蛋白、dna分子、含有该dna的转化宿主及该转化宿主用于生产l-缬氨酸的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及蛋白、编码该蛋白的DNA分子、含有该DNA分子的转化宿主机该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法。通过将辅助因子为NADH的亮氨酸脱氢酶的编码基因leuDH（核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示）转化导入棒杆菌中，获得胞内氧化还原平衡改变的基因工程菌，培养该菌株能够用于生产L-缬氨酸，极显著提高了L-缬氨酸的产量。
【专利说明】蛋白、DNA分子、含有该DNA的转化宿主及该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及蛋白、编码该蛋白的DNA分子、含有该DNA分子的转化宿主机该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法。
【背景技术】
[0002]L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L- a -氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2,相对分子质量为117.1 5。呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度:25V为88.5g/L，50°C为96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙醚，丙酮。等电点为5.96，熔点315°C。L-缬氨酸(L-Val)是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。医药工业中，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。如缺乏可引起神经障碍、停止发育、体重下降、贫血等。食品工业中，可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。米制糕饼中添加缬氨酸(lg/kg)，产品有芝麻香，用于面包亦能改善风味。L-缬氨酸也可用作氨基酸能量饮料与运动员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。饲料工业中，对动物的乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用。将其用于雏鸡饲料中，可提高雏鸡对鸡新城疫病毒的免疫能力。而且L-缬氨酸是动物饲料中的一种限制性氨基酸，所以L-缬氨酸可作为饲料添加剂改善动物日粮中氨基酸含量的不足。
[0003]L-缬氨酸的生产方法有三种:提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。通过菌株的选育，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累L-缬氨酸的目的，是微生物发酵法工业应用最为广泛的手段。
[0004]棒杆菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)和黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)。然而,现有的菌株发酵生产L-缴氨酸的产量较低,无法满足市场需求。
[0005]为了改善微生物的L-缬氨酸生产能力，可以通过传统诱变和代谢工程等方法对生产菌株进行不断地改造。传统诱变育种，是指通过对特定出发菌株进行物理、化学或二者合并地诱变处理，再选育出营养缺陷型和/或氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制或阻遏作用，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。代谢工程育种，就是在对代谢网络系统分析的基础上采用基因工程技术改造细胞代谢系统以提高产物得率或改进细胞性能。主要包括如下手段:对原有代谢途径的改造、新代谢途径的构建、组学规模的代谢关键途径或靶点的识别。通过理性的代谢工程构建氨基酸生产菌株，正逐渐成为氨基酸育种的主要策略。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明提供一种蛋白、编码该蛋白的DNA分子、含有该DNA分子的转化宿主机该转化宿主用于生产L-缬氨酸的方法。通过将辅助因子为NADH的亮氨酸脱氢酶的编码基因IeuDH转化导入棒杆菌中，获得胞内氧化还原平衡改变的基因工程菌，培养该菌株能够用于生产L-缬氨酸，极显著提高了 L-缬氨酸的产量。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0008]本发明提供了一种具有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物。
[0009]缬氨酸的合成代谢途径，是从二分子的丙酮酸开始，经过乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮基异戊酸等三个中间产物，最终形成缬氨酸。而这些中间代谢产物分别通过乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶的催化活性而产生的，如图1所示。
[0010]乙酰羟酸合成酶(AHAS)是L-缬氨酸合成途径上的第一个共用酶也是关键酶，催化2分子丙酮酸脱羧合成I分子乙酰乳酸，即缬氨酸的前体。AHAS受三种支链氨基酸中的任何一种反馈抑制。
[0011]二羟酸还原异构酶(AHAIR)是L-缬氨酸合成途径上的第二个酶，为一四聚体酶，由大小为53kDa的同种亚基组成，催化乙酰乳酸生成2，3-二羟基异戊酸。反应包括烷基的异构和还原；发生该反应还需要Mg2+(激活剂)和NADPH (氢供体)。
[0012]二羟酸脱水酶(DHAD)是L-缬氨酸合成途径上的第三个酶，是由两个亚基组成的二聚体酶，可催化2，3- 二羟基异戊酸生成2-酮基异戊酸。
[0013]转氨酶(TA) B是缬氨酸`合成过程中的最后一个酶。转氨酶B、转氨酶C和芳香转氨酶(基因分别为ilvE、avtA和tyrB)在支链氨基酸的合成中都具有催化活性，但主要由转氨酶B催化三种支链氨基酸合成的最后一步反应。
[0014]亮氛酸脱氧酶(LeucineDehydrogenase, LDH, ECl.4.1.9)是一种 NAD+依赖型的氧化还原酶，它可逆地催化L-亮氨酸和一些支链L-氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物，如下所示:
[0015]
【权利要求】
1.一种具有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物。
2.根据权利要求1所述的功能等价物通过在SEQID N0.1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基获得。
3.根据权利要求1或2所述的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物用于催化2-酮基异戊酸生成缬氨酸的应用。
4.编码如权利要求1或2所述的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
6.编码如权利要求1或2所述的亮氨酸脱氢酶或其功能等价物的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列与SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列的同源性大于95%以上。
7.具有如权利要求5或6任一项所述的DNA分子的载体。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于，其为pMX119。
9.具有如权利要求5或6任一项所述的DNA分子的转化宿主。
10.根据权利要求9所述的转化宿主，其特征在于，如权利要求5或6任一项所述的DNA分子通过电击转化法导入。
11.根据权利要求9所述的转化宿主，其特征在于，如权利要求5或6任一项所述的DNA分子表达增强。
12.根据权利要求11所述的转化宿主，其特征在于，所述表达增强的方式为如权利要求5或6任一项所述的DNA分子 至于强启动子的控制之下或增加如权利要求5或6任一项所述的DNA分子的拷贝数。
13.根据权利要求9所述的转化宿主，其特征在于，其为棒杆菌或短杆菌。
14.根据权利要求9所述的转化宿主，其特征在于，其保藏编号为CGMCCN0.7041。
15.根据权利要求9至14任一项所述的转化宿主用于发酵生产L-缬氨酸的用途。
16.—种如权利要求9至14任一项所述的棒杆菌发酵生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，取所述转化宿主在种子培养基中扩繁后，置于发酵培养基中于28°C~37°C培养50~120h,即得。
【文档编号】C12P13/08GK103642766SQ201310275401
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】朱亚然, 胡炎华, 宫卫波 申请人:廊坊梅花生物技术开发有限公司