专利名称：一种宿主细胞及其用于重组蛋白高效分泌表达的方法
技术领域：
本发明为一种用于重组蛋白高效分泌表达的芽孢杆菌宿主细胞。本发明中 的宿主细胞为通过微生物菌种选育获得的芽孢杆菌。本发明的宿主细胞可以满 足重组蛋白的高效合成并将合成的重组蛋白分泌到培养基中。本发明的宿主细 胞高效制备的重组蛋白为具有工业应用价值的酶，进一步为具有淀粉水解活性 的Ot-淀粉酶、植酸酶等大宗酶制剂。本发明属微生物学和发酵工程领域。
背景技术：
从自然界获得的重要蛋白质，如酶、生物活性多肽、药用蛋白等，由于在 自然条件下含量低，往往达不到商业开发价值，需要对其进行高效、低成本制 备。实现这些重要蛋白质的高效、低成本制备的主要方法之一是，通过基因克 隆技术，将这些重要蛋白质的编码基因在合适的表达宿主细胞中进行高效表达。 由此获得的基因表达产物，即为重组蛋白。
基因表达宿主细胞(简称宿主细胞)是指，从自然界获得的或通过实验室 操作获得的、能够满足特定基因的转录与翻译、并能将基因产物以一定形式和 一定水平生产出、并保证所表达出的基因产物具有原蛋白质相似生物学活性与 性能的生物体。
用于重组蛋白表达与制备的生物体可以是动物、植物或微生物。由于微生 物细胞具有生长速度快、营养要求简单、易于遗传操作以及最重要的一点是能 够进行大规模的人工培养，因此，微生物细胞是目前为止最主要的宿主细胞。
重组蛋白的分泌表达是指，重组蛋白的表达体系(表达载体与表达宿主细 胞)能够引导所表达的重组蛋白实现跨膜运输，重组蛋白被运送到细胞膜外并 被释放到培养环境(培养基)中。这就要求1)宿主细胞具有完善的蛋白分泌 与蛋白释放的能力与物质基础；2)所表达重组蛋白具有被宿主细胞蛋白分泌系 统所识别与加工的标识。前者毫无疑问由所采用的宿主细胞决定；后者则由重 组蛋白表达单元与宿主细胞共同决定。可见，实现重组蛋白分泌表达的决定性 因素是宿主细胞。目前，应用于重组蛋白表达的常用基因表达宿主细胞大肠杆 菌，仅有较弱的将重组蛋白分泌到其周质空间的能力，不能将其分泌到培养基 中。因此，必须通过细胞裂解过程释放重组蛋白。另外一种已实现多种工业应 用的宿主细胞为毕赤氏酵母，可以利用能够被其自身蛋白分泌识别系统所识别 的、来源于酿酒酵母的ot因子信号肽，引导重组蛋白的分泌。这是目前己报导的 较好的重组蛋白分泌表达系统，但对大多数来源于细菌的蛋白的表达能力明显有限。
作为重组蛋白表达的微生物宿主细胞可以是直接通过自然筛选，从自然界 中获得，也可以通过实验室技术改良现有微生物保藏物的若干生理、生化与遗 传性能获得。大肠杆菌及其衍生菌株(如大肠杆菌JM109)、酵母及其衍生菌株
(如毕赤氏酵母GS115)等都是目前常用的宿主细胞。大肠杆菌宿主细胞表达 重组蛋白的水平，可以达到菌体蛋白总量的30%以上(Terpe. Appl Microbiol Biotechnol，2006);缺点是重组蛋白以不溶状态(包涵体)存在于细胞内，需要 复杂的下游提取、纯化与复性等过程，才能制备出合格的重组蛋白。因此，大 肠杆菌宿主细胞一般仅适用于实验室研究目的和高附加值药用蛋白的生产目 的，不适用面广量大的工业酶制剂的生产。酵母宿主细胞表达重组蛋白的最高 水平可以达到10 mg/mL发酵液(Cregg JM, " Molecular Biotechnology, 2000)， 最大优点是能够在较高表达水平下，进行重组蛋白的分泌表达。不足之处是， 与其它所有宿主细胞一样，酵母宿主细胞不能满足绝大多数重组蛋白的高效、 分泌表达；另一个缺点是培养时间较长、生产过程中需要有害物质如甲醇的不 断诱导。因此，其它类型的微生物宿主细胞的研究仍然是具有重要价值，并且 在某种程度上是必需的。
除了上述描述的大肠杆菌和酵母宿主细胞，微生物宿主细胞的研究还包含 有枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌、 黑曲霉、米曲霉等。
具有工业应用属性的宿主细胞，特别是运用于满足高效率、低成本、规模 化生产要素的大宗工业酶制剂生产的宿主细胞， 一般应具有如下基本特征1) 生物安全性菌株(即所为General Regard As Safe， GRAS); 2)营养要求简单， 培养条件不复杂；3)具有较强蛋白合成与分泌能力；4)可以进行遗传操作并 且遗传稳定；5)可以进行大规模工业化培养与操作；6)产物分离容易；等。
在芽孢杆菌属中，解淀粉芽孢杆菌(Bacz7/^ amy/o^e/ac/e"4萎縮芽孢杆菌 (Bac/〃us afra/ /wews)， 地衣芽孢杆菌(5acz'〃M s //c/2emybr附z、), 短小芽孢杆菌 (Bacz7/w pwmz7w)和枯草芽孢杆菌CSa"7/1^ sw&,fc)传统上被认为是生理特征相 似的5个种，但通过DNA同源性分析，可以很容易将它们区分开来。地衣芽孢 杆菌与萎縮芽孢杆菌的DNA相似性大约为8%，与其亲缘关系最近的解淀粉芽 孢杆菌的DNA相似性在9-15%。 r-RNA小亚基序列可以将这5个种区分开来。 利用地衣芽孢杆菌的厌氧生长能力、精氨酸脱水酶生产、淀粉水解以及利用丙 酸为惟一碳源生长等特性，也可以将此与枯草芽孢杆菌区分开来。
地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性、内生芽孢、好氧型杆菌，广泛分布于自然界。 土壤是其最主要的栖息地，是营养贫瘠土壤的优势菌群。地衣芽孢杆菌也常常 存在于天然农业产品及其加工获得的食物中。地衣芽孢杆菌被公认为是非人类致病菌。地衣芽孢杆菌不同菌株间的性能存在较大不同，其中一些菌种已经育 种成功用于工业酶制剂、生物聚合材料、药物生物素等重大产品的工业化生产。
它的代表性菌株(实验菌株)ATCC14580(DSM13)的基因组已经得到解析(Veith B, ef a/. J Mol Biotechnol ， 2004 )。
1972年，地衣芽孢杆菌已被大规模应用于淀粉酶的发酵生产，1981年，《食 品化学品索引》(Food Chemicals Codex)将地衣芽孢杆菌列为食品加工用淀粉酶 和蛋白酶的来源。1981年，由地衣芽孢杆菌生产的淀粉水解酶和蛋白酶被美国 FDA鉴定为GRAS级，在其补充说明中强调，"地衣芽孢杆菌是一种被普遍认知 的多种食品中存在的常见微生物，没有任何有关食品存在此种微生物与任何毒 性或致病性相关的报道"。1989年，丹麦卫生部在世界上首次给予基因重组地衣 芽孢杆菌菌株工业应用的生产许可和环境认证并宣布重组地衣芽孢杆菌菌株满 足"优良工业性大规模生产(Good Industrial Large Scale Production organisms, GILSPorganisms)"生物体的所有要求。1988年，美国国立卫生研究院(NIH) 在其《重组DNA分子研究准则》中部分豁免了有关地衣芽孢杆菌宿主/载体系 统有关限制，让地衣芽孢杆菌生物安全地位与枯草芽孢杆菌相似。1991年，NIH 修补了其1988年发布的《重组DNA分子研究准则》，引入了与GILSP标准相 同的GLSP (GoodLarge-Scale Practice,优良大规模实践)标准，用于指导和规 范研究与生产中的重组微生物的大规模培养。1987年起，多个重组地衣芽孢杆 菌得到美国环保署的生产许可。1988年，日本国际贸易与工业厅也批准了重组 地衣芽孢杆菌的生产许可。
2004年，国际上两个独立研究小组几乎同时报道了有关地衣芽孢杆菌模式 菌株ATCC14580 (DSM13)基因组研究工作，以Veith等(Veith B, d a/. J Mol Biotechnol, 2004)的研究小组的研究结果更为准确。地衣芽孢杆菌DSM13基 因组特征为单一环状染色体，大小为4,222,748 bp( ATCC14580大小为4,222,336 bp)， G+C含量为46.2%，含有4286个开放阅读框，72个tRNA基因，7个rRNA 操纵子和20个转座酶基因。与枯草芽孢杆菌基因组极具相同之处，有80%的编 码序列与枯草芽孢杆菌相似，但无论在基因组序列还是功能水平上皆含有与枯 草芽孢杆菌完全不同的插入区域。地衣芽孢杆菌DSM13含有非常保守的蛋白分 泌系统，没有聚酮体合成体系，但能形成脂肽性地衣素。该基因组中也显示了 乙醛酸途径和厌氧核糖核酸还原酶的存在，解释了地衣芽孢杆菌能够利用乙酸 和2,3 丁二醇生长并能厌氧代谢葡萄糖的生理特征。
与枯草芽孢杆菌相似，地衣芽孢杆菌DSM13 (Veith B, d a/. J Mol Biotechnol, 2004)包含有五种蛋白质分泌途径Sec型分泌途径、Tat分泌途径、 ABC转运途径、Com分泌途径和穿膜途径。Sec途径中，先导蛋白翻译后，其 分泌过程能被CsaA或SRP (信号肽识别颗粒)识别，维持合适的结构以刺激SecA蛋白到下一个蛋白。在转运后的短时间内，先导蛋白由信号肽I型酶酶切 加工并折叠成成熟蛋白后释放到培养基中。Tat分泌途径的组成成分有TatAD, TatCD， TatAY， TatCY，支持先导蛋白的转运。在转运后，先导蛋白由信号肽I型 或II型酶酶切加工，折叠的成熟蛋白释放到培养基中。通过不依赖于Sec的途 径来转运后，脂蛋白的先导蛋白被Lgt脂修饰并由脂蛋白信号肽酶LspA(SPase II) 酶切。纤毛蛋白共转录过程中的酶切和氨基端甲基化都依赖于ComC，纤毛蛋白 包括ComGA、 ComEC、 ComGF、 ComFA、 ComEA、 ComGG、 ComGC、 ComGD 和ComGE,其帮助先导蛋白的转运。转运后先导蛋白的信号肽被ComC剪切， 而先导蛋白在膜的胞内侧被甲基化修饰并且由类似ComC的信号肽酶剪切。 ABC转运蛋白的推测分泌途径如下先导蛋白通过NBD结合到质膜。在被ATP 酶如EscA/B或CydD/C剪切后，随着胞膜成分的加工，蛋白分泌出膜外并释放 至培养基中。许多不带有信号肽的胞外蛋白在其先导蛋白有跨膜区，它能引导 蛋白分泌到胞外或他们整个拓扑结构在膜外。
地衣芽孢杆菌DSM13 (VeithB，"a/. JMolBiotechnol， 2004)的信号肽可 分为五类由I型信号肽酶(SipS/T/W/V)切割的Sec分泌型信号肽，双精氨酸结 构信号肽(Tat信号肽)，由I型信号肽酶(Lip)切割的脂蛋白信号肽，由Com切 割的纤毛(Com)信号肽，以及由EscA/B或CydD/C切割的生物信息素(ABC)信 号肽。
如上所述，地衣芽孢杆菌菌株及其经过传统遗传改良获得的突变株，已经 作为生产菌株在酶制剂工业中使用数十年。这一菌株的最突出性能是其具有极 高分泌蛋白质(酶)的能力，其特定酶蛋白的分泌能力可以达到20 mg/mL以 上(VeithB，efa/. JMolBiotechnol， 2004)。
多篇研究报导显示，从枯草芽孢杆菌等来源的质粒以及从地衣芽孢杆菌若 干分离菌株中来源的天然质粒，可以在地衣芽孢杆菌中进行复制。从地衣芽孢 杆菌中分离获得的质粒也是以RepA为基础，进行滚环复制，并且RepA与枯 草芽孢杆菌来源的高度相似(GuglielmettiS, Plasmid, 2005)。如在枯草芽 孢杆菌中使用的pUB110(Zyprian E, Matzura H. DNA, 1986)、 pHY300PLK (Ishiwa H, Shibahara SH. Jpn J Genet, 1986)、 pDG148(Stragier P, a/. Cell, 1988) 等都可以在地衣芽孢杆菌中较稳定的维持。故，以这类质粒为基础，构建许多 枯草芽孢杆菌表达载体原则上皆可以用于地衣芽孢杆菌的遗传操作。
第一篇突出标注为专用于地衣芽孢杆菌的整合型载体见于1998年的报导 (Tran LS， W a/. Microbiology, 1998)。在该报导中，所构建的载体pTLH包含有 无启动子的大肠杆菌lacZ基因、pBR322复制原点、卡那霉素抗性选择性标记， 以及杆菌肽合成酶操纵子的第一个基因的内侧部分序列用于对地衣芽孢杆菌的 染色体整合。特异性整合发生后，重组菌因不能合成杆菌肽，则在藤黄微球菌指示平板上不出现抑菌圈。
地衣芽孢杆菌碱性磷酸酶I编码基因的启动子较早被鉴定为一超强诱导型 启动子，并受磷浓度的严谨调控。另一个调控青霉素酶表达的启动子也被鉴定， 可以用作引导外源基因的表达。我们以地衣芽孢杆菌oc-淀粉酶基因及其上下游 序列为基础，成功构建与初步应用了新型分泌表达系统(Niu & Wang. J Ind Microbiol Biotechnol， 2007,34:357-362;王正祥牛丹丹。中国发明专利ZL 200510081648.7)。其它一些来源于枯草芽孢杆菌的启动子和信号肽序列也可以 试用于地衣芽孢杆菌的表达载体的构建。
目的基因拷贝数提高可以有效提高目的基因产物在地衣芽孢杆菌中的表达 水平。如，提高碱性蛋白酶编码基因的拷贝数，碱性蛋白酶提高65% (Tang" a/. Biotechnol Lett, 2004);角蛋白酶水平在其编码基因拷贝数提高3~5倍时， 产酶水平提高了 4~6倍(Wang " a/. Biotechnol Bioeng， 2004)。
另一方面，地衣芽孢杆菌菌株改良也有利于目的分泌蛋白水平的提高。地 衣芽孢杆菌芽孢形成所必需基因Wo/Z4C突变，则其产角蛋白酶水平不变，有 利于工业生产目的(Wang da/.JAppl Microbiol ， 2005)。芽孢形成缺陷突变株 不影响其DNA酶、RNA酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、蛋白酶和木聚糖酶水平， 但葡聚糖内切酶、羧甲基纤维素酶活力有所降低，而延长发酵时间至72h， oc-淀粉酶水平降低30%。提示芽孢形成缺陷突变株的不同基因的突变，对不同目 的基因的表达的影响会不同(Fleming""/. Appl Environ Microbiol, 1995)。提高 突变Wf操纵子改变地衣芽孢杆菌细胞壁结构，异源环糊精糖基转移酶分泌水 平提高1.5~7倍(Craynest" aZ. Lett Appl Microbiol, 2003 )。
对地衣芽孢杆菌所分泌的酶蛋白编码基因(ceM， c/z"和a^y丄)进行删除， 再通过多拷贝游离质粒载体表达异源淀粉酶基因。研究发现，突变株表达异源 淀粉酶的水平明显提高；同时还发现，细胞自身表达的蛋白酶活力也显著提高 (Waldeck a/. J Biotechnol. 2007 )。
综上所述，地衣芽孢杆菌作为重组蛋白的表达宿主细胞具有很多优势，有 可能作为重组蛋白，特别是工业酶制剂的重要生产宿主细胞。上述研究也暗示， 特定地衣芽孢杆菌菌株的蛋白质分泌能力可能存在一个分泌容量极限。换句话 说，不同地衣芽孢杆菌菌株的蛋白质分泌能力是有差异的。这就提示我们，选 育出一种具有良好实现大规模发酵生产性能并具有理想蛋白合成与分泌能力的 地衣芽孢杆菌是可以实现的，在此基础上完成相关遗传操作获得高效分泌重组 蛋白的重组菌，将对工业酶制剂的发酵制造成本的降低、发酵制造工艺的简化 以及发酵工业环境压力的降低作出重要贡献。
发明内容
本发明的目的是获得一种具有良好实现大规模发酵生产性能并具有理想蛋白合成与分泌能力的、用于重组蛋白，特别是工业酶制剂的高效分泌表达的宿 主细胞。在此基础上完成相关遗传操作获得高效分泌重组蛋白，特别是工业酶 制剂的重组菌，由此可降低工业酶制剂的发酵制造成本、简化发酵制造工艺以 及降低发酵工业环境压力。
本发明提供了应用于工业酶制剂高效分泌合成的地衣芽孢杆菌菌株
CBB3008。运用此菌株可以高效分泌表达多种重要的工业酶制剂，表达水平可 以达到15~30mg/mL。
本发明的技术方案 一种宿主细胞，其分类命名为地衣芽孢杆菌^""7/船 //c/zew/om^ r — nT， CBB3008，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCCNO: M208236。
该宿主细胞，是一种高效、分泌合成工业酶制剂的地衣芽孢杆菌宿主细胞， 革兰氏阳性杆菌，不形成芽孢，不形成色素；能够利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、 木糖、甘油、乙醇、乙酸、淀粉、纤维素在20 50。C、 pH5.5 7.8下生长；无内 生质粒；其DNA限制性修饰系统编码基因簇被删除，遗传转化方便实现；引 导工业酶制剂的高效分泌表达，表达水平达到15~30mg/mL。
所述的宿主细胞，最适生长温度42~45°C，最适生长pH6.8 7.2。
用所述的宿主细胞进行重组蛋白高效分泌表达的方法，在于通过基因克隆 技术获得工业酶制剂的表达质粒，并在所述宿主细胞中实现高效分泌表达；在 所述宿主细胞中高效合成工业酶制剂，再通过所处宿主细胞的蛋白分泌系统， 将合成的酶蛋白高效分泌到培养基中；
1、 细菌培养分离与鉴定
自然样本从中国境内采集，共3050份。样本用0.9n/。NaCl溶液适度稀释， 取适量，涂布LB培养基(0.5%酵母膏，1 %蛋白胨，0.5 % NaCl， pH7.2)后， 42t:培养l 5天。单菌落在LB培养基上划线分离获得纯培养物。再按标准方 法进行分子鉴定(陈源源等。食品与发酵工业，2007，33(5):29-31)。必要时在培 养基中添加0.0:1. mg / mL四环素或0.005 mg / mL 一那霉素。
地衣芽孢杆菌质粒提取、芽孢形成、遗传转化试验、碳源利用试验、生长 曲线、色素形成等按文献方法进行(诸葛键王正祥。工业微生物实验技术手册， 中国轻工业出版社，1996)。
用于对照的地衣芽孢杆菌工业菌株为地衣芽孢杆菌CICIMB2004 (王正祥等。 应用与环境生物学报，2007, 13(2):253-256)或CICIMB0204 (牛丹丹等。微生物 学报，2006, 46(4) :576-580)
2、 基因克隆与表达质粒的构建
分子克隆的常规操作(质粒提取、DNA限制性酶切、体外重组、DNA测序 等)按文献方 去进《亍(Sambrook等。Molecular Cloning: A Laboratory Manual,1989)。
表达质粒的构建使用表达载体pHY-WZX或pBL-WZX(王正样，牛丹丹。中 国发明专利，z。005100W648; Niu& Wang. JInd Microbiol Biotedinol, 2007)。 表达测试用基因为高^xx-淀粉酶编码基因"my"牛丹丹等。微生物学报，2006, 46(4) :576-580)，甘露聚糖酶编码基因w""^ (王正祥等。应用与环境生物学学 报，2007, 13(2):253-256)，植酸酶编码基因A^p/^iV (王正祥等。中国发明专利， z圆6聽8936)。
上述基因经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，克隆入表达载 体pHY-WZX的￡coRI、 或位点，获得相应的表达质粒pHY-amyL,
pHY-manA或pHY-phyN。
3、 地衣芽孢杆菌染色体DNA的提取
地衣芽孢杆菌染色体DNA提取方法按文献进行(诸葛键王正祥。工业微 生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994)。
4、 地衣芽孢杆菌质粒DNA的提取
按文献介绍的方法改进(诸葛键王正祥。工业微生物实验技术手册，中国 轻工业出版社，1994)。细胞裂解后使用Qiagen公司的细菌基因组DNA纯化 试剂盒进行。
5、 基因扩增
DNA扩增在0.5 mLPCR薄壁管中进行。PCR扩增混合物按以下顺序分别 加入(单位^iL)。
超纯水 18 10xPCR缓冲液 2.5 dN丁Ps (2.5 mol/L) 2.5 引物1 (25pmoi/(xL) 0.5 引物2(25pmolVL) 0.5 模板DNA 1 DNA聚合酶 0.3 (1U)
PCR扩增条件为:ix(94。C 5min); 35x(94。Cl0s， 56。C60s， 72°C 60 300 s); lx(72。C 10min)。
6、 地衣芽孢杆菌电穿孔转化与重组菌的筛选
接种地衣芽孢杆菌CCTCCNO: M208236于2.5mLLB培养基中，过夜培 养后，转接入50mL生长培养基(含0.65mol/L山梨醇的LB培养基)中，于 37°C培养至OD6oo为0.75-0.85。将菌体在冰水浴中放置10min，于4。C、 10000 r/min离心10分钟收集菌体。用预冷的EP缓冲液(0.65 mol/L山梨醇，0.70 mol/L 甘露醇和10%甘油)反复洗涤细胞4次。将菌体细胞悬浮于约1 mL的预冷EP缓冲液中。取100 pL菌体细胞悬浮液分装于1.5 mL Eppendorf管中。取1 pL 重组质粒pHY-amyL, pHY-manA或pHY-phyN的DNA (50 ng/|iL)，与菌体细 胞混匀，移入预冷的电转化池，电击(1600v, 5ms)后，加入lmL复苏培养基 (含0.65 mol/L山梨醇和0.45 mol/L甘露醇的LB培养基)，37。C、 160 r/min 培养3h，然后涂布含卡那霉素(0.025 mg/mL)或四环素(0.05mg/mL)的 LB平板，于37。C培养2 3天。转化子通过测定酶活进行确认。
7、 合成的酶蛋白的高效分泌
发酵试验在250 mL三角瓶中装30mL发酵培养基(酵母膏0.5 1.5 %，蛋 白胨1.2~3.6%，葡萄糖8~20%; pH7.0)，接种重组菌，42°C、 220 r/min下培 养5 7天。发酵试验进一步在15L全自动发酵罐(B. Brawn，瑞士)中进行， 工作发酵体积10 L，过程中维持溶氧为20%以上，并用硫酸或氨水控制为pH 7.0。 定时取样分析。
8、 酶活测定高温oc-淀粉酶、植酸酶分别按国家行业标准QB/T2306-97和 GB/T 18634-2002进行。甘露聚糖酶按文献进行(王正祥等。应用与环境生物学 学报，2007, 13(2):253画256)。
9、 其它分析方法
蛋白含量按文献方法进行(Bradford。 Anal Chem， 1976)，葡萄糖含量用酶 电极法测定(山东)，细胞密度用分光光度计(UV-2000，美国)在600nm下测 定。蛋白电泳按文献方法进行(诸葛键王正祥。工业微生物实验技术手册，中 国轻工业出版社，1994)。细胞形态用德国蔡氏显微镜观察。
本发明的有益效果
1、 本发明的重组蛋白表达宿主细胞为地衣芽孢杆菌，能够通过分子克隆等 技术获得相应工业酶生产的重组菌，实现工业酶制剂的高效、分泌表达，表达 不同工业酶制剂的水平可以达到15 30 mg/mL。本发明有助于降低工业酶制剂 的发酵制造成本、简化发酵制造工艺以及降低发酵工业环境压力。
2、 本发明的重组蛋白为工业酶制剂，进一步为淀粉和纤维素水解酶，进一 步为大宗工业酶制剂，如a-淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、植酸酶、果胶酶 等，但不局限于上述酶制剂。
3、 本发明的获得优良的地衣芽孢杆菌宿主细胞的选育方法，经过适当修饰 后，也可以用于其它类型的宿主细胞，特别是枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、 短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等宿主细胞的选育。
生物材料样品保藏
一种宿主细胞，其分类命名为地衣芽孢杆菌5"c/〃us //c/2em/ow^ r—m—， CBB3008，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期2008 年ll月25日，保藏编号CCTCCNO: M208236。
图1.宿主细胞选育路线图
图2.宿主细胞的菌落形态和显微形态 图3.限制性修饰系统基因突变盒的构建
图4.限制性修饰系统突变盒的构建图谱。A1: RM2-1 PCR产物；A2:RM2-2 PCR产物；Bl:以pUC-RM2'模板用引物RPl (SEQIDNO: 1)和RP4 (SEQ ID NO: 4)扩增的PCR产物；B2: pUC-RM2'的/^'"dl11酶切图谱；Cl: pUC-RM2' ::KmR的//z'"dl11酶切图谱。
图5.限制性修饰系统突变株的鉴定。1:以CBB3008染色体DNA为模板 用引物PR7 (SEQIDN07)和PR8 (SEQIDN08)扩增出的PCR产物。
图6.重组菌高温a-淀粉酶发酵时间曲线。CBB3008 (o&*)， CBB3008 (pHY-amyL)(A&A)禾卩B0204(O&令)在37°C、 220 r/min下于发酵培养基中发酵 120 h。空心符号代表菌体生长；实心符号代表高温a-淀粉酶酶活。
图7.重组菌分泌表达a-淀粉酶的蛋白电泳图谱
具体实施例方式
实施例l:地衣芽孢杆菌宿主细胞的筛选 地衣芽孢杆菌宿主细胞选育过程如下图所示(附图1)。
从中国境内采集的3050份自然样本中分离获得526株地衣芽孢杆菌，并以 地衣芽孢杆菌ATCC14580和CICIMB0204为对照，进行筛选。将所有收集到的 地衣芽孢杆菌菌株点种添加4%葡萄糖的LB培养基，于45'C培养72h，观察菌 落色泽及菌落周围色素形成状况，用染色确定地衣素和聚谷氨酸形成情况。24 株地衣芽孢杆菌被选择出，用于下一步试验。将24株菌株分别点种0.01mg/mL 四环素或0.005mg/mL卡那霉素的抗性平板，37'C培养24h后，确定其中的18 株为抗生素敏感。对其可能存在的自身质粒进行了提取与鉴定，18株抗生素敏 感菌株皆不含天然质粒。进一步将所获得的18株菌株在含2%葡萄糖的LB葡萄 糖中于45'C和220 r/min下培养72 h，观察各个菌株的芽孢形成与菌体凝聚情况。 以72h内芽孢形成率小于5。/。，菌体细胞分散性良好为指标，3株地衣芽孢杆菌 菌株被选出用于下一步试验。将获得的3株候选菌株在含高浓度葡萄糖或可溶 性淀粉的培养基中于45。C培养24 h。菌株3008和2016菌株的生长优于0317。 进一步考察3008和2016菌株在贫瘠营养培养基中的生长情况及其蛋白分泌情 况。3008菌株在贫瘠营养培养基中的生长速度与2016相似，但其分泌蛋白的合 成能力优于2016。至此，我们获得了可能作为优秀宿主细胞的地衣芽孢杆菌3008 菌株，以此用于后续研究中。
3008的主要生物学特征汇总于表1。能够利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、 甘油、乙醇、乙酸、淀粉、纤维素生长；在20~50°C下生长，最适生长温度42 45°C，在pH5.5 7.8下生长，最适生长pH6.8 7.2。 3008的菌落形态与菌体形态见图2。
表1. 3008的主要生物学特征
特征 结果
运动性阳性
触酶阳性
胞浆脂质体阴性
拧檬酸利用阳性
厌氧生长生长
V.P试验阳性
5(TC生长生长
60。C生长不生长
7% NaCl下生长生长
利用葡萄糖产酸产气产酸不产气
丙酸利用试验阳性
硝酸盐还原试验阳性
酪蛋白水解试验阳性
淀粉水解试验阳性
芽孢形成不形成
色素形成不形成
聚谷氨酸不形成
聚蔗糖形成
内生质粒无
遗传转化可实现
图2的左图为菌落形态，右图为放大400倍下的细胞形态。 实施例2:限制性修饰系统编码基因簇的克隆与基因删除质粒的构建 分析及"c/2e"z/ow^ ATCC 14580基因组序列，其基因组4157995 bp至 4175263 bp区域约17.3 kb的区域中，存在一个及//c/zem/om^特异性I型DNA 限制性修饰系统编码基因簇(VeithB，"a/. JMolBiotechnol， 2004)。设计如下 步骤对其进行删除(附图3)。
使用引物PR1 (SEQIDNO: 1)和PR2 (SEQIDNO: 2)，用PCR技术从 地衣芽孢杆菌3008染色体DNA中扩增出限制性修饰系统基因簇的上游序列 RM2-1，大小约为560bp，(图4A);同样，使用引物PR3 (SEQIDNO: 3)和 PR4 (SEQIDNO: 4)，用PCR技术从地衣芽孢杆菌3008染色体DNA中扩增 出限制性修饰系统基因簇的下游序列RM2-2，大小约610 bp (图4A)。用///wdlll 和五coRV酶切片段RM2-1以及///wdin和Smal酶切片段RM2-2。将pUC19(Yanisch PC, Vieira J, MessingJ. Improved Ml3 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors.1985, Gene, 33:103-119)用￡coRI和5awHI酶切并用DNA聚合酶进行末端补平，自身环化 后获得pUC19(E-B)。将上述酶切PCR片段克隆入pUC19(E-B)的历"dIII位点， 获得了质粒pUC-RM2'。通过限制性酶切及PCR (引物为PR1 (SEQIDNO: 1) 和PR4 (SEQIDNO: 4))确认获得了正确的重组质粒pUC-RM2'(图4B)。再 使用引物PR5 (SEQIDNO: 5)和PR6 (SEQIDNO: 6)，以质粒pUC-RM2' 为模板，反向PCR获得中间质粒并同步引入顺向重复序列
GATTAATCC-3';再与Km抗性序列连接，获得了重组质粒pUC-RM2'::KmR (图 4C)。
实施例3: DNA限制性修饰系统编码基因簇的删除
将重组质粒pUC-RM2'::KmK在重组菌Ec(met)(王正祥，牛丹丹。中国发明 专利，
发明者牛丹丹, 王正祥, 石贵阳 申请人:江南大学