉林大学