专利名称：腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂筛选模型的制备方法
技术领域：
本发明涉及腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂筛选模型的制备方法。
背景技术：
腺苷同型半胱氨酸水解酶(EC 3.3.1.1)是一个抗炎、抗病毒、抗肿瘤、治疗心脑血管疾病的重要靶酶。很多研究致力于利用调节它的活性进行药物设计，寻找合适的抑制剂，以求发现有价值的新药。目前已知的抑制剂只有腺苷类似物和铜离子(美国专利US4148888)，有待于寻找抑制强度适中，治疗作用明显副作用小有临床应用价值的抑制剂。分离和筛选新的抑制剂现有的方法是采用纯酶与靶物质作用，应用与DTNB发生显色反应来测定，过程复杂，一方面造成酶的浪费，另一方面中药提取物等天然物质往往有颜色，用这种筛选方法无法实现。
固定化酶是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能保持其原有的催化特性、并可以连续反应及重复使用。该技术广泛应用于化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等领域。固定化酶不但能保持游离酶的高效、专一及温和的酶催化反应特性，还呈现稳定性高、分离回收容易的特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂筛选模型的制备方法。
本发明根据固定化酶反应过程易于控制，产物溶液中没有酶的残留等特点，简化筛选过程，减少酶用量，用高通量筛选寻找酶的合适抑制剂，特别针对常规方法难以筛选的某些有色天然产物，以求发现有价值的新药。
一、模型建立过程本发明应用固定腺苷同型半胱氨酸水解酶，达到对该酶有抑制作用物质分离，固定腺苷同型半胱氨酸水解酶反应在0-10℃进行，所用试剂均0-10℃预冷；1)偶联取活化载体，离心，弃上清，用1mmol·L-1盐酸和pH＝7.4磷酸缓冲液或Tris-盐酸缓冲液各洗涤3-5次，加入一定量的腺苷同型半胱氨酸水解酶，混匀，50-200rpm振荡4-8小时，反应完毕后，离心，上清与封闭步骤中所得到的洗涤液合并，用于测定蛋白浓度，固定化酶的蛋白浓度＝加入的蛋白总浓度-上清中的蛋白浓度；2)封闭得到的沉淀用10-100mmol·L-1pH7.0-7.4的Tris-HCl缓冲液封闭过夜，离心，用10-100mmol·L-1pH8.0-8.5的Tris-HCl-NaCl和1-10mmol·L-1pH4-5的HAc-NaAc两种缓冲溶液轮流洗涤3-5次，得洗涤液；3)活化加入含有辅酶的磷酸缓冲液进行活化，室温放置1小时，再用pH7.0-7.4的10mmol·L-1磷酸缓冲液洗涤至上清280、340nm吸收值稳定；二、抑制剂筛选待筛选药物与固定化酶反应，测定腺苷同型半胱氨酸水解酶的活性判定该物质是否该酶的抑制剂；取500μL-1mLpH7.0-7.4的磷酸缓冲液中含不同浓度淫羊藿提取物及4μg酶蛋白的固定化酶，30-40℃温育30min，加Ado、Hcy至终浓度1mmol·L-1、4mmol·L-1，30-40℃水浴5-10min，5mol·L-1H2SO4中止反应，离心，HPLC检测上清液中腺苷同型半胱氨酸的含量，根据其含量变化反映样品对腺苷同型半胱氨酸水解酶活性的抑制程度，抑制率超过50％者可以确定为腺苷同型半胱氨酸水解酶的抑制剂。
模型相对活力测定利用水解方向反应检测固定后腺苷同型半胱氨酸水解酶活性，取含10μg蛋白的固定化和未固定化的腺苷同型半胱氨酸水解酶，加入10mmol·L-1磷酸缓冲液，pH7.4，缓冲溶液至115μL，25μL 2U的ADA，1μL终浓度100μmol·L-1的DTNB和50μL腺苷同型半胱氨酸，终浓度60μmol·L-1，混匀，37℃水浴5min，离心，上清液检测412nm的吸光度变化，以未固定化的腺苷同型半胱氨酸水解酶计算模型相对活力，在80％以上。
模型重复利用率检测取10μL固定化酶，同上测固定后腺苷同型半胱氨酸水解酶活性。沉淀用10mmol·L-1磷酸缓冲液洗涤后重新进行上述反应。重复上述过程10次。比较1，4，7，10次酶活性变化，计算模型重复利用效果。
本发明与NHS活化的Sepharose 4B FF结合的腺苷同型半胱氨酸水解酶活力增强，稳定性增加。具有便于保存，可重复利用等优点，可以作为高通量的药物筛选模型。能够排除有色物质的干扰，尤其对于天然产物和中药复方的筛选有重要意义。为抗病毒、抗癌药物的深入研究提供了新的思路、产品和技术方法。易于与反应物分开，及时中止反应，简化筛选程序。降低筛选成本，酶固定在基质上，与基质结合紧密，有利于维持活性并回收重复利用。
附图1.为腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂筛选模型相对活力测定结果，图中表明经过反应得到的相对酶活力皆在80％以上。
附图2.为腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂筛选模型重复利用曲线，从图中可以看出，改模型酶活性比较稳定，在10次使用过程中活性变化不大，说明该模型适于反复使用。
附图3，4为应用腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂模型筛选到的腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂的实例，抑制强度大于50％，说明淫羊藿总提取物和淫羊藿总黄酮是该酶的抑制剂。
具体实施例方式
实施例11)偶联反应在4℃进行，所用试剂均4℃预冷。取1mL异丙醇保存的NHS活化的Sepharose 4B，3000rpm离心5min，弃上清，用1mmol·L-1盐酸和pH7.4 10mmol·L-1Na2HPO4/NaH2PO4，1mmol·L-1EDTA缓冲液各洗涤3次，加入0.5mg·mL-1腺苷同型半胱氨酸水解酶1mL，混匀，200rpm振荡6小时。反应完毕后，3000rpm离心，上清与封闭步骤中所得到的洗涤液合并测定蛋白浓度(Bradford法)，固定化酶的酶蛋白浓度＝加入的蛋白总浓度-上清中的蛋白浓度。
2)封闭得到的沉淀用50mmol·L-1pH7.4的Tris-HCl缓冲液500μL封闭过夜，3000rpm离心，用50mmol·L-1pH8.0的Tris-HCl/1mmol·L-1NaCl和1mmol·L-1pH4.5的HAc-NaAc两种缓冲溶液轮流洗涤5次，得洗涤液。
3)活化加入含终浓度为0.5mmol·L-1氧化型辅酶I(NAD+)的10mmol·L-1pH7.4的磷酸缓冲液至终体积为1mL，室温放置1小时，再用10mmol·L-1pH7.4的磷酸缓冲液洗涤至上清280nm、340nm吸收值稳定。
测定中药淫羊藿提取物和淫羊藿总黄酮对应用上述方法得到的固定化酶对酶活性的抑制作用方法参见Bartel et al。250μL pH＝7.4磷酸缓冲液Na2HPO4/NaH2PO4，10mmol·L-1EDTA 1mmol·L-1中含不同浓度淫羊藿提取物及4μg固定化酶，37℃温育30min。加Ado、Hcy至终浓度1mmol·L-1、4mmol·L-1，终体积500μL，37℃水浴5min，5mol·L-1H2SO4中止反应，3000rpm离心5min。HPLC检测上清液中腺苷同型半胱氨酸含量，色谱条件4.6×25mm DiamonsilTMC18柱，A相0.1％三氟乙酸溶液，B相乙腈(色谱纯)，A∶B＝95∶5，流速1mL·min-1。进样20μl。根据样品中腺苷同型半胱氨酸的含量反映样品对腺苷同型半胱氨酸水解酶活性的抑制程度。附图3，4。
实施例21)偶联反应在4℃进行。取5mL异丙醇保存的NHS活化的Sepharose 4B，3000rpm离心5min，沉淀用1mmol·L-1盐酸和pH7.4的10mmol·L-1Tris-HCl，1mmol·L-1EDTA缓冲液各洗涤3次，加入0.5mg·mL-1腺苷同型半胱氨酸水解酶2mL，100rpm振荡4小时。反应完毕后，3000rpm离心，蛋白浓度测定方法与实施例1相同。
2)封闭得到的沉淀用50mmol·L-1pH7.4的Tris-HCl缓冲液2mL封闭过夜，2000rpm离心，用50mmol·L-1pH8.0的Tris-HCl/1mmol·L-1NaCl和1mmol·L-1pH4.5的HAc-NaAc两种缓冲溶液轮流洗涤5次，得洗涤液。
3)活化加入含终浓度为0.5mmol·L-1氧化型辅酶I(NAD+)的的10mmol·L-1Tris-HCl，1mmol·L-1EDTA缓冲液至终体积为5mL，室温放置2小时，再用不含酶的缓冲液洗涤至上清280nm、340nm吸收值稳定。与实施例1测定酶活力方法一致。
实施例31)偶联和封闭反应和实施例1相同，选用载体为异丙醇保存的NHS活化的Sepharose 6B。
3)活化加入终浓度为0.1mmol·L-1氧化型辅酶I(NAD+)的10mmol·L-1pH7.4的磷酸缓冲液至终体积为1mL，室温放置3小时，再用10mmol·L-1pH7.4的磷酸缓冲液洗涤至上清280nm、340nm吸收值稳定。与实施例1测定酶活力方法一致。
权利要求
1.一种腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂筛选模型的制备方法，其特征在于分以下步骤完成一、模型建立过程固定腺苷同型半胱氨酸水解酶反应在0-10℃进行，所用试剂在0-10℃预冷；1)偶联取活化载体，离心，弃上清，用1mmol·L-1盐酸和pH＝7.4磷酸缓冲液或Tris-盐酸缓冲液各洗涤3-5次，加入一定量的腺苷同型半胱氨酸水解酶，混匀，50-200rpm振荡4-8小时，反应完毕后，离心，上清与封闭步骤中所得到的洗涤液合并，用于测定蛋白浓度，固定化酶的蛋白浓度＝加入的蛋白总浓度-上清中的蛋白浓度；2)封闭得到的沉淀用10-100mmol·L-1pH7.0-7.4的Tris-HCl缓冲液封闭过夜，离心，用10-100mmol·L-1pH8.0-8.5的Tris-HCl-NaCl和1-10mmol·L-1pH4-5的HAc-NaAc两种缓冲溶液轮流洗涤3-5次，得洗涤液；3)活化加入含有辅酶的磷酸缓冲液进行活化，室温放置1小时，再用pH7.0-7.4的10mmol·L-1磷酸缓冲液洗涤至上清280、340nm吸收值稳定；二、抑制剂筛选待筛选药物与固定化酶反应，测定腺苷同型半胱氨酸水解酶的活性判定该物质是否该酶的抑制剂；取500μL-1mLpH7.0-7.4的磷酸缓冲液中含不同浓度淫羊藿提取物及4μg酶蛋白的固定化酶，30-40℃温育30min，加Ado、Hcy至终浓度1mmol·L-1、4mmol·L-1，30-40℃水浴5-10min，5mol·L-1H2SO4中止反应，离心，HPLC检测上清液中腺苷同型半胱氨酸的含量，根据其含量变化反映样品对腺苷同型半胱氨酸水解酶活性的抑制程度，抑制率超过50％者可以确定为腺苷同型半胱氨酸水解酶的抑制剂。
全文摘要
本发明属于一种酶抑制剂的筛选模型。腺苷同型半胱氨酸水解酶是一个抗炎、抗病毒、抗肿瘤、治疗心脑血管疾病的重要靶酶。调节酶的活性能治疗相关疾病，本发明旨在寻找合适的抑制剂，以求发现有价值的新药，应用腺苷同型半胱氨酸水解酶和活化的琼脂糖凝胶为基本原料，通过偶联方法，得到固定化酶，添加氧化型辅酶I(NAD
文档编号C12Q1/34GK1687449SQ20051001668
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月5日 优先权日2005年4月5日
发明者张晓宇, 杨晓达, 倪嘉缵 申请人:中国科学院长春应用化学研究所