专利名称：以犬Ⅱ型腺病毒为载体的猪病毒性传染病基因重组活疫苗及生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明旨在提供一系列以犬II型腺病毒为载体的猪病毒性传染病免疫用基因重组活疫苗及生产工艺，用于猪病毒性传染病疫苗的研制与生产，以预防猪病毒性传染病的发生和流行，属于动物传染病的预防和治疗技术领域。
背景技术：
猪瘟、流感、狂犬病、口蹄疫及猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻等猪的病毒性传染病不但严重危害养猪业的发展，每年因此造成的经济损失巨大，而且猪流感、狂犬病等人畜共患病的发生和流行，还严重威胁着人类的生命健康，因此对这些疫病的防制成为兽医工作的重点及研究热点。
对于猪病毒性传染病的防治，目前依然遵循“预防为主、治疗为辅”的原则，一种好的动物疫苗的研制与应用成为能否有效防制这些疫病的关键。目前用于猪的病毒性传染病防制的疫苗主要还是传统疫苗，即全病毒弱毒苗或灭活苗，如猪瘟弱毒冻干苗、猪狂犬病、口蹄疫灭活疫苗、猪传染性胃肠炎和流行性腹泻弱毒或灭活苗等。但这些疫苗都存在传统疫苗的缺点。
随着基因工程技术的出现，基因工程疫苗也如雨后春笋般相继问世。基因疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗、活载体疫苗等逐渐成为新型疫苗的代表。特别是病毒活载体疫苗，由于其只表达目的蛋白抗原，克服了弱毒疫苗毒力返祖及死苗灭活不确实的缺点，且其表达的蛋白是单一的保护性抗原，免疫效果确实，同时可以达到一次免疫预防多种疾病的作用，因此倍受研究人员青睐。
近年来，腺病毒载体系统作为哺乳动物细胞表达载体、重组疫苗和基因治疗载体已成为研究热点。腺病毒属于腺病毒科(Adenoviridae)，在自然界分布广泛，其宿主包括人、各种哺乳动物和禽类。根据宿主范围不同将腺病毒科分为哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)和禽类腺病毒(Aviadenovirus)两个属，两个属之间没有共同的群抗原。病毒基因组分成4个主要早期转录区和5个晚期转录区，在病毒的生命周期中，各区具有不同的作用，E1区(E1A和E1B)编码蛋白的主要作用是激活病毒其它基因的转录，对相关细胞基因的转录也有明显的调控作用；E2区(E2A和E2B)编码的蛋白的主要功能是调节病毒DNA的复制；E3区的基因产物与病毒在体内逃避宿主免疫系统对受病毒感染的细胞的清除作用有关；E4区基因产物参与病毒DNA的复制、晚期基因表达、RNA剪切和阻止宿主细胞生物合成等功能有关；晚期基因主要编码病毒结构蛋白。
犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)是哺乳动物腺病毒中致病性最强的一种，分为两型，犬I型腺病毒(CAV-1)即犬传染性肝炎病毒，引起犬传染性肝炎和狐狸脑炎；犬II型腺病毒(CAV-2)即犬喉气管炎病毒，引起犬的传染性喉气管炎和肠炎。人工接种可使豚鼠、浣熊和狼发生实验感染。
对于犬腺病毒目前多用CAV-2弱毒构建载体，不但遗传性状稳定而且十分安全。CAV-2具有与人腺病毒类似的优点如(1)它可以感染分裂细胞也可以感染静止细胞，感染细胞类型广泛。(2)可直接被运送到体内。(3)载体易于制备，滴度高，抵抗力强。(4)具有很大的克隆能力。
Klonjkowski等首次构建了含有报告基因LacZ的重组CAV载体，首先将CAV-2的E1区基因缺失，这不仅去除了其潜在的致瘤能力，而且扩大了CAV-2克隆外源基因的能力。
Mark D.Morrison等人构建了表达CPV VP2蛋白的重组CAV-1载体。Kremer等用CAV-2 Toronto A26/61株在E1反式互补细胞系中又构建了多个CAV-2载体。
Fischer(2002)等人经体外重组获得了具有复制能力的以CAV-2为载体分别含CDV H和F蛋白基因表达盒的重组病毒。
总之，腺病毒载体能高效表达外源基因并能对外源蛋白进行翻译后加工，如剪切、糖基化、磷酸化等，表达的蛋白具有天然蛋白的特性，可用于制药、基因工程疫苗、基因治疗以及肿瘤治疗等领域，已展现出良好的应用前景。重组腺病毒可以通过注射、口服、气管接种等途径进行免疫，接种动物不仅产生体液免疫和细胞免疫，而且还产生局部粘膜免疫应答，对预防呼吸道、消化道以及性传播疫病的感染具有极其重要的意义。近年来，无论是人腺病毒载体的进一步改进，还是动物腺病毒载体的发展，都将在控制人和动物传染性疾病，特别是病毒性传染病中以及人类的基因治疗中起越来越重要的作用。
发明内容
本发明旨在提供以犬II型腺病毒为载体的猪病毒性传染病基因重组活疫苗的生产工艺，用于猪病毒性传染病疫苗的研制与生产，以预防猪病毒性传染病的发生和流行，并通过对相关制品的应用，揭示其免疫预防效果。
本发明还公开了重组猪流感病毒HA基因腺病毒载体活疫苗。
本发明还公开了重组猪瘟病毒E2基因腺病毒载体活疫苗。
本发明还公开了重组猪AsiaI型口蹄疫病毒VPI基因腺病毒载体活疫苗。
本发明涉及的猪病毒性传染病基因重组活载体疫苗是以犬II型腺病毒(CAV-2)为载体，猪重要病毒性传染病病原保护性抗原基因为目的基因的病毒活载体疫苗。
E3区是腺病毒生长的非必需区，缺失或取代E3区的腺病毒在细胞上仍能生长。重组猪病毒性传染病病原保护性抗原基因的腺病毒是通过缺失腺病毒基因组部分E3区，同时置换上目的基因表达盒而完成的。其中目的基因表达盒含有巨细胞病毒(CMV)启动子和多聚A(polyA)结构。
本品为淡黄色中性冻干制剂，生产工艺包括以下步骤A.猪病毒性传染病保护性抗原基因的克隆通过PCR方法获得保护性抗原基因全长基因或含有抗原表位的序列，如HCV-E1、E2基因，FMDV-VP1、VP2、VP3、VP4基因，TGEV-S、N、M基因，PEDV-S、N、M基因，SIV-HA、NA基因，RV-G、N基因等。
B.重组质粒的构建将目的基因克隆入含有CAV-II全基因组的载体质粒中，重组质粒缺失了病毒基因组部分E3区。
a.通过PCR方法将CAV-2全基因组克隆入质粒pPoly2中，获得含有CAV-2基因组双末端的拯救质粒pPoly2-UD，经BstB I+HindIII酶切线性化后与CAV-2基因组DNA进行同源重组，获得CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV/2，其特征是含有CAV-2全基因组。
b.将经步骤A获得的猪病毒性传染病保护性抗原基因(Targetgene，Tg)经酶切及体外连接的方法克隆到真核表达载体pVAX中，获得真核表达质粒pVAX-Tg，其特征是含有目的基因表达盒，包括巨细胞病毒(CMV)启动子、目的基因和多聚A(polyA)结构。
c.将真核表达质粒pVAX-Tg与含有CAV-2基因组E3区片段的质粒pVAX-E3酶切后在体外连接，获得目的基因真核表达转移载体pVAXΔE3Tg，其特征是所含CAV-2基因组E3区部分基因被缺失。
d.真核表达转移载体pVAXΔE3Tg与CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV/2经酶切连接后获得含有目的基因表达盒的重组质粒pCAV-2/Tg，其特征是含有质粒pPoly2部分片段及缺失部分E3区的CAV-2基因组，其中E3区缺失部分由目的基因表达盒代替。
C.重组病毒的获得重组质粒经酶切线性化后转染敏感细胞(如MDCK、293等细胞)，通过细胞生物合成系统复制、包装获得重组病毒。
D.疫苗的制备将阳性重组病毒以敏感细胞增殖后，加入保护剂，并按国家有关要求制成冻干制品。
本发明的积极效果在于制备的重组病毒具有良好的遗传稳定性，以此病毒制备的疫苗免疫猪后，可诱导猪产生特异的抗病毒中和抗体，具有良好的免疫保护效果，无毒副作用，制品容易保存，便于运输，保质期限长，生产工艺简单，适合于工业化生产。
图1-1、重组克隆载体pMD18-THA构建策略。
图1-2、重组表达载体PVAXHA的构建策略。
图1-3、重组猪流感病毒HA基因腺病毒的获得及疫苗制备。
图2-1、含猪瘟病毒E2基因表达盒的质粒构建策略2-2、重组猪瘟病毒E2基因腺病毒获得及疫苗制备。
图3、重组猪AsiaI型口蹄疫病毒VPI基因腺病毒活载体疫苗制备工艺流程。图4-1、正常MDCK细胞(10×10)
图4-2、R-CAV-2/Tg病毒引起的MDCK细胞病变(10×10)图4-3、R-CAV-2/Tg病毒感染MDCK细胞的电镜超微结构(×40000)
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1重组猪流感病毒HA基因腺病毒载体活疫苗的制备按照附图1所示的工艺路线制备重组腺病毒活载体疫苗，重组病毒电镜下具有腺病毒的一般特征，感染MDCK细胞后，可出现特异细胞病变。见附图4。具体步骤如下1、PCR方法获得含有CAV-2基因组双末端的拯救质粒pPoly2-UD，经BstB I+Hind III酶切线性化后与CAV-2基因组DNA进行同源重组，获得CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV/2。
PCR引物P15′端GCG-TGC-CTA-ACT-ACA-AAC-TCA-AT5′端 G-CCT-GCT-GCT-TGA-TTT-TGT-GAT-CP25′端 A-CTC-ATA-GAA-GTA-GGC-AGC-TCC-G5′端 CAT-CAT-CAA-TAA-TAT-ACA-GGA-CAA-AG2、用RNA提取试剂盒提取猪流感病毒基因组RNA，操作方法见试剂盒说明书。
3、RT-PCR方法获得HA基因，片段长度为1707bp。其中RT用随机引物olig(dT)，
PCR上游引物GGATCCCATGGAGAGAATAGTGCTTCTTC下游引物CTCGAGTTAAATGCAAATTCTGCATTGTA方法向提取的总RNA中分别加10mM olig(dT)1ul混合，70℃水浴5min，取出置冰上，随后加5×RT-buffer 5ul，10mM dNTP 2.5ul，40U/ul RNA酶抑制剂1ul，9U/ulAMV反转录酶1ul，补加无RNA酶水至总体积25ul，于42℃保温1h进行反转录，即得到cDNA。70℃水浴10min，灭活反转录酶。取反转录产物10μL，10×PCRbuffer 4μL、25mmol/L MgCl24μL、上游引物(25pmol/μL)、下游引物(25pmol/μL)及10mmol/L dNTPs各0.5μL，加水30μL，煮沸变性10min，冰浴5min，加Taqplus DNA聚合酶0.25μL(5U/μL)混匀。具体反应条件扩增RGP基因为94℃变性30sec，52℃退火40sec、72℃延伸70sec，25个循环后72℃再延伸10min，最后冷却至4℃，结束反应。以1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。回收目的片段，装入T载体。
4、以内切酶BamH I和Xho I酶切HA基因及真核表达载体pVAX1，电泳回收，体外用T4连接酶16℃连接过夜，获得含有猪流感病毒HA的真核表达质粒pVAXHA。
5、将含有猪流感病毒HA的真核表达质粒pVAXHA与含有CAV-2基因组E3区片段的质粒pVAX-E3经Mlu I和Spe I酶切后在体外连接获得目的基因真核表达转移载体pVAXΔE3HA。
6、真核表达转移载体pVAXΔE3HA与CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV/2经Asc I+Cla I酶切连接后获得含有目的基因表达盒的重组质粒pCAV-2/HA。
7、重组质粒pCAV-2/HA经Asc I+Cla I酶切后转染MDCK细胞，复制包装获得重组病毒CAV-2/HA。
8、以重组病毒接种MDCK细胞，经转瓶悬浮培养增殖，至病毒TCID50达105-6个TCID50/0.1mL，加入明胶蔗糖作为保护剂，分装后(5mL/瓶)冻干。
为表明本发明在预防猪重要病毒性传染病方面的效果，下列试验给予证明CAV-2/HA病毒体外遗传稳定性试验将CAV-2/HA接种MDCK细胞进行传代培养，传至30代。分别对CAV-2/HA的第15代、30代培养物为模板，扩增HA表达盒核酸片段(在两侧含有E3区的部分序列)，进行测序。结果与对第五代培养物的测序结果一致。这表明CAV-2/HA在体外具有良好的遗传稳定性。
PCR引物上游5’-CAGTTCATTCCTAACTACGAC-3’下游5‘-CAAGTGGAAGTACCAAAGCTG-3’CAV-2/HA疫苗对猪的安全性试验随机取5头猪，用CAV-2/HA(1×105TCID50/ml)对其中的3头猪进行攻毒，口服5ml/头、肌注5ml/头，共10ml/头；另两头猪作为阴性对照，口服5ml生理盐水/头，肌注5ml生理盐水/头，共10ml/头。对实验猪进行隔离饲养，每天观察猪的精神、食欲、体温与粪便等临床变化情况，每隔3天进行一次白细胞总数计数。观察21d。在饲养观察期间未见攻毒猪体温升高、食欲减少、渴欲增加、沉郁、血便、咳嗽等感染症状，白细胞总数没有发生明显的波动。
CAV-2/HA疫苗对猪的免疫原性实验用CAV-2/HA免疫6头三月龄猪(抗CAV-2和SIV的HI抗体效价均小于1∶2)，肌注，剂量1×104TCID50/头，每间隔15d免疫1次，共免疫3次，免疫前和第3次免疫后15d采血制备血清，56℃30min灭活，-20℃冻存待检。用微量HI试验分别检测猪血清中抗CAV-2和SIV的HI抗体。免疫前，猪血清抗CAV-2和SIV的HI抗体效价均小于1∶2，免疫3次后，猪血清抗CAV-2抗体为1∶64～1∶128，抗SIV的HI抗体效价为1∶8～1∶16。
实施例2 重组猪瘟病毒E2基因腺病毒载体活疫苗的制备按照附图3所示的工艺路线制备制备重组腺病毒活载体疫苗，重组病毒电镜下具有腺病毒的一般特征，感染MDCK细胞后，可出现特异细胞病变。见附图4。具体步骤如下1、PCR方法获得含有CAV-2基因组双末端的拯救质粒pPoly2-UD，经PstI+Hind III酶切线性化后与CAV-2基因组DNA进行同源重组，获得CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV/2。
PCR引物P15′端GCG-TGC-CTA-ACT-ACA-AAC-TCA-AT5′端 G-CCT-GCT-GCT-TGA-TTT-TGT-GAT-CP25′端 A-CTC-ATA-GAA-GTA-GGC-AGC-TCC-G5′端 CAT-CAT-CAA-TAA-TAT-ACA-GGA-CAA-AG2、用RNA提取试剂盒提取猪狂犬病病毒基因组RNA，操作方法见试剂盒说明书。
3、RT-PCR方法获得E2基因，片段长度为1332bp。其中PCR上游引物5′-GGGGAATTCATGCAGCTAGCCTGCAA-3′下游引物5′-ATTGCGGCCGCTCAACCAGCGGCGAGTTG-3′方法向提取的总RNA中分别加25mM上游引物1ul混合，70℃水浴5min，取出置冰上，随后加5×RT-buffer 5ul，10mM dNTP 2.5ul，40U/ulRNA酶抑制剂1ul，9U/ulAMV反转录酶1ul，补加无RNA酶水至总体积25ul，于42℃保温1h进行反转录，即得到cDNA。70℃水浴10min，灭活反转录酶。取反转录产物10μL，10×PCRbuffer 4μL、25mmol/L MgCl24μL、上游引物(25pmol/μL)、下游引物(25pmol/μL)及10mmol/L dNTPs各0.5μL，加水30μL，煮沸变性10min，冰浴5min，加Taqplus DNA聚合酶0.25μL(5U/μL)混匀。具体反应条件扩增RGP基因为94℃变性30sec，57℃退火40sec、72℃延伸90sec，25个循环后72℃再延伸10min，最后冷却至4℃，结束反应。以1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。回收目的片段，装入T载体。
4、以内切酶PstI+EcoRI酶切HA基因及真核表达载体pVAX1，电泳回收，体外用T4连接酶16℃连接过夜，获得含有猪瘟病毒E2的真核表达质粒pVE2。
5、将含有猪瘟病毒E2的真核表达质粒pVE2经MluI+BbeI酶切、补平与含有CAV-2基因组E3区片段的质粒pVAXΔE3经SspI酶切、去磷后在体外连接获得目的基因真核表达转移载体pVAXΔE3/E2。
6、真核表达转移载体pVAXΔE3/E2与CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV2经MluI+BbeI酶切连接后获得含有目的基因表达盒的重组质粒pCAV-2/E2。
7、重组质粒pCAV-2/E2经Asc I酶切后转染MDCK细胞，复制包装获得重组病毒CAV-2/E2。
8、以重组病毒接种MDCK细胞，经转瓶悬浮培养增殖，至病毒TCID50达105-6个TCID50/0.1mL，加入明胶蔗糖作为保护剂，分装后(5mL/瓶)冻干。
为表明本发明在预防猪重要病毒性传染病方面的效果，下列试验给予证明CAV-2/E2病毒体外遗传稳定性试验将CAV-2/E2接种MDCK细胞进行传代培养，传至30代。分别对CAV-2/E2的第15代、30代培养物为模板，扩增E2表达盒核酸片段(在两侧含有E3区的部分序列)，进行测序。结果与对第五代培养物的测序结果一致。这表明CAV-2/E2在体外具有良好的遗传稳定性。
PCR引物上游5’-CAGTTCATTCCTAACTACGAC-3’下游5‘-CAAGTGGAAGTACCAAAGCTG-3’CAV-2/E2疫苗对猪的安全性试验随机取5头猪，用CAV-2/E2(1×105TCID50/ml)对其中的3头猪进行攻毒，口服5ml/头、肌注5ml/头，共10ml/头；另两头猪作为阴性对照，口服5ml生理盐水/头，肌注5ml生理盐水/头，共10ml/头。对实验猪进行隔离饲养，每天观察猪的精神、食欲、体温与粪便等临床变化情况，每隔3天进行一次白细胞总数计数。观察21d。在饲养观察期间未见攻毒猪体温升高、食欲减少、渴欲增加、沉郁、血便、咳嗽等感染症状，白细胞总数没有发生明显的波动。
CAV-2/E2疫苗对猪的免疫原性实验选用了断奶前27日龄仔猪共10头，肌肉接种猪瘟E2基因重组腺病毒活载体疫苗10ml/头。分别于免疫后0天、8天、16天、24天、32天、40天、48天对试验猪耳静脉采血，分离血清，使用猪瘟正向间接凝集诊断试剂盒，测定猪瘟抗体。结果表明，试验猪群在接种猪瘟疫苗后，猪瘟抗体在逐步升高，在免疫后16天左右，猪瘟抗体都达到最高值1∶64。之后，呈逐步下降趋势，在免疫后32-48天左右，试验猪群猪瘟平均抗体滴度依然可维持在1∶50。
实施例3 重组猪AsiaI型口蹄疫病毒VPI基因腺病毒载体活疫苗的制备按照附图3所示的工艺路线制备制备重组腺病毒活载体疫苗，重组病毒电镜下具有腺病毒的一般特征，感染MDCK细胞后，可出现特异细胞病变。见附图4。具体步骤如下1、用实施例1、2、3所述相同方法获得CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV2。
2、PCR方法从AsiaI型口蹄疫病毒PI全基因中获得VPI，PCR引物为上游引物5’-CCGGAATTCGCCATGGCTCGCCGGCAGACTACCAC-3’下游引物5’-CCGCTCGAGTTATAGCCTGTTTCTCGGGTGCAA-3’在上下游引物中分别加入酶切位点EcoRI、XhoI。
3、用EcoRI和XhoI分别双酶切PCR产物和真核表达载体pVAXI，电泳回收，连接，转化，摇菌，提质粒，酶切鉴定后获得重组质粒pVAX-VPI。
4、用MluI和SphI分别对pVAX-VPI、pVAXΔE3进行双酶切，电泳回收，去磷，补平，连接，获得含有目的基因的真核表达转移载体pVAXΔE3-VPI。其间需要对重组子进行正反鉴定。
5、用NruI和SalI对转移载体pVAXΔE3-VPI和pPoly2-CAV2进行双酶切，电泳回收，连接，获重组质粒pPoly2-CAV2/VPI。
6、用重组质粒转染MDCK细胞，出现典型的腺病毒病变，从而获得重组病毒CAV-2/VPI。
8、以重组病毒接种MDCK细胞，经转瓶悬浮培养增殖，至病毒TCID50达105-6个TCID50/0.1mL，加入明胶蔗糖作为保护剂，分装后(5mL/瓶)冻干。
为表明本发明在预防猪重要病毒性传染病方面的效果，下列试验给予证明CAV-2/VPI病毒体外遗传稳定性试验将CAV-2/VPI接种MDCK细胞进行传代培养，传至30代。分别对CAV-2/VPI的第15代、30代培养物为模板，扩增VPI表达盒核酸片段(在两侧含有E3区的部分序列)，进行测序。结果与对第五代培养物的测序结果一致。这表明CAV-2/VPI在体外具有良好的遗传稳定性。
PCR引物上游5’-CAGTTCATTCCTAACTACGAC-3’下游5‘-CAAGTGGAAGTACCAAAGCTG-3’
CAV-2/VPI疫苗对猪的安全性试验随机取5头猪，用CAV-2/VPI(1×105TCID50/ml)对其中的3头猪进行攻毒，口服5ml/头、肌注5ml/头，共10ml/头；另两头猪作为阴性对照，口服5ml生理盐水/头，肌注5ml生理盐水/头，共10ml/头。对实验猪进行隔离饲养，每天观察猪的精神、食欲、体温与粪便等临床变化情况，每隔3天进行一次白细胞总数计数。观察21d。在饲养观察期间未见攻毒猪体温升高、食欲减少、渴欲增加、沉郁、血便、咳嗽等感染症状，白细胞总数没有发生明显的波动。
CAV-2/VPI疫苗对猪的免疫原性实验选用了55日龄仔猪共8头，肌肉接种猪口蹄疫VPI基因重组腺病毒活载体疫苗5ml/头。分别于免疫后5天、15天、25天对试验猪耳静脉采血，分离血清，使用猪口蹄疫正向间接凝集诊断试剂盒，测定猪口蹄疫抗体。结果表明，试验猪群在55日龄时，体内母源抗体平均为1∶12，接种猪口蹄疫重组疫苗后，猪口蹄疫抗体逐步升高，在免疫后5天猪口蹄疫抗体可达1∶128，10后可达1∶512，15天后可达1∶1024。说明猪口蹄疫重组疫苗免疫55日龄仔猪5天后抗体水平即可达平均保护滴度以上，具有良好的免疫原性。
权利要求
1.一种以犬II型腺病毒为载体的猪病毒性传染病基因重组活疫苗。
2.根据权利要求1生产工艺生产的重组猪流感病毒HA基因腺病毒载体活疫苗。
3.根据权利要求1生产工艺生产的重组猪瘟病毒E2基因腺病毒载体活疫苗。
4.根据权利要求1生产工艺生产的重组猪AsiaI型口蹄疫病毒VPI基因腺病毒载体活疫苗。
5.以犬II型腺病毒为载体的猪病毒性传染病基因重组活疫苗的生产工艺，包括以下步骤A.猪病毒性传染病保护性抗原基因的克隆通过PCR方法获得保护性抗原基因全长基因或含有抗原表位的序列，所述基因选自HCV-E1、E2基因，FMDV-VP1、VP2、VP3、VP4基因，TGEV-S、N、M基因，PEDV-S、N、M基因，SIV-HA、NA基因，RV-G、N基因等；B.重组质粒的构建将目的基因克隆入含有CAV-II全基因组的载体质粒中，重组质粒缺失了病毒基因组部分E3区；a.通过PCR方法将CAV-2全基因组克隆入质粒pPoly2中，获得含有CAV-2基因组双末端的拯救质粒pPoly2-UD，经BstBI+Hind III酶切线性化后与CAV-2基因组DNA进行同源重组，获得CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV/2，含有CAV-2全基因组；b.将经步骤A获得的猪病毒性传染病保护性抗原基因经酶切及体外连接的方法克隆到真核表达载体pVAX中，获得真核表达质粒pVAX-Tg，含有目的基因表达盒，包括巨细胞病毒(CMV)启动子、目的基因和多聚A(polyA)结构；c.将真核表达质粒pVAX-Tg与含有CAV-2基因组E3区片段的质粒pVAX-E3酶切后在体外连接，获得目的基因真核表达转移载体pVAXΔE3Tg，所含CAV-2基因组E3区部分基因被缺失；d.真核表达转移载体pVAXΔE3Tg与CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV/2经酶切连接后获得含有目的基因表达盒的重组质粒pCAV-2/Tg，含有质粒pPoly2部分片段及缺失部分E3区的CAV-2基因组，其中E3区缺失部分由目的基因表达盒代替；C.重组病毒的获得重组质粒经酶切线性化后转染敏感细胞，通过细胞生物合成系统复制、包装获得重组病毒；D.疫苗的制备将阳性重组病毒以敏感细胞增殖后，加入保护剂，制成冻干制品。
6.根据权利要求5生产工艺生产的重组猪病毒载体活疫苗。
全文摘要
本发明提供一系列以犬II型腺病毒为载体的猪病毒性传染病免疫用基因重组活疫苗的生产工艺及制品，猪重要病毒性传染病病原保护性抗原基因为目的基因的病毒活载体疫苗，所述基因选自HCV－E1、E2基因，FMDV－VP1、VP2、VP3、VP4基因，TGEV－S、N、M基因，PEDV－S、N、M基因，SIV－HA、NA基因，RV－G、N基因等；本发明疫苗包括重组猪流感病毒HA基因腺病毒载体活疫苗、猪瘟病毒E2基因腺病毒载体活疫苗及重组猪AsiaI型口蹄疫病毒VPI基因腺病毒载体活疫苗，重组病毒具有良好的遗传稳定性，疫苗免疫猪后，可诱导猪产生特异的抗病毒中和抗体，具有良好的免疫保护效果，无毒副作用，制品容易保存，便于运输，保质期限长，工艺简单，适合于工业化生产。
文档编号C12N15/861GK1827172SQ200510016749
公开日2006年9月6日 申请日期2005年4月27日 优先权日2005年4月27日
发明者夏咸柱, 扈荣良, 张守峰, 高玉伟, 杨松涛, 王承宇 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所